一種利用lrk1基因轉化提高水稻秈粳雜種育性的方法
【專利摘要】本發明屬于轉基因【技術領域】，涉及一種利用LRK1基因轉化提高水稻秈粳雜種育性的方法；該方法利用基因槍微彈轟擊法，將水稻LRK1基因轉化秈稻愈傷組織，經過恢復培養獲得表達LRK1基因的水稻植株。實驗結果顯示，所述的LRK1基因能成功轉化水稻與粳稻品種日本晴、秋光等分別雜交，其F1代結實率分別大幅度高于對照，達到經常品種的結實率水平。本發明的水稻LRK1基因及其同源基因轉化水稻，使其具有廣親和性，能克服秈粳雜交不育特性。本發明為水稻秈粳亞種間雜種優勢的利用提供了一種低成本、高效益的新方法。
【專利說明】—種利用LRK1基因轉化提高水稻秈粳雜種育性的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于轉基因【技術領域】，涉及提高水稻秈粳雜種育性的方法，尤其是一種利用LRKl基因轉化提高水稻秈粳雜種育性的方法。
【背景技術】
[0002]近來年，水稻亞種間雜種不育性的原因已有眾多報道，對其不育性的遺傳機理也有所探討；研究表明，亞種間雜種不育的原因是多方面的，其中，有的組合中雜種不育是由花粉敗育引起的，另有一些組合中又表現為帶某一特定等位基因的雌配子部分敗育，而更多的組合中是既有雌配 子敗育又有雄配子體敗育。現有技術中有大量實驗證明，秈、粳雜種的不育性不僅僅由單個基因控制，而是由多個不育基因所控制。
[0003]Ikehashi等系統研究了 74種不同生態型水稻品種種間雜種F1的育性情況，結果顯示，一些品種無論與秈型品種或是與粳型品種雜交，其F1均能產生很高的育性，從而提出了廣親和(wide-compatibility)品種的概念，隨后鑒定了一些廣親和基因,最典型廣親和基因是克服不育位點S-5相應的S5n。研究還顯示，在發現雌配子敗育位點時，相應位置上都找到了中性的復等位基因，即廣親和基因；上述廣親和性基因僅僅對等位的不育位點起作用，對非等位的不育位點不起作用，或作用但起不到可以替代的作用。有的研究者把雌性不育基因稱為“廣親和基因”，其主要觀點為雜種不育性主要表現為雌配子不育，秈稻和粳稻品種在某個座位上等位基因分化為相對的Si和Sj，廣親和品種在該座位為Sn，等位基因在純合時產生可育性，當等位基因是SiSj雜合時產生不育性，而等位基因是SnSi或SnSj時均可育，因此，廣親和基因概念是相對于雌配子敗育位點的。
[0004]張桂權等把雄性不育基因座位稱為“特異親和基因”，其主要觀點為雜種不育性主要表現為花粉不育；在單個座位上等位基因分化為相對的Si和Sj，不同材料的Si和Sj具有不同的分化度；雜種的育性取決于雜合座位的數目和等位基因的分化距離；等位基因在雜合時可產生不育性而在純合時又可產生可育性。
[0005]上述“特異親和基因”和“廣親和基因”在解釋雜種不育性遺傳的理論依據雖不同，但本質上最終都屬于多基因座位控制的，都符合單座位孢子體一配子體互作遺傳模式。從細胞水平上說，導致秈粳雜種不育的原因除了雄配子敗育及雌配子敗育以外，還有花粉在柱頭上萌發障礙、配子發育受阻、胚乳發育受阻或不正常、花藥不開裂、胚胎發育不良和雌雄異熟等；此外，環境條件對其也有很大的影響，上述因素均涉及復雜的分子遺傳機理。
[0006]因為秈粳雜種不育機理的復雜性，目前只成功分離克隆了廣親和性狀基因S5n ;但S5n基因只能解決由不育位點S-5引起的不育性，并不能克服由其他不育位點引起的不育性，因此，還需繼續挖掘克隆其他的廣親和基因和特異親和基因，只有將多個雌配子親和基因與雄配子親和基因聚合于同一親本，選育聚合多個親和基因座位的多個廣譜親和性親本品種，使上述親本與各種粳稻或秈稻品種雜交均具有親和性，既可消除雄配子體敗育現象，又可消除雌配子敗育現象，進一步提高結實率及對環境條件的適應性，有助于解決秈粳亞種間雜種不育性問題，真正實現直接利用秈粳亞種間雜種優勢。[0007]有報道披露，以栽培水稻與江西東鄉野生稻雜交與回交構建的基因系為材料，通過染色體定位與基因組序列分析分離克隆了來自東鄉野生稻基因組的一組編碼跨膜受體蛋白LRK的基因，共有8個首尾相連簇集排列的家族成員，分別命名為LRKl，LRK2，LRK3，LRK4, LRK5, LRK6, LRK7和LRK8。在有些秈稻品種中只含有7個LRK基因，缺少LRKl基因；粳稻中，LRK2，LRK3和LRK5基因不表達；秈稻中，缺少LRKl基因，LRK3和LRK5基因不表達。
[0008]上述基因簇位于水稻2號染色體的端部，其DNA序列已經登錄在國際基因組數據庫NCBI，克隆編號為AY756174和DQ195081。經水稻苗期分子檢測證實，在粳稻日本晴的8個LRK基因中，有5個基因表達，分別為LRK1，LRK4，LRK6，LRK7和LRK8。在秈稻9311 (超級雜交稻親本之一)中，也有5個LRK基因表達，分別為LRK2，LRK4，LRK6，LRK7和LRK8。
[0009]訖今為止，尚未見有利用該組LRK基因提高水稻秈粳雜種育性方面的報道。

【發明內容】

[0010]本發明的目的是提供一種提高水稻秈粳雜種育性的方法，具體涉及一種利用LRKl基因轉化提高水稻秈粳雜種育性的方法；所述方法利用LRKl基因及其同源基因的載體轉化水稻品種，用以克服水稻秈粳雜交不育性。本發明的實施例中，將LRKl基因的過表達載體轉化秈稻品種9311，使秈稻9311與粳稻日本晴、秋光等雜交種的育性大幅度提高。
[0011]本發明所述的LRKl基因的蛋白氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
[0012]本發明中，所述水稻LRKl基因為氨基酸序列如SEQ ID N02的蛋白，還包括具有與水稻LRKl蛋白相同功能的、SEQ ID N0.2序列的變異形式；上述變異形式包括(但并不限于):若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更·佳地為5個以內)氨基酸；例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能；又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能；其還包括水稻LRKl蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0013]本發明中，所述的水稻LRKl基因的核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
[0014]本發明中，所述水稻LRKl基因的核苷酸序列包括編碼具有水稻LRKl蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1中32-3181位核苷酸序列及其簡并序列；該簡并序列是指，位于SEQ IDN0.1序列的編碼框32-3181位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列；由于密碼子的簡并性，因此與SEQ ID N0.1中32-3181位核苷酸序列同源性低至約70%的簡并序列也能編碼出SEQ ID N0.2所述的序列；其還包括能在中度嚴緊條件下，更佳地在高度嚴緊條件下，與SEQ ID N0.1中從核苷酸32-3181位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；或包括與SEQ ID N0.1中從核苷酸32-3181位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80%，更佳地至少90%的核苷酸序列。
[0015]本發明提供了利用LRKl基因轉化提高水稻秈粳雜種育性的方法，其特征在于，其包括步驟:
[0016](I)將LRKl基因編碼序列插入植物表達載體構建重組表達載體；
[0017](2)誘導處理水稻愈傷組織；
[0018](3)用步驟(1)所得的重組表達載體轉化水稻愈傷組織；[0019](4)恢復培養步驟(3)所得的水稻愈傷組織。
[0020]本發明方法中，步驟(1)中植物表達載體可為常規的水稻表達載體；構建重組序列的方法參考《分子克隆》的標準方法，例如，將LRKl基因編碼序列克隆到植物表達載體的多克隆位點；
[0021]所述的植物表達載體可為已經市售或者文獻報道過的植物表達載體，例如PCAMBIA1304 等。 [0022]本發明方法中，步驟(3)中采用基因槍微彈轟擊法實現重組表達載體轉化水稻愈傷組織，除此以外，還可參用其他常規的基因轉化方法；
[0023]本發明方法中，步驟(4)中恢復培養水稻愈傷組織是先在不含篩選劑的誘導培養基上生長，然后再在含有篩選劑的培養基上篩選，并將篩選后的愈傷組織光照培養；所述的篩選劑是潮霉素。
[0024]本發明方法中，所述步驟(4)中在進行篩選時，可采用篩選劑濃度逐步提高的方法，也可配合光照條件進行(例如在本發明的一個實施例中，采用下述含有30mg/和50mg/L潮霉素的篩選培養基、同時配合暗培養約兩周進行篩選)；篩選完成后，所得含有LRKl基因的愈傷組織，可將篩選后存活的愈傷于分化培養基上光照培養，待分化出小植株后，再轉入生根壯苗培養基，長大后移入溫室。
[0025]本發明的用LRKl基因轉化提高水稻秈粳雜交育性的方法，采用基因槍微彈轟擊法，將水稻LRKl基因轉化水稻愈傷組織，經過恢復培養獲得表達LRKl基因的水稻植株；實驗結果顯示，成功轉化的水稻與粳稻品種日本晴、秋光等分別雜交，其F1代結實率分別大幅度高于對照，達到經常品種的結實率水平。
[0026]另一方面，本發明提供了轉水稻LRKl基因在提高水稻秈粳雜種育性方面的新的應用。
[0027]本發明中，用序列如SEQ ID N02所示的水稻LRKl基因及其同源基因轉化水稻，使其具有廣親和性，能克服秈粳雜交不育特性。本發明為水稻秈粳亞種間雜種優勢的利用提供了一種低成本、高效益的新方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為含LRKl基因的表達載體結構圖，其中，LRKl基因插入表達載體的位置有箭頭標示。
[0029]圖2為轉LRKl基因9311、對照9311株型的比較。
[0030]圖3為轉LRKl基因9311、對照9311分別與日本晴雜種F1的育性比較。
[0031]圖4為轉LRKl基因9311、對照9311分別與日本晴雜種F1的結實率比較。
[0032]圖5為轉LRKl基因9311、對照9311分別與秋光雜種F1的育性比較。
[0033]圖6為轉LRKl基因9311、對照9311分別與秋光雜種F1的結實率比較。
【具體實施方式】
[0034]實施例1LRKl基因的功能驗證
[0035](I)構建LRKl基因表達載體
[0036]采用pCAMBIA1304為表達載體，將東鄉野生稻LRKl基因插入到pCAMBIA1304載體35S組型啟動子下游；含LRKl基因的表達載體結構如圖1所示；
[0037](2) LRKl基因轉化實驗與結果
[0038]采用目前國內超級雜交稻的主要親本之一 9311為轉基因受體；將9311成熟種子去殼消毒后接種在脫分化植物組織培育基上誘導愈傷組織；在愈傷組織誘導2-3周后，采用基因槍微彈轟擊法，將含LRKl基因的純化的pCAMBIA1304質粒DNA導入9311愈傷組織細胞；在添加30ppm潮霉素的MS培養基上連續培養3-4周篩選抗性細胞系，然后將篩選的細胞系轉移到分化培養基誘導長芽和生根；
[0039](3)轉化處理試管苗移載及轉化植株后代的分子檢測
[0040]將LRKl基因轉化處理的9311試管苗移載田間，并在分蘗期取葉片提取DNA采用PCR擴放技術進行分子檢測，于2005年秋獲得陽性Ttl代；2005年冬，在海南島加代繁殖，獲得轉基因T1代，共計7個株系；
[0041](4) LRKl轉基因T4代株系與粳稻雜交F1的育性調查與統計
[0042]將LRKl轉基因T4代株系、對照9311、日本晴及秋光于2009年種于上海，抽穗期間利用轉LRK19311、對照9311分別與日本晴及秋光雜交，雜交種于2010年夏季分別種于上海和濟寧，成熟期考查每個雜交組合的結實率；每個組合調查10株主莖穗的結實率(考種結果如表1所示):
[0043]表1
[0044]
【權利要求】
1.一種利用LRKl基因轉化提高水稻秈粳雜種育性的方法，其特征在于，利用基因槍微彈轟擊法，將水稻LRKl基因轉化水稻愈傷組織，經過恢復培養獲得表達LRKl基因的水稻植株；其包括步驟: (1)將LRKl基因編碼序列插入植物表達載體構建重組表達載體； (2)誘導處理水稻愈傷組織； (3)用步驟(1)所得的重組表達載體轉化水稻愈傷組織； (4)恢復培養步驟(3)所得的水稻愈傷組織。
2.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LRKl基因的蛋白氨基酸序列如SEQID N02所示。
3.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的所述水稻LRKl基因還包括具有與水稻LRKl蛋白相同功能的、SEQ ID N0.2序列的變異形式；所述變異形式包括1_50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或20個以內的氨基酸；以及水稻LRKl蛋白的活性片段和活性衍生物。
4.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的LRKl基因的核苷酸序列如SEQIDNOl所示。
5.按權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的LRKl基因的核苷酸序列還包括編碼具有水稻LRKl蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1中32-3181位核苷酸序列及其簡并序列。
6.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中采用基因槍微彈轟擊法進行重組表達載體轉化水稻愈傷組織。
7.按權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中恢復培養水稻愈傷組織的步驟包括:先在不含篩選劑的誘導培養基上生長，然后再在含有篩選劑的培養基上篩選，并將篩選后的愈傷組織光照培養。
8.按權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的篩選劑為潮霉素。
9.按權利要求7所述的方法，其特征在于，在含有篩選劑的培養基上篩選時，所述篩選劑濃度逐步提高并配合光照條件，將存活的水稻愈傷組織于分化培養基光照培養，分化出小植株后，轉入生根壯苗培養基，直至移入溫室。
10.轉水稻LRKl基因在提高水稻秈粳雜種育性中的應用，其中，所述的LRKl基因的蛋白氨基酸序列如SEQ ID N02所示。
【文檔編號】C07K14/415GK103571869SQ201210255823
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月21日 優先權日:2012年7月21日
【發明者】羅小金, 楊金水, 孫凡 申請人:復旦大學