專利名稱：免疫球蛋白制劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及穩定的濃縮蛋白質或抗體制劑，例如那他珠單抗(natalizumab)制齊U，其中抗體保持活性并且也可以小容量用藥，需要時可以給予不同體重的受治療者。
背景技術：
抗體和蛋白質制劑本領域通曉。然而制備化學和生物學都穩定的蛋白質制劑如抗體制劑卻充滿了挑戰。制備不僅穩定而且甚至隨著蛋白質濃度的增加仍能保持小容量的制劑(即便于小容量注射)，例如抗體，仍屬疑難。確實需要這種制劑。例如在固定的容量中含有濃縮而穩定的蛋白質就特別有益于不同體重的患者。如果給不同體重的患者用液體藥物，那么也許會產生例如相反的作用。開發這類制劑受蛋白質或抗體它們自身的妨礙，而蛋白質和抗體因高度趨向聚集和沉淀，又妨礙了這類制劑的開發。
發明概要因此，盡管從前已有文獻報導，仍然還有必要改進蛋白質和/或抗體的配制方法。同時也需要高濃度抗體或蛋白質的穩定制劑，其中抗體或蛋白質仍保持活性。還需要維持固定容量的濃縮蛋白質的穩定制劑。申請人在此所公開的穩定組合物，可進一步用來制備抗體制劑，特別是高濃度的抗體制劑，當貯藏在建議的溫度時，既不沉淀又穩定。高濃縮和穩定的抗體制劑非常有助于醫師治療不同體重的患者。本發明一方面提供穩定的水性藥物制劑，其包含免疫球蛋白(或其他蛋白)、磷酸鹽緩沖液、聚山梨酯和氯化鈉 。聚山梨酯優選聚山梨酯80，優選含量介于約O. 001 %至約2.0% (w/v)之間。最優選聚山梨酯的含量約為0.02%。在另一個實施方案中，制劑中免疫球蛋白或其他蛋白的含量約O. lmg/ml至約200mg/ml。優選制劑的緩沖pH值約3. O至約7.0，最優選約6. 0±0. 5。優選制劑是等滲的。該制劑還可以包含組氨酸。優選組氨酸為L-組氨酸。本發明的另一方面，上述制劑的免疫球蛋白是抗α-4整聯蛋白抗體，例如那他珠單抗或另一種人源化抗體或單克隆抗體。這種抗體可以是標準量或是濃縮量，例如約15mg/ml或更多。優選那他珠單抗的含量約20mg/ml至約150mg/ml。在這種制劑濃度約為15mg/ml或更多的情況下，該制劑保持固定的容量，例如約為125ml。本發明的另一個目的是提供一種使用治療量的免疫球蛋白治療不同體重患者疾病的方法，所述方法包括給予所述患者上述和在此所描述的制劑，其中所述疾病通過給予所述制劑進行治療。本發明的又一方面，所述疾病是由α-4整聯蛋白介導的病癥，并且在這種疾病中，免疫球蛋白是能識別α -4整聯蛋白并與之結合的蛋白，例如那他珠單抗。本發明的再一方面提供一種包含磷酸鈉、聚山梨酯、蛋白質和NaCl、pH 6.0±0.5的組合物，當該組合物長期貯藏在5°C至8°C的溫度時是穩定的。
本發明的另一方面提供一種制備穩定的含蛋白質制劑的方法，所述方法包括將磷酸鈉、氯化鈉、聚山梨酯和蛋白質混合，并用磷酸調節混合物的pH值至約pH 6. 0±0. 5。蛋白質可以在本發明制劑中被凍干。聚山梨酯優選聚山梨酯80，含量約為O. 02%(w/v)，而蛋白質優選那他珠單抗。該制劑還可包含組氨酸。優選蛋白質在含5mM組氨酸、20mg/ml蔗糖和O. 02%聚山梨酯80、pH 6的溶液中被凍干，而蛋白質是那他珠單抗，濃度為20mg/ml。本發明的另一個目的是提供一種產品，該產品包括容納上述及在此所述的穩定制劑的容器。本發明的另一方面是提供一種治療不同體重患者疾病的方法，所述方法包括同時或序貫給予所述患者治療上聯合有效的上述和在此所述的制劑與治療疾病有效的化合物或療法。本發明的再一方面是提供在此所述的任一穩定制劑在制備用于治療疾病的藥物中的用途，其中所述藥物對于治療所述疾病是有效的。所述藥物還可以包括治療所述疾病的第二種化合物或療法。


圖1 :那它珠單抗的制備示例。
圖2 :制劑裝瓶示例。本發明優選實施方案的詳細描述1.定義 術語“蛋白質”是指包括但不限于免疫球蛋白、酶、受體及其片段。雖然制劑的論述主要涉及的是抗體或免疫球蛋白，但所公開的制劑中其他蛋白質可考慮相互替換。術語“免疫球蛋白”是指包括但不限于抗體和抗體片段(例如scFv、Fab、Fe、F(ab' )2)，以及抗體的其他基因工程部分。根據它們的重鏈恒定區的氨基酸序列，免疫球蛋白可分為不同的類別。免疫球蛋白主要有五類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。其中的一些還可進一步分為亞類(同種型)，例如IgGU IgG2、IgG3和IgG4 ；IgAl和IgA2。對應于不同類別的免疫球蛋白重鏈恒定區分別稱為alpha( a ) ,delta( δ ) ,epsilon ( ε ),gamma( Y )和πιιι(μ)，不同類別的免疫球蛋白的亞基結構和三維構型是眾所周知的。優選，免疫球蛋白識別α-4整聯蛋白并與之相結合。術語“抗體”是廣義上的概念，具體包括單克隆抗體(包括激動劑抗體和拮抗劑抗體)、具有多表位特異性的抗體組合物和抗體片段(例如Fab、F (ab/ ) 2、scFv和Fv)，只要它們具有所需的生物活性即可。“抗體”意指包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體、人抗體、靈長類 抗體和基因工程生產的其他抗體。本文所用的術語“單克隆抗體”是指從基本上均一的抗體群體中所獲得的抗體，SP群體中的各個抗體是相同的，除非可能發生自然突變，其量甚微。單克隆抗體是高度特異性的，只針對單一抗原位點。而且，與常規(多克隆)抗體制劑相反，多克隆抗體通常包含抗不同決定簇(表位)的不同抗體，而每個單克隆抗體只針對抗原上的一個決定簇。除特異性之外，單克隆抗體的優勢還在于能通過哺乳動物細胞表達系統或轉基因技術合成，而不被其他免疫球蛋白污染。例如，所使用的本發明單克隆抗體可在山羊中表達，參見Behboodi等(2002)Transgenic cloned goats and the production of therapeutic proteins.載于 Principles of Cloning. Elsevier Science (USA);和 Meade 等(1999). Expressionof recombinant proteins in the milk of transgenic animals in Gene expressionsystems using nature for the art of expression. J. M. Fernandez和 J. P. HoeffIer編著,Academic Press。修飾詞“單克隆”是指從基本上均一的抗體群體中所獲得的抗體的特征，而不得解釋為需要用任何特殊的方法來生產抗體。例如所使用的本發明單克隆抗體可以通過以下文獻中介紹的方法來生產Shepherd等,Monoclonal Antibodies A PracticalApproach(Oxford University Press,2000)。術語“單克隆抗體”也包括“嵌合”抗體(免疫球蛋白)，在“嵌合”抗體中的重鏈和/或輕鏈部分與源于具體物種或者屬于具體抗體類別或亞類的抗體的相應序列相同或同源，而鏈的其余部分與源于另一物種或者屬于另一抗體類別或亞類的抗體以及這些抗體片段的相應序列相同或同源，只要它們具有所需的生物活性即可。例如，與α-4整聯蛋白結合的能力。“單克隆抗體”也可從噬菌體抗體文庫分離得到，例如采用以下文獻中介紹的技術=Clackson 等，1991 Nature352 :624_628 和 Marks 等，1991 J. Mol. Biol.，222 :581_597。非人(例如鼠、兔、牛、馬、豬等)抗體的“人源化”形式是嵌合的免疫球蛋白，免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗體的其他抗原結合亞序列)，其含有最少量源自非人免疫球蛋白的序列。絕大部分人源化抗體是人免疫球蛋白(受體抗體)，其中的受體的互補決定區(CDR)殘基被非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠或兔子具有的所需特異性、親和性和容量的CDR殘基所取代。在某些情況下，人免疫球蛋白Fv構架殘基被相應的非人殘基所取代。此外，人源化抗體可以包含的殘基既不出現在受體抗體內也不出現在輸入CDR或構架序列中。這些修飾可進一步精修和優化抗體的性能。一般而言，人源化抗體基本上都會包含至少一個可變區、典型為2個可變區，其中全部或幾乎全部CDR區都與非人免疫球蛋白的那些區相對應，并且全 部或幾乎全部的FR區都與人免疫球蛋白共有序列的那些區相對應。人源化抗體最宜至少也包含部分免疫球蛋白恒定區(Fe)，典型是人免疫球蛋白恒定區。通用術語“抗體”也包含“線性抗體”，是一對串聯的Fd區段(VH-CH1-VH-CH1)，形成一對抗原結合區。線性抗體可以是雙特異性或者是單特異性的。“變異抗體”(通用術語“抗體”也涵蓋)是氨基酸序列不同于“親代”抗體的氨基酸序列的分子，這是由于添加、缺失和/或取代了親代抗體序列中的一個或多個氨基酸殘基所致。在優選的實施方案中，變體包括在親代抗體的一個或多個高變區內一個或多個氨基酸的取代。例如，變體可以在親代抗體的一個或多個高變區中至少有一個取代，例如，約I個至約10個，優選約2個至約5個。通常，變體的氨基酸序列與親代抗體重鏈或輕鏈可變區序列的氨基酸序列同一性為至少75%，優選至少80%，更優選至少85%，還更優選至少90%，最優選至少95%。該序列的同一性或同源性在本文定義為候選序列的氨基酸殘基與親代抗體殘基相同的百分率，是在將序列進行比對，必要時引入空位以達到序列同一性的最大百分率后獲得的。無論是N-端、C-端還是內部延伸、缺失、插入抗體序列都不會影響序列的同一性或同源性。為了分析這些性質，人們應當將變體的Fab形式與親代抗體的Fab形式或將變體的全長形式與親代抗體的全長形式進行比較，例如，因為人們已經發現在此所公開的生物活性試驗中，抗體的形態影響它們的活性。特別值得注意的變體抗體是，當與親代抗體比較時，生物活性提高至少約10倍，優選提高至少約20倍，最優選提高至少約50倍。“親代”抗體是由用于制備變體的氨基酸序列編碼的抗體。優選，親代抗體具有人構架區，并且具有人抗體恒定區。例如，親代抗體可以是人源化抗體或是人抗體。“分離的抗體”是指從其天然環境的組分中經過鑒定和分離和/或回收的抗體。天然環境中的污染組分是干擾抗體的診斷或治療用途的物質，可以包括酶、激素和其他蛋白質性或非蛋白質性的溶質。在優選的實施方案中，抗體純化至(I)用Lowry方法測定，按重量計達95%以上抗體，最優選達99%以上抗體；(2)通過轉杯測序列儀足以至少獲得N端或內部氨基酸序列的15個殘基；或(3)在還原或非還原條件下進行SDS-PAGE，用考馬斯亮蘭或優選銀染色達到均一性。由于抗體天然環境中至少一個組分不會出現，因此分離的抗體包括在重組細胞內原位的抗體。然而，分離的抗體的制備通常至少經過一個純化步驟。“抗體片段”包含完整抗體的部分，通常為完整抗體的抗原結合區或可變區。例如，抗體片段的實例包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；和抗體片段所形成的多特異性抗體。“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段包含抗體的VH區和VL區，其中的這些區域以一種多肽鏈存在。一般而言，Fv多肽還包括VH區和VH區間的多肽接頭，使sFv能形成所需的抗原結合結構。術語“雙抗體”是 指具有2個抗原結合位點的小抗體片段，所述片段包含同一多肽鏈(VH-VL)中與輕鏈可變區(VL)相連的重鏈可變區(VH)。采用使同一鏈的兩個區域間因太短而無法配對的接頭，迫使這些區與另一鏈的互補域配對，由此形成兩個抗原結合位點。抗體給藥途徑需符合已知的方法并且是眾所周知的，例如可以包括注射或輸注，通過靜脈內、腹膜內、腦內、肌內、眼內、動脈內或損害內途徑，或者通過持續釋放系統。可以通過輸注或快速濃注連續給予抗體。治療用抗體組合物一般放在有無菌入口處的容器內，例如帶有一個能用皮下注射針頭穿孔的塞子的靜脈溶液袋或小瓶。“藥物可接受的”賦形劑(例如載體、添加劑)是能合理地給主題哺乳動物提供所用活性成分的有效劑量的那些物質。“穩定的”制劑是指貯藏時其中的蛋白質基本上保持其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性的制劑。“穩定的”也是指制劑沒有或基本沒有不穩定的征兆，包括聚集和/或脫酰胺的制劑。例如當本發明所提供的制劑貯藏在5-8°C的溫度時，能保持穩定至少兩年。本領域有測定蛋白質穩定性的多種分析技術,有關綜述例如參見Peptide andProte in Drug Delivery, 247-301 (Vincent Lee 編著，New York, N. Y. , 1991)和 Jones,1993Adv. Drug Delivery Rev. 10 :29_90。用所提供的實例可以舉例說明測定所述制劑在選定溫度下貯藏選定時間的穩定性。穩定制劑的貯藏時間，如果優選至少6個月，則更優選至少12個月，還更優選12-18個月，最優選2年或2年以上。藥物制劑中的蛋白質，如抗體或其片段，如果通過肉眼檢查其顏色和/或澄明度，或用紫外線散射或用大小排阻層析測定沒有顯示聚集、沉淀、脫酰胺和/或變性，則“保持了它的物理穩定性”。如果規定時間的化學穩定性即是蛋白質被認為仍然保持著它的生物活性，那么蛋白質在藥物制劑中就“保持著它的化學穩定性”。化學穩定性可以通過檢測并定量蛋白的化學改變形式進行評價。化學改變可以包括大小變化(例如剪切)，例如，其測定可以通過大小排阻層析、SDS-PAGE和/或襯質輔助激光解吸電離/飛行時間質譜法(MALDI/TOF MS)。其他類型的化學改變包括電荷改變(例如脫酰胺時發生)，例如可通過離子交換層析測定。在藥物制劑制備時，如果在特定時間抗體的生物活性用例如抗原結合試驗測定，所顯示的生物活性約在10%以內(在試驗誤差內)，那么可認為抗體在藥物制劑中“保持著它的生物活性”。“等滲的”是指目標制劑基本上與人的血液的滲透壓相同。等滲制劑的滲透壓通常約為250-350m0sm。例如，等滲性可用蒸氣壓或冰-凍型滲透壓力計測定。本文所用的“緩沖液”是指通過酸 堿共軛組分的作用以防止pH改變的緩沖溶液。本發明緩沖液的PH范圍約3. O至約7. 5 ;優選pH約4. O至約7. O ;更優選pH約5. O至約6. 5 ;最優選pH約為6. O ±0.5。上述范圍間的任一 pH值都在考慮之中。本發明中就藥理學意義而言，抗體的“治療有效量”是指治療上有效的抗體用于預防或治療失調時有效的抗體量。“失調”指用抗體或蛋白質治療有益的任何疾病。這包括慢性和急性的失調或疾病，包括那些哺乳動物易患的上述疾病。“治療”是指治療性治療和預防措施兩者。需要治療者包括已經患上失調的和需要預防失調的。“防腐劑”是一種化合物，例如，該化合物可以含在制劑中用于顯著降低其中的細菌作用，因而有利于生產多用途的制劑。潛在的防腐劑的實例包括十八烷基二甲基芐基氯化銨、六甲氯銨、苯扎氯銨(烷基芐基二甲基氯化銨的混合物，其中烷基是長鏈化合物)以及苯索氯銨。其他類型的防腐劑包括芳族醇例如苯酚、丁醇和苯甲醇，對羥基苯甲酸烷基酯例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環己醇、3-戊醇和間甲酚。“患者”或“受治療者”包括任何哺乳動物。以治療為目的，“哺乳動物”是指分類學上是哺乳動物的任何動物，包括但不限于人、家畜和農場動物、及動物園動物、體育場動物或寵物例如狗、馬、貓、牛等等。哺乳動物最好是人。￡￡Antegrenew是指包括也稱作AN100226 (抗體代號)或那他珠單抗(usan名稱) 的抗體。那他珠單抗是一種重組人源化抗α-4整聯蛋白抗體。優選哺乳動物待治療的疾病或病癥是當給予治療有效劑量的那他珠單抗時得以調節的疾病或病癥。“穩定”是指制劑不顯示或基本不顯示不穩定的征兆，包括聚集和/或脫酰胺。此外，“穩定”也指制劑在指定條件下貯藏兩年或兩年以上沒有任何不穩定的征兆。2.概沭在以下討論及隨后的實施例中，公開了穩定抗體制劑的配制，所公開的某些穩定制劑有高濃度的抗體，但保持固定的容量，這些制劑中的抗體是穩定的，抗體不在溶液中沉淀或聚集。除抗體外，也可考慮蛋白質為聞濃度制劑。給予受治療者(例如人)的典型抗體濃度約O. O lmg/ml至約200mg/ml，更典型的是，抗體的濃度范圍約O. lmg/ml至約150mg/ml。然而，當需要向患者提供更高濃度時,現有的例子例如約15mg/ml至約200mg/ml,優選約15mg/ml至約150mg/ml,更優選約20mg/ml至約50mg/ml,最優選約20mg/ml以及中間的任何整數值。需要用蛋白質治療時，可按已知方法給予哺乳動物所述抗體制劑。這些方法可以包括但不限于像快速濃注等靜脈注射或在一段時間內連續輸注，通過肌內、腹膜內、腦脊柱內、皮下、關節內、滑膜內、鞘內、口腔、局部或吸入途徑。在優選的實施方案中，通過靜脈給藥給予哺乳動物所述抗體制劑。合適的蛋白質劑量將取決于例如待治療的疾病、疾病的嚴重程度和病程、蛋白質是用作預防目的還是治療目的、以前的治療、患者的臨床病史和對蛋白質的反應、所用蛋白質的類型以及主治醫生的自行處理能力。治療中可一次或連續向患者適當施用蛋白質，也可隨著診斷在任何時間向患者用藥。在治療疑難疾病時，蛋白質也許是唯一的治療用藥或者和其他有用的藥物或療法聯合使用。當兩種(或更多種)藥物同時用藥或單獨用藥，并且其用藥方式使得這些藥物將會同時起效時，則本文所用的兩種(或更多種)藥物被認為是聯合用藥。在實施本發明的方法時，本發明的化合物可以單用或聯用，或與其他治療劑聯合使用。在某些優選的實施方案中，本發明的化合物可與其他化合物，即在一般醫療實踐中典型地用于治療這些疾病的那些化合物共同給藥。例如，本發明的制劑可與其他治療劑或物理療法聯合用藥以治療類風濕性關節炎、多發性硬化和節段性回腸炎(Crohn’s Disease)。2.1抗體制劑的制備方法 本方法可由技術人員進行改變，但通常要遵守諸如下述的程序。從含有制備目標抗體或蛋白質的細胞的工作細胞庫中獲取安瓿。制備接種物。培養或發酵細胞必要時進行補料。通過離心和/或過濾從而收獲/澄清細胞。例如使用螺旋過濾濃縮細胞10倍可以做到這一點。先用O. 2 μ m中間過濾隨后用A蛋白Sepharose Fast Flow (即親和層析)純化并且再反向洗脫。含有抗體的組合物然后在PH 3. 6-3. 7接受處理。所得混合物再接受病毒過濾繼之通過濃縮/滲濾步驟。然后可以通過DEAE Sepharose Fast Flow (陰離子交換)純化組合物。這個步驟可進行多次。從這時起，可進一步濃縮組合物隨后用聚丙烯酰胺葡聚糖S300HR (即凝膠過濾層析)系統純化，其中所用的運行緩沖液是磷酸鹽/NaCl。如有要求,含抗體的組合物可進一步濃縮成高濃度制劑(例如20mg/ml或更高)。然后，含抗體的組合物進一步緩沖并且通過添加O. 02% (w/v)聚山梨酯80調節濃度。接著，用O. 2 μ m濾器最后一次過濾該組合物，在這時候就可將其分裝到IOOml至IOL的聚丙烯瓶內。這樣的獲得的抗體或免疫球蛋白可以通過質控(QC)檢驗并且發放質量保證書(QA)。以那他珠單抗為例，如下示意上述步驟2. 2抗體制劑本發明的一方面，免疫球蛋白用IOmM磷酸鈉、140mM NaCl (pH6. 0±0. 5)和O. 02%聚山梨酯 80 配制，濃度約為1. 7mg/ml、5. 0mg/ml、10. 0mg/ml、15. 0mg/ml、20. Omg/ml、25. Omg/ml、30. 0mg/ml、40. Omg/ml 或 50. 0mg/ml。必要時用憐酸調 pH 至 6. 0±0. 5。不同制劑的一個實施例如下所示。定量組合物磷酸鹽緩沖液制劑
權利要求
1.一種用于皮下給予的穩定的水性藥物制劑，所述藥物制劑包含O. lmg/mL至200mg/mL那他珠單抗、O. 001%至2.0% 八聚山梨酯80、磷酸鹽緩沖液和氯化鈉。
2.權利要求1的制劑，其中所述那他珠單抗的含量為150mg/mL。
3.權利要求1的制劑，其中所述磷酸鹽緩沖液的量為約10mM。
4.權利要求1的制劑，其中所述制劑的pH為3.O至7. O。
5.權利要求4的制劑，其中pH為5.5至6. 5。
6.權利要求1的制劑，其中所述制劑是等滲的。
7.一種穩定的水性制劑，其包含 150mg/mL那他珠單抗； 140mM氯化鈉； O.0001% -2% (w/v)聚山梨酯80 ;以及 IOmM磷酸鈉。
8.權利要求7的制劑，其中所述制劑在2°C至8°C的溫度時穩定六個月。
9.一種制備用于皮下給予的穩定的制劑的方法，所述方法包括將磷酸鈉、氯化鈉、O.001%至2. 0% (w/v)聚山梨酯80和那他珠單抗混合，并用磷酸將所得混合物的pH調至pH 5. 5 至 6. 5。
10.權利要求9的穩定的制劑的制備方法，其中那他珠單抗的含量是150mg/mL，磷酸鈉的含量為10mM，氯化鈉的含量為140mM，和所述聚山梨酯80含量為O. 0001% -2% (w/v)。
11.一種產品，所述產品包括容納有權利要求1-10中任一項的用于皮下給予的穩定的水性藥物制劑的容器。
全文摘要
本發明為免疫球蛋白制劑及其制備方法。描述了一種穩定的水性藥物制劑及其制備方法，該藥物制劑包含治療有效量的抗體、聚山梨酯80、抑制聚山梨酯氧化的緩沖劑。還描述了高抗體濃度的制劑，該制劑保持固定容量并且可用于不同體重的患者。
文檔編號C07K1/00GK103040732SQ20121029245
公開日2013年4月17日 申請日期2004年2月9日 優先權日2003年2月10日
發明者D.J.伯克, S.E.布克利, S.R.萊爾曼, B.H.奧康諾爾, J.卡拉維, C.菲利普斯 申請人:伊蘭藥品公司