專利名稱：一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種蛋白的分離方法。
背景技術：
乳脂肪是牛乳的主要成分之一，乳脂肪以脂肪球的形式分散于牛乳中，其表面被一層厚度為5 10nm的膜所覆蓋，占脂肪球質(zhì)量的2% 6%，稱為乳脂肪球膜(Milk FatGlobule Menbrane, MFGM)。乳脂肪球膜由蛋白質(zhì)、磷脂、糖蛋白、三酰基甘油、膽固醇、酶和其他微量成分組成，其中，乳脂肪球膜蛋白中以糖蛋白為主，乳脂肪球膜蛋白占乳脂肪球膜總質(zhì)量的25%-60%，占總乳蛋白總質(zhì)量的1%_2%。研究表明，乳脂肪球膜蛋白具有良好的抗癌活性，在乳脂肪球膜蛋中提取的乳腺癌易感基因具有抑制乳腺癌的作用。現(xiàn)有乳脂肪球膜蛋白的分離方法主要有酸沉降法和膜過濾法。酸沉降法是通過用鹽酸沉降乳脂肪球膜蛋白，該方法的優(yōu)點是操作簡單、成本低，但鹽酸會在一定程度上影響乳脂肪球膜蛋白活性， 導致分離得到的乳脂肪球膜蛋白的純度偏低且性質(zhì)不穩(wěn)定；膜過濾法得到的乳脂肪球膜蛋白性質(zhì)較好，但該方法的成本高，操作復雜，不適合乳脂肪球膜蛋白的大量生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是要解決現(xiàn)有方法制備的牛乳乳脂肪球膜蛋白的純度低以及性質(zhì)不穩(wěn)定的問題，而提供一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法。本發(fā)明的一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法按以下步驟進行一、按質(zhì)量份數(shù)稱取100份的牦牛乳和31份的蔗糖；二、將步驟一稱取的牦牛乳用3飛層紗布進行過濾后，加入步驟一稱取的蔗糖，混合均勻，得到牛乳蔗糖混合液；三、將步驟二得到的牛乳蔗糖混合液在室溫條件下進行離心，得到處于離心產(chǎn)物上層的乳脂肪初提物；其中，離心轉(zhuǎn)速為300(T4000r/min，離心時間為2(T35min ；四、在步驟三得到的乳脂肪初提物中，加入廣3倍于該乳脂肪初提物體積的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后，在室溫條件下進行離心洗滌；其中，離心轉(zhuǎn)速為420(T5200r/min，離心時間為15 25min ;所述的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液的配制方法為按每IL鈉離子磷酸鹽緩沖溶液中含有Na2HPO4 :4. 2 4. 4mmol、KCl :2. 5 2. 8mmol、KH2PO4
I.6 I. 8mmol 和 NaCl :135 140mmol 的比例，將 Na2HPO4' KC1、KH2PO4 和 NaCl 加入到去離子水中，并調(diào)節(jié)其PH至7. 2^7. 5，得到鈉離子磷酸鹽緩沖溶液；五、將經(jīng)步驟四處理的乳脂肪初提物，按步驟四的方法重復操作一次，得到處于離心產(chǎn)物上層的乳脂肪；六、在步驟五得到的乳脂肪中，加入與乳脂肪體積相同的超純水，混合均勻后，在室溫條件下進行離心洗滌，得到處于離心產(chǎn)物上層的奶油；其中，離心轉(zhuǎn)速為420(T5200r/min,離心時間為15 25min ；七、將步驟六得到的奶油置于2 6°C條件下，并在該條件下靜置12 16h，得到奶油固體；ノV、將步驟七得到的奶油固體置于4(T45°C的水浴條件下進行融化，得到液態(tài)奶油；九、在步驟八得到的液態(tài)奶油中，加入體積為占液態(tài)奶油體積O. 15^0. 3%的聚こニ醇辛基苯基醚溶液，在室溫條件下進行離心，收集沉淀，得到牦牛乳乳脂肪球膜蛋白；其中，離心轉(zhuǎn)速為4000(T50000r/min，離心時間為4(T70min ;所述的聚こニ醇辛基苯基醚溶液的配制方法為按聚こニ醇辛基苯基醚與磷酸鹽緩沖液的體積比為1:2. 5^2. 7稱取聚こニ醇辛基苯基醚與磷酸鹽緩沖液，將二者混合均勻后，置于37 4(TC的水浴中，保持2 3小時；磷酸鹽緩沖液的濃度為O. 07 O. lmol/L、pH為7. 2 7. 4。本發(fā)明首先在牦牛牛乳中添加蔗糖，可以有效的減少乳脂肪球膜蛋白在后續(xù)分離 過程中的損失；利用鈉離子磷酸鹽緩沖溶液對牦牛乳乳脂肪初提物進行洗脫，本發(fā)明所使用的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液能夠洗脫掉附著于乳脂肪球膜上的酪蛋白和乳清蛋白，降低了所提取的乳脂肪球膜蛋白中雜質(zhì)蛋白的含量；利用非離子去污劑聚こニ醇辛基苯基醚溶液對牦牛乳奶油進行洗脫，所使用的非離子去污劑聚こニ醇辛基苯基醚溶液可以溶解脂質(zhì)而不對蛋白本身的性質(zhì)造成影響，使蛋白的性質(zhì)穩(wěn)定。通過本發(fā)明方法制備的牦牛牛乳乳脂肪球膜蛋白的純度可達到93、5%，而現(xiàn)有方法制備的牦牛牛乳乳脂肪球膜蛋白的純度僅為80%左右，有效的提高了牦牛牛乳乳脂肪球膜蛋白的純度。本發(fā)明適用于牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的大量生產(chǎn)。
具體實施例方式本發(fā)明的技術方案不局限于以下所列舉的具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法按以下步驟進行一、按質(zhì)量份數(shù)稱取100份的牦牛乳和31份的蔗糖；ニ、將步驟一稱取的牦牛乳用3飛層紗布進行過濾后，加入步驟ー稱取的蔗糖，混合均勻，得到牛乳蔗糖混合液；三、將步驟ニ得到的牛乳蔗糖混合液在室溫條件下進行離心，得到處于離心產(chǎn)物上層的乳脂肪初提物；其中，離心轉(zhuǎn)速為300(T4000r/min，離心時間為2(T35min ；四、在步驟三得到的乳脂肪初提物中，加入廣3倍于該乳脂肪初提物體積的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后，在室溫條件下進行離心洗滌；其中，離心轉(zhuǎn)速為420(T5200r/min，離心時間為15 25min ;所述的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液的配制方法為按每IL鈉離子磷酸鹽緩沖溶液中含有Na2HPO4 :4. 2 4. 4mmol、KCl :2. 5 2. 8mmol、KH2PO4
I.6 I. 8mmol 和 NaCl :135 140mmol 的比例，將 Na2HPO4' KC1、KH2PO4 和 NaCl 加入到去離子水中，并調(diào)節(jié)其PH至7. 2^7. 5，得到鈉離子磷酸鹽緩沖溶液；五、將經(jīng)步驟四處理的乳脂肪初提物，按步驟四的方法重復操作一次，得到處于離心產(chǎn)物上層的乳脂肪；六、在步驟五得到的乳脂肪中，加入與乳脂肪體積相同的超純水，混合均勻后，在室溫條件下進行離心洗滌，得到處于離心產(chǎn)物上層的奶油；其中，離心轉(zhuǎn)速為420(T5200r/min,離心時間為15 25min ；七、將步驟六得到的奶油置于2 6°C條件下，并在該條件下靜置12 16h，得到奶油固體；八、將步驟七得到的奶油固體置于4(T45°C的水浴條件下進行融化，得到液態(tài)奶油；九、在步驟八得到的液態(tài)奶油中，加入體積為占液態(tài)奶油體積O. 15^0. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液，在室溫條件下進行離心，收集沉淀，得到牦牛乳乳脂肪球膜蛋白；其中，離心轉(zhuǎn)速為4000(T50000r/min，離心時間為4(T70min ;所述的聚乙二醇辛基苯基醚溶液的配制方法為按聚乙二醇辛基苯基醚與磷酸鹽緩沖液的體積比為1:2. 5^2. 7稱取聚乙二醇辛基苯基醚與磷酸鹽緩沖液，將二者混合均勻后，置于37lO°C的水浴中，保持2 3小時；磷酸鹽緩沖液的濃度為O. 07 O. lmol/L、pH為7. 2 7. 4。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中按質(zhì)量份數(shù) 稱取20份的牦牛乳和I份的蔗糖。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一或二不同的是步驟三中離心轉(zhuǎn)速為3800r/min,離心時間為30min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一或二相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一至三之一不同的是步驟三和步驟四離心之后，將離心產(chǎn)物置于4°C條件下，并在該條件下靜置lOmin。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一至四之一不同的是步驟四中所述的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液的配制方法為按每IL鈉離子磷酸鹽緩沖溶液中含有Na2HPO4
4.3mmol、KCl :2. 7mmoI、KH2PO4 :1. 8mmol 和 NaCl 137mmol 的比例，將 Na2HPO4、KC1、KH2P04 和NaCl加入到去離子水中，并調(diào)節(jié)其pH至7. 4，得到鈉離子磷酸鹽緩沖溶液。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至四相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一至五之一不同的是步驟四和步驟六中離心轉(zhuǎn)速為4800r/min,離心時間為20min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至五相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一至六之一不同的是步驟九中加入體積為占液態(tài)奶油體積O. 2%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至六相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
一至七之一不同的是步驟九中離心轉(zhuǎn)速為44910r/min,離心時間為60min。其它步驟及參數(shù)與具體實施方式
一至七相同。通過以下試驗驗證本發(fā)明的有益效果試驗一本試驗的一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法按以下步驟進行一、挑選健康牦牛的新鮮牦牛乳，按質(zhì)量份數(shù)稱取20份的牦牛乳和I份的蔗糖；二、將步驟一稱取的牦牛乳用4層紗布進行過濾后，加入步驟一稱取的蔗糖，用磁力攪拌器混合均勻，得到牛乳蔗糖混合液；三、將步驟二得到的牛乳蔗糖混合液在室溫條件下進行離心，將離心產(chǎn)物置于4°C條件下，并在該條件下靜置lOmin，得到處于離心產(chǎn)物上層的乳脂肪初提物；其中，離心轉(zhuǎn)速為3800r/min,離心時間為30min ；
四、在步驟三得到的乳脂肪初提物中，加入2倍于該乳脂肪初提物體積的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液，用磁力攪拌器混合均勻后，在室溫條件下進行離心洗滌，將離心產(chǎn)物置于4°C條件下，并在該條件下靜置IOmin ;其中，離心轉(zhuǎn)速為4800r/min，離心時間為20min ;所述的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液的配制方法為按每IL鈉離子磷酸鹽緩沖溶液中含有Na2HPO4 4. 3mmol、KCl :2. 7mmoI、KH2PO4 :1. 8mmol 和 NaCl 137mmol 的比例，將 Na2HPO4、KCl、KH2PO4 和NaCl加入到去離子水中，并調(diào)節(jié)其pH至7. 4，得到鈉離子磷酸鹽緩沖溶液；五、將經(jīng)步驟四處理的乳脂肪初提物，按步驟四的方法重復操作一次，得到處于離心產(chǎn)物上層的乳脂肪；六、在步驟五得到的乳脂肪中，加入與乳脂肪體積相同的超純水，用磁力攪拌器混合均勻后，在室溫條件下進行離心洗滌，得到處于離心產(chǎn)物上層的奶油；其中，離心轉(zhuǎn)速為4800r/min,離心時間為 20min ； 七、將步驟六得到的奶油置于4°C條件下，并在該條件下靜置15h，得到奶油固體；ノV、將步驟七得到的奶油固體置于4(T45°C的水浴條件下進行融化，得到液態(tài)奶油；九、在步驟八得到的液態(tài)奶油中，加入體積為占液態(tài)奶油體積O. 2%的聚こニ醇辛基苯基醚溶液，在室溫條件下進行離心，收集沉淀，得到牦牛乳乳脂肪球膜蛋白；其中，離心轉(zhuǎn)速為44910r/min,離心時間為60min ;所述的聚こニ醇辛基苯基醚溶液的配制方法為按聚こニ醇辛基苯基醚與磷酸鹽緩沖液的體積比為1:2. 6稱取聚こニ醇辛基苯基醚與磷酸鹽緩沖液，將二者混合均勻后，置于37°C的水浴中，保持2小時；磷酸鹽緩沖液的濃度為O. lmol/L、pH 為 7. 3。試驗ー的對照試驗—、挑選健康牦牛的新鮮牦牛乳，按質(zhì)量份數(shù)稱取20份的牦牛乳和I份的蔗糖；ニ、將步驟一稱取的牦牛乳用4層紗布進行過濾后，加入步驟ー稱取的蔗糖，用磁力攪拌器混合均勻，得到牛乳蔗糖混合液；三、將步驟ニ得到的牛乳蔗糖混合液在室溫條件下進行離心，將離心產(chǎn)物置于4°C條件下，并在該條件下靜置lOmin，得到處于離心產(chǎn)物上層的乳脂肪初提物；其中，離心轉(zhuǎn)速為3800r/min,離心時間為30min ；四、在步驟三得到的乳脂肪初提物中，加入2倍于該乳脂肪初提物體積的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液，用磁力攪拌器混合均勻后，在室溫條件下進行離心洗滌，將離心產(chǎn)物置于4°C條件下，并在該條件下靜置IOmin ;其中，離心轉(zhuǎn)速為4800r/min，離心時間為20min ;所述的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液的配制方法為按每IL鈉離子磷酸鹽緩沖溶液中含有Na2HPO4 4. 3mmol、KCl :2. 7mmoI、KH2PO4 :1. 8mmol 和 NaCl 137mmol 的比例，將 Na2HPO4、KCl、KH2PO4 和NaCl加入到去離子水中，并調(diào)節(jié)其pH至7. 4，得到鈉離子磷酸鹽緩沖溶液；五、將經(jīng)步驟四處理的乳脂肪初提物，按步驟四的方法重復操作一次，得到處于離心產(chǎn)物上層的乳脂肪；六、在步驟五得到的乳脂肪中，加入與乳脂肪體積相同的超純水，用磁力攪拌器混合均勻后，在室溫條件下進行離心洗滌，得到處于離心產(chǎn)物上層的奶油；其中，離心轉(zhuǎn)速為4800r/min,離心時間為 20min ；七、將步驟六得到的奶油置于4°C條件下，并在該條件下靜置15h，得到奶油固體；
八、將步驟七得到的奶油固體置于4(T45°C的水浴條件下進行融化，得到液態(tài)奶油；九、將步驟八得到的液態(tài)奶油用攪拌器攪拌lOmin，再加入與液態(tài)奶油體積相同的去離子水，分離得到黃油和酪乳；十、將步驟九得到的黃油在60°C的水浴中加熱融化，然后加入與黃油體積相同的去離子水，在轉(zhuǎn)速為4800r/min的條件下離心20min，棄去上層黃油，得到下層清液；十一、將步驟十得到的下層清液與步驟十得到的酪乳混合，用濃度為O. Olmol/L的HCL調(diào)節(jié)其pH至4. 8，于室溫條件下靜置30min后，在轉(zhuǎn)速為12000r/min的條件下離心15min,收集沉淀物和懸浮物，即得到牦牛乳乳脂肪球膜蛋白。通過高效液相色譜法(HPLC)對試驗一得到的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白和對照試驗得到的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白進行分析。試驗一得到的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白中雜質(zhì)峰的峰面積僅為對照試驗得到的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白中雜質(zhì)峰峰面積的60%，并且雜峰 a S2-CN, K -CN的低含量酪蛋白組分已經(jīng)基本消失，牦牛乳乳脂肪球膜蛋白性質(zhì)穩(wěn)定。通過計算得出試驗一得到的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的純度為93. 5%，而對照試驗得到的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的純度僅為82. 7%，說明試驗一得到的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的純度得到了明顯的提聞。
權利要求
1.一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法，其特征在于牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法按以下步驟進行 一、按質(zhì)量份數(shù)稱取100份的牦牛乳和31份的蔗糖； 二、將步驟一稱取的牦牛乳用3飛層紗布進行過濾后，加入步驟一稱取的蔗糖，混合均勻，得到牛乳蔗糖混合液； 三、將步驟二得到的牛乳蔗糖混合液在室溫條件下進行離心，得到處于離心產(chǎn)物上層的乳脂肪初提物；其中，離心轉(zhuǎn)速為300(T4000r/min，離心時間為2(T35min ； 四、在步驟三得到的乳脂肪初提物中，加入Γ3倍于該乳脂肪初提物體積的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液，混合均勻后，在室溫條件下進行離心洗滌；其中，離心轉(zhuǎn)速為420(T5200r/min，離心時間為15 25min ;所述的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液的配制方法為按每IL鈉離子磷酸鹽緩沖溶液中含有 Na2HPO4 4. 2 4. 4mmol、KCl :2. 5 2. 8mmol、KH2PO4 :1. 6 I. 8mmol 和NaCl :135 140mmol的比例，將Na2HPO4、KCI、KH2PO4和NaCl加入到去離子水中，并調(diào)節(jié)其pH至7. 2,· 5，得到鈉離子磷酸鹽緩沖溶液； 五、將經(jīng)步驟四處理的乳脂肪初提物，按步驟四的方法重復操作一次，得到處于離心產(chǎn)物上層的乳脂肪； 六、在步驟五得到的乳脂肪中，加入與乳脂肪體積相同的超純水，混合均勻后，在室溫條件下進行離心洗滌，得到處于離心產(chǎn)物上層的奶油；其中，離心轉(zhuǎn)速為420(T5200r/min，離心時間為15 25min ； 七、將步驟六得到的奶油置于2 6°C條件下，并在該條件下靜置12 16h，得到奶油固體； 八、將步驟七得到的奶油固體置于4(T45°C的水浴條件下進行融化，得到液態(tài)奶油； 九、在步驟八得到的液態(tài)奶油中，加入體積為占液態(tài)奶油體積O.15^0. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液，在室溫條件下進行離心，收集沉淀，得到牦牛乳乳脂肪球膜蛋白；其中，離心轉(zhuǎn)速為4000(T50000r/min，離心時間為4(T70min ;所述的聚乙二醇辛基苯基醚溶液的配制方法為按聚乙二醇辛基苯基醚與磷酸鹽緩沖液的體積比為1:2. 5^2. 7稱取聚乙二醇辛基苯基醚與磷酸鹽緩沖液，將二者混合均勻后，置于37 40°C的水浴中，保持2 3小時；磷酸鹽緩沖液的濃度為O. 07 O. lmol/L、pH為7. 2 7. 4。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法，其特征在于步驟一中按質(zhì)量份數(shù)稱取20份的牦牛乳和I份的蔗糖。
3.根據(jù)權利要求I所述的一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法，其特征在于步驟三中離心轉(zhuǎn)速為3800r/min,離心時間為30min。
4.根據(jù)權利要求I所述的一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法，其特征在于步驟三和步驟四離心之后，將離心產(chǎn)物置于4°C條件下，并在該條件下靜置lOmin。
5.根據(jù)權利要求I所述的一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法，其特征在于步驟四中所述的鈉離子磷酸鹽緩沖溶液的配制方法為按每IL鈉離子磷酸鹽緩沖溶液中含有Na2HPO4 4. 3mmol、KCl :2. 7mmol、KH2P04 :1. 8mmol 和 NaCl 137mmol 的比例，將 Na2HP04、KCl、KH2PO4和NaCl加入到去離子水中，并調(diào)節(jié)其pH至7. 4，得到鈉離子磷酸鹽緩沖溶液。
6.根據(jù)權利要求I所述的一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法，其特征在于步驟四和步驟六中離心轉(zhuǎn)速為4800r/min,離心時間為20min。
7.根據(jù)權利要求I所述的一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法，其特征在于步驟九中加入體積為占液態(tài)奶油體積O. 2%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液。
8.根據(jù)權利要求I所述的一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法，其特征在于步驟九中離心轉(zhuǎn)速為44910r/min,離心時間為60min。
全文摘要
一種牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的分離方法，它涉及一種蛋白的分離方法。本發(fā)明是要解決現(xiàn)有方法制備的牛乳乳脂肪球膜蛋白的純度低以及性質(zhì)不穩(wěn)定的問題。分離方法在牦牛牛乳中加入蔗糖，通過離心獲得乳脂肪初提物，然后用鈉離子磷酸鹽緩沖溶液和超純水進行離心洗滌，最后用聚乙二醇辛基苯基醚溶液離心，得到牦牛乳乳脂肪球膜蛋白。本發(fā)明制備的牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的性質(zhì)穩(wěn)定，純度可達93.5%，解決了現(xiàn)有分離方法制備的牛乳乳脂肪球膜蛋白的純度低和性質(zhì)不穩(wěn)定的問題。本發(fā)明適用于牦牛乳乳脂肪球膜蛋白的大量生產(chǎn)。
文檔編號C07K14/47GK102863526SQ201210374928
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權日2012年9月29日
發(fā)明者馬鶯, 姬曉曦, 李琳 申請人:哈爾濱工業(yè)大學