專利名稱：一種純化恩夫韋肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于反相HPLC技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及ー種規(guī)模化純化恩夫韋肽的方法。
背景技術(shù)：
恩夫韋肽是ー種人工合成的由36個(gè)氨基酸組成的鏈狀多肽。是白色或灰白色非晶型固體，在純水中幾乎不溶，但在PH7. 5的緩沖液中溶解度達(dá)到82 142g/ml。分子式為C 204 H 301N5i O64。分子量為 4492。其結(jié)構(gòu)式為=CH3CO-Tyr-Thr-Ser-Leu-Ile-His-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2o恩夫韋肽為合成肽類HIV融合抑制藥，可與病毒包膜糖蛋白結(jié)合，阻止病毒與細(xì)胞膜融合所必需的構(gòu)象變化，從而抑制HIV-I的復(fù)制。它是近7年來(lái)抗艾滋病治療藥的先鋒，是第一個(gè)融合抑制劑。其它抗艾滋病藥物是作用于細(xì)胞內(nèi)部，阻止病毒在細(xì)胞內(nèi)部復(fù) 制；而這ー藥物卻是通過(guò)阻止病毒與T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的接觸融合，干擾HIV-I進(jìn)入T細(xì)胞，防止艾滋病患者的免疫系統(tǒng)遭受病毒破壞來(lái)發(fā)生作用，因此又稱為融合抑制劑。目前涉及關(guān)于恩夫韋肽的報(bào)道基本都是合成エ藝方面，而在純化工藝上基本沒(méi)有，因恩夫韋肽的理化性質(zhì)，在酸性及中性環(huán)境中溶解度極低，因此造成其在HPLC上純化的困難，使其收率極低，本發(fā)明通過(guò)在堿性環(huán)境中使用的色譜條件有效解決了這個(gè)問(wèn)題，從而達(dá)到提聞收率的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一條適于規(guī)模化生產(chǎn)恩夫韋肽的純化方法，主要解決恩夫韋肽在酸性及中性環(huán)境中溶解度極低，因此造成其在HPLC上純化的困難，使其收率極低的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明使用反相高效液相色譜法純化恩夫韋肽，并用HPLC轉(zhuǎn)鹽法交換轉(zhuǎn)鹽，效率高，成本低且收率好，達(dá)到產(chǎn)業(yè)化的要求，解決現(xiàn)有技術(shù)分離得到恩夫韋肽的空白。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種純化恩夫韋肽的方法，包括如下步驟
I)將恩夫,妝粗品以稀氣水完全溶解后，以濾I吳過(guò)濾后待用，以固定相為聚合物色譜柱，流動(dòng)相為兩相，磷酸鹽緩沖液為A相，色譜こ腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫一次純化，收集目的峰值含量大于80%的肽溶液；
2)以固定相為反相硅膠色譜柱進(jìn)行二次純化同時(shí)轉(zhuǎn)鹽，流動(dòng)相為兩相，醋酸水溶液為A相，色譜こ腈為B相，收集目的峰值含量大于98%的肽溶液；
3)將最終的高純度肽溶液減壓旋蒸濃縮冷凍干燥，得粉末狀成品肽。更為優(yōu)選的方案是所述聚合物色譜柱是以聚苯こ烯-聚こ烯苯為基質(zhì)的聚合物樹(shù)脂填料為固定相的聚合物色譜柱。更為優(yōu)選的方案是所述磷酸鹽緩沖液pH為7. 5-8. O。更為優(yōu)選的方案是所述步驟I)中梯度洗脫的B相體積百分濃度為30% 50%，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。更為優(yōu)選的方案是所述二次純化及轉(zhuǎn)鹽所用制備柱為以十八烷基鍵合硅膠填料為固定相的反相硅膠色譜柱。更為優(yōu)選的方案是所述二次純化及轉(zhuǎn)鹽中醋酸水溶液體積百分濃度為2. 0%，梯度洗脫的B相體積百分濃度為5% 20% 25%，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提出的一條適于規(guī)模化生產(chǎn)恩夫韋肽的純化工藝方法，先以聚合物制備柱在堿性條件下進(jìn)行一次純化得到純度80%以上的產(chǎn)品，再以C18填料的制備柱進(jìn)行二次純化同時(shí)轉(zhuǎn)鹽，不僅能得到HPLC純度大于98. 0%的精肽，還有效地提高了產(chǎn)品的收率，降低了成本，同時(shí)生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單，易于操作，從而達(dá)到大規(guī)模エ業(yè)化生產(chǎn)的目的。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例I
I.樣品處理稱取2g恩夫韋肽粗品于燒杯中，邊加入體積百分濃度為5%稀氨水邊超聲至液體澄清，用孔徑為O. 45um濾膜過(guò)濾后收集濾液備用。2. 一次純化
純化條件色譜柱以固定相為聚苯こ烯-聚こ烯基苯為基質(zhì)的聚合物樹(shù)脂填料的聚合物色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為3CmX25Cm.流動(dòng)相A相20mmol/l磷酸氫ニ鈉水溶液，以氨水調(diào)PH為7. 5-8. O ；B相:色譜こ腈。流速:15-20ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng):230nm。梯度B相體積百分濃度為30-50%，30-50min。進(jìn)樣量為2. 0-2. 5g。純化過(guò)程將色譜柱用體積百分濃度為30%的B相平衡好后上樣，進(jìn)行線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用。3. 二次純化及轉(zhuǎn)鹽
純化條件色譜柱以固定相為十八烷基鍵合硅膠的反相硅膠柱色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為3CmX25Cm.流動(dòng)相A相體積百分濃度為2. 0%醋酸水溶液；B相色譜こ腈。流速30-35ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。梯度B相體積百分濃度為5_20%，0_60min ；20-25%,60-90min。進(jìn)樣量為一次純化兩針粗品收集的肽溶液。純化過(guò)程將色譜柱用體積百分濃度為5%的B相平衡好后上樣，進(jìn)行線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用。4.將轉(zhuǎn)鹽后所得的所有肽溶液，進(jìn)行減壓濃縮至lg/100ml，濃縮溫度不超過(guò)400C，然后冷凍干燥得純度大于98. 0%的恩夫韋肽，純化收率52. 3%。實(shí)施例2
I.樣品處理稱取5g恩夫韋肽粗品于燒杯中，邊加入體積百分濃度為5%稀氨水邊超聲至液體澄清，用孔徑為O. 45um濾膜過(guò)濾后收集濾液備用。2. 一次純化
純化條件色譜柱以固定相為聚苯こ烯-聚こ烯基苯為基質(zhì)的聚合物樹(shù)脂填料的聚合物色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為5CmX25Cm.流動(dòng)相A相20mmol/l磷酸氫ニ鈉水溶液，以氨水調(diào)PH為7. 5-8. O ;B相色譜こ腈。流速35-40ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。梯度B相質(zhì)量百分濃度為30-50%，30-50min，上樣量為5. 0-5. 5g。
純化過(guò)程將色譜柱用體積百分濃度為30%的B相平衡好后上樣，進(jìn)行線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用。3. 二次純化及轉(zhuǎn)鹽
純化條件色譜柱以固定相為十八烷基鍵合硅膠的反相硅膠柱色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為5CmX25Cm.流動(dòng)相A相體積百分濃度為2. 0%醋酸水溶液；B相色譜こ腈。流速50-55ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。梯度B相體積百分濃度為5_20%，0_60min ；20-25%,60-90min。進(jìn)樣量為一次純化兩針粗品收集的肽溶液。純化過(guò)程將色譜柱用體積百分濃度為5%的B相平衡好后上樣，進(jìn)行線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用。4.將轉(zhuǎn)鹽后所得的所有肽溶液，進(jìn)行減壓濃縮至lg/100ml，濃縮溫度不超過(guò) 400C，然后冷凍干燥得純度大于98. 0%的恩夫韋肽，純化收率46. 6%。實(shí)施例3
I.樣品處理稱取15g恩夫韋肽粗品于燒杯中，邊加入體積百分濃度為5%稀氨水邊超聲至液體澄清，用孔徑為O. 45um濾膜過(guò)濾后收集濾液備用。2. 一次純化
純化條件色譜柱以固定相為聚苯こ烯-聚こ烯基苯為基質(zhì)的聚合物樹(shù)脂填料的聚合物色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為10CmX25Cm.流動(dòng)相A相20mmol/l磷酸氫ニ鈉水溶液，以氨水調(diào)pH為7. 5-8. O ;B相色譜こ腈。流速55_60ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng)230nm。梯度B相體積百分濃度為30-50%，30-50min。進(jìn)樣量為15_18g。純化過(guò)程將色譜柱用體積百分濃度為30%的B相平衡好后上樣，進(jìn)行線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用。3. 二次純化及轉(zhuǎn)鹽
純化條件色譜柱以固定相為十八烷基鍵合硅膠的反相硅膠柱色譜柱，柱子直徑和長(zhǎng)度為10CmX25Cm.流動(dòng)相A相體積百分濃度為2. 0%醋酸水溶液；B相色譜こ腈。流速:80-85ml/min。檢測(cè)波長(zhǎng):230nm。梯度B 相體積百分濃度:5_20%，0_60min ；20-25%,60-90min。進(jìn)樣量為一次純化兩針粗品收集的肽溶液。純化過(guò)程將色譜柱用體積百分濃度為5%的B相平衡好后上樣，進(jìn)行線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用。4.將轉(zhuǎn)鹽后所得的所有肽溶液，進(jìn)行減壓濃縮至lg/100ml，濃縮溫度不超過(guò)400C，然后冷凍干燥得純度大于98. 0%的恩夫韋肽，純化收率42. 7%。
權(quán)利要求
1.一種純化恩夫韋肽的方法，其特征是包括如下步驟 1)將恩夫韋妝粗品以稀氣水完全溶解后，以濾I吳過(guò)濾后待用，以固定相為聚合物色譜柱，流動(dòng)相為兩相，磷酸鹽緩沖液為A相，色譜乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集目的峰值含量大于80%的肽溶液； 2)以固定相為反相硅膠色譜柱進(jìn)行二次純化同時(shí)轉(zhuǎn)鹽，流動(dòng)相為兩相，醋酸水溶液為A相，色譜乙腈為B相，收集目的峰值含量大于98%的肽溶液； 3)將最終的高純度肽溶液減壓旋蒸濃縮冷凍干燥，得粉末狀成品肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述純化恩夫韋肽的方法，其特征在于所述步驟I)聚合物色譜柱為聚苯乙烯-聚乙烯苯為基質(zhì)的聚合物樹(shù)脂填料。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述純化恩夫韋肽的方法，其特征在于所述步驟I)中磷酸鹽緩沖液 pH 為 7. 5-8. O。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述純化恩夫韋肽的方法，其特征在于所述步驟I)中梯度洗脫的B相體積百分濃度為30% 50%，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述純化恩夫韋肽的方法，其特征在于所述步驟2)中反相硅膠色譜柱為十八烷基鍵合硅膠填料。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述純化恩夫韋肽的方法，其特征在于所述步驟2)中醋酸水溶液體積百分濃度為2. 0%，梯度洗脫的B相體積百分濃度為5%-20%-25%，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用反相高效液相色譜法純化恩夫韋肽的方法，主要解決恩夫韋肽收率極低的技術(shù)問(wèn)題。純化包括如下步驟1)將恩夫韋肽粗品以稀氨水完全溶解后，以濾膜過(guò)濾后待用，以固定相為聚苯乙烯-聚乙烯基苯為基質(zhì)的聚合物樹(shù)脂填料的聚合物色譜柱，流動(dòng)相中，磷酸鹽緩沖液為A相，色譜乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集目的峰值含量大于80%的肽溶液；2)以固定相為十八烷基鍵合硅膠的反相硅膠柱進(jìn)行二次純化同時(shí)轉(zhuǎn)鹽，流動(dòng)相中，醋酸水溶液為A相，色譜乙腈為B相，收集目的峰值含量大于98%的肽溶液；3)將最終的高純度肽溶液減壓旋蒸濃縮冷凍干燥，得粉末狀成品肽。本發(fā)明提出了一條適合放大生產(chǎn)的高效液相色譜法純化恩夫韋肽的純化工藝。
文檔編號(hào)C07K1/16GK102827258SQ20121037589
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年10月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月8日
發(fā)明者徐紅巖, 任麗萍 申請(qǐng)人:吉爾生化(上海)有限公司, 上海吉爾多肽有限公司, 濱海吉爾多肽有限公司