一種高純度比伐盧定及其工業化制備方法
【專利摘要】本發明提供一種高純度比伐盧定及其工業制備方法。制備方法采用固相多肽合成技術，通過使用方便回收且價格低廉的溶劑乙酸乙酯作為洗滌劑，提高了反應收率和產品品質，有效降低了生產成本，減少了廢物排放。
【專利說明】一種高純度比伐盧定及其工業化制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于一種高純度藥用多肽及其工業化制備方法，特別的，本發明涉及一種高純度比伐盧定及其工業制備方法。
【背景技術】
[0002]比伐盧定(bivalirudin)，又名比伐蘆定，分子式C98H138N24O33, CAS 號 128270-60-0，是一種人工合成的水蛭素衍生物，具有抑制凝血酶的活性，臨床中常作為抗凝劑應用于經皮冠狀動脈成形術(PCI)中。比伐盧定最早由Biogen公司研發,后由美國the Medicines公司開發上市，商品名Angiomax。目前，國內僅有深圳信立泰藥業上市了比伐盧定制劑產品，商品名為泰加寧。
[0003]比伐盧定由20個氨 基酸組成,其氨基酸序列為:D-Phe-Pro-Arg-Pro_Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-1Ie-pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH,化學名稱為:D_ 苯丙氨酰-L-脯氨酰-L-精氨酰-L-脯氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-L-天冬酰胺酰-甘氨酰-天冬氨酰-L-苯丙氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-異亮氨酰-L-脯氨酰-L-谷氨酰-L-谷氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸。
[0004]比伐盧定原料藥的工業生產多采用化學合成的方法，具體的，可以采用液相合成法、固相合成法或兩種方法的結合。其中，固相合成法因其產率高、產物易分離等特點在多肽類產品化學合成中廣泛使用。目前比伐盧定的合成多采用固相合成法。
[0005]比伐盧定的固相合成涉及多個合成步驟，每一步反應完成后都需要使用洗滌劑將肽樹脂里的殘留的反應物洗滌干凈才能進行下一步反應。否則，殘留的反應物會引起一系列副反應，并在后續反應中累積，進而導致產品總收率降低，產品雜質量和雜質數增多，并給后續的粗肽精制帶來困難。
[0006]對于洗滌劑的選擇，現有技術多用DMF或DMF配合甲醇、二氯甲烷作為每一步反應后的洗滌劑。專利CN200610024611.5報道了使用DMF作為洗滌劑應用于比伐盧定固相合成中；專利CN200810008131.9報道了使用DMF、甲醇及二氯甲烷作為洗滌劑應用于比伐盧定固相合成中。DMF沸點高達152.8 0C，工業生產中回收套用成本較高，如果直接排放，則會造成環境污染；甲醇洗滌效果不佳，無法單獨作為洗滌劑使用，且甲醇毒性大，易對人身造成傷害，對環境造成污染；二氯甲烷的沸點過低(39.8°C)，在單獨使用或與DMF混合使用時容易因揮發而損耗，不利于工業化生產，所以也不是理想的洗滌溶劑。盡管在實際生產中，洗滌效果也可以通過增加洗滌次數提高，但是多次洗滌樹脂勢必消耗大量的有機溶劑。所以尋找一種經濟、低毒且高效的比伐盧定固相合成洗滌溶劑是需要解決的技術問題。
[0007]發明人從解決現有技術的不足出發，通過大量實驗發現，采用固相合成法制備比伐盧定時，使用乙酸乙酯作為樹脂洗滌劑可以明顯提高反應收率，所得比伐盧定具有更高的純度和純肽含量。

【發明內容】
[0008]本發明的一個目的在于提供了一種用于比伐盧定固相合成中的洗滌劑及其使用方法，可以有效降低比伐盧定生產成本，所得比伐盧定的收率和純度均高于現有技術的方法。
[0009]本發明通過使用3飛ml/g樹脂的乙酸乙酯作為比伐盧定固相合成方法中的洗滌劑而實現上述有益效果，洗滌次數為1-9次。所述合成方法包括偶聯反應步驟和脫保護步驟，在偶聯反應步驟和脫保護步驟完成后，使用洗滌劑沖洗樹脂，避免將剩余的反應物帶入后續的反應中，如所用洗滌劑量過少，則可能導致洗滌效果差，殘留的反應物會帶入后續的反應中，進而影響反應收率和產品品質；而過多的洗滌量則會造成浪費，并增加產品生產成本。所述計量單位ml/g樹脂是指:在所述固相反應每個步驟中每使用I克連接氨基酸的樹月旨，對應的步驟所用溶劑量為I ml ;例如:在脫保護步驟中使用3飛ml/g樹脂的乙酸乙酯指代:該脫保護步驟中每使用I克待脫保護的樹脂，對應的脫保護步驟所用洗滌劑乙酸乙酯的量為:1~6 ml，優選的，所述洗滌劑乙酸乙酯的用量為4 ml/g樹脂。盡管理論上，通過多次洗滌可以更有效的去除雜質，但是多次洗滌勢必增加溶劑用量，延長總反應時間，進而提高生產成本。發明人通過大量實驗出人意料的發現，在固相多肽法合成比伐盧定的反應中，相同條件下，使用乙酸乙酯作 為洗滌劑，比使用其他溶劑更能徹底洗去雜質，所使用的洗滌劑量也更少，在洗滌次數為1-9次，洗滌劑用量為:1~6 ml/g時，使用乙酸乙酯作為洗滌劑的優勢尤為明顯。所述的每步反應使用的洗滌劑的量和洗滌次數相互獨立，所述的每步反應的洗滌次數是累積的，具體的，對于偶聯反應步驟，對應的乙酸乙酯的洗滌次數優選為廣3次，對于脫保護步驟，對應的乙酸乙酯的洗滌次數為優選為5、次。
[0010]比伐盧定固相合成反應使用的氨基酸原料，其端位氨基保護基可為有機化學反應中常見的保護基，如Boc、Fmoc、Moz等,優選的,所述氨基保護劑為Fmoc。
[0011]所述固相合成所用的樹脂為Leu-Wang Resin樹脂,負載量(SD)在0.5"! mmol/g之間，優選0.6 mmol/g。過低負載量的樹脂盡管洗滌效率高，但反應產量低，進而生產總成本高；而過高負載量的樹脂意味著負載的肽量高，則需要大量的洗滌溶劑，反應時也容易因肽鏈纏繞而導致產率降低，進而降低產品品質，增大后續提純難度，生產總成本升高。
[0012]本發明的另一個目的在于提供了一種比伐盧定的生產方法，適用于以乙酸乙酯為洗滌劑的比伐盧定固相合成，該方法各步驟結合緊密，且經濟環保，可用于比伐盧定的工業化生產中，所述方法包括下列步驟:
1)、以SD為0.5~1 mmol/g的Leu-Wang Resin樹脂為原料，使用偶聯劑和活化劑將樹脂與端位氨基被保護的氨基酸Tyr-OH縮合；
2)、除去反應液，固相使用乙酸乙酯洗滌；
3)、使用哌啶DMF溶液脫保護；
4)、除去反應液，固相使用乙酸乙酯洗滌；
5)、參照I)至4)的步驟，將其余十八個端位氨基被保護的氨基酸按照比伐盧定氨基酸序列依次縮合；
6)、用裂解試劑切割比伐盧定肽樹脂，收集裂解試劑，用乙醚沉淀粗肽；
7)、用反相高效液相法純化粗肽，干燥得純品。
[0013]所述比伐盧定的生產方法中，所使用的偶聯劑為DCC、DIC、HBTU、TBTU、PyBOP的一種或多種的混合物；所使用的活化劑為HOAt、HOBt中的一種或兩種的混合物；所使用的偶聯反應溶劑為DMF ;所使用的裂解溶液為體積比為95:2.5:2.5的TFA、TIS、H2O混合溶液，使用量為6-12 ml/g樹脂；乙醚的用量為8-10倍體積的裂解液量；對于本發明所述技術方案，在所述比伐盧定固相合成法的合理的原料用量及原料配比范圍內，使用所述用量及洗滌次數的乙酸乙酯作為洗滌劑均可以實現有益效果，優選的，當所使用的偶聯劑與氨基酸的比例在廣1.1:1，所使用的活化劑與氨基酸的比例在廣1.1:1時，洗滌效果尤為明顯。
[0014]所述比伐盧定的生產方法中，使用的脫保護基試劑是用量為8-12 ml/g樹脂的體積百分數為20%的哌啶DMF溶液，由于在實際生產中，為了更完全的脫除保護基，可以重復多次脫保護的操作，并將脫保護基試劑分配到每個操作中，所以所述脫保護試劑的用量是指累積用量。 例如，脫除同一個肽樹脂保護基反應中，可將使用量為10 ml/g樹脂的脫保護基試劑分成兩份，重復進行兩次脫保護操作，每次脫保護操作后均使用乙酸乙酯洗滌。
[0015]所述比伐盧定的生產方法的一個優選實施方式，包括下列步驟:
1)、以SD為0.6 mmol/g的Leu-Wang Resin樹脂為原料，以DIC為偶聯劑，HOBt為活化劑，DMF為溶劑，將樹脂與氨基酸Fmoc-Tyr-OH偶聯；所述偶聯劑與氨基酸的摩爾比為1.1:1，所述活化劑與氨基酸的摩爾比為1.1:1 ;
2)、除去反應液，固相以4ml/g樹脂比例的乙酸乙酯洗滌I次；
3)、加入5ml/g樹脂的體積百分數為20%的哌啶DMF溶液脫保護；
4)、除去反應液，固相以4ml/g樹脂比例的乙酸乙酯分2次洗滌；
5)、加入5ml/g樹脂的體積百分數為20%的哌啶DMF重復脫保護；
6)、除去反應液，固相以4ml/g樹脂比例的乙酸乙酯分5次洗滌；
7)、參照I)至6)的步驟，以DIC為偶聯劑，HOBt為活化劑，DMF為溶劑，將其余十八個Fmoc保護的氨基酸按照比伐盧定氨基酸序列依次偶聯，所述偶聯劑與氨基酸的摩爾比為1.1:1，所述活化劑與氨基酸的摩爾比為1.1:1 ;
8)、用6-12ml/g樹脂的裂解液切割比伐盧定肽樹脂，收集裂解液，用8-10倍體積裂解液量的乙醚沉淀粗肽；
9)、用反相高效液相法梯度洗脫純化粗品，洗脫劑《_):V(ill):V(7K)=1:250:75(Tl:400:600，收集洗脫劑，干燥后得純品。
[0016]本發明的第三個目的在于提供了一種比伐盧定產品，采用上述制備方法制得，其具有生產成本低、純度高、純肽含量高、雜質數量少、雜質含量低的特點。
[0017]本發明提供了一種高純度比伐盧定及其制備方法，其有益效果在于:
1、采用成本低廉、易于回收的乙酸乙酯作為比伐盧定固相合成洗滌劑，降低了生產成本，減少了廢液排放；
2、提供了洗滌劑最優使用量范圍，并據此設計了適用乙酸乙酯作為洗滌劑的比伐盧定固相合成方法，該方法具有經濟、環保的特點，適用于比伐盧定工業化生產；
3、提供了一種比伐盧定產品，該產品具有生產成本低、純度高、純肽含量高、雜質數量少、雜質含量低的特點。
[0018]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1為實施例1所得比伐蘆定粗品色譜圖 圖2為實施例1所得比伐蘆定純化品色譜圖【具體實施方式】
[0019]下面結合具體的實例對本發明作進一步詳細說明，但本發明的實施方式并不受下述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
[0020]
實施例1
采用本發明所述技術方案制備比伐盧定
1、稱取I kg Leu-Wang Resin (SD=0.60 mmol/g)樹脂置于硅烷化的玻璃反應器中,加入6 L DMF，使樹脂完全浸入其中，攪拌30 min，抽濾DMF。室溫下，將Fmoc-Tyr-OH (0.55kg, 1.2 mol)和HOBt (0.173 kg, 1.3 mol)溶解在3.3 L DMF里，加入到上述樹脂里攪拌均勻，隨即加入DIC (0.2 L,l.3 mol)，攪拌反應:3~4 h。經Kaiser試劑檢測，樹脂呈現無色后抽走反應液。
[0021]2、加入4 L乙酸乙酯攪拌5min,抽走洗漆液。
[0022]3、在樹脂中加入5 L體積百分數為20%的哌啶DMF溶液，攪拌反應3-10 min，抽
濾掉反應液。
[0023]4、加入4 L乙 酸乙酯攪拌5min，抽走洗滌液，重復洗滌I次。
[0024]5、在樹脂中加入5 L體積百分數為20%的哌啶DMF溶液，攪拌反應20 min,抽濾
掉反應液。
[0025]6、加入4 L乙酸乙酯攪拌5min，抽走洗滌液，重復洗滌5次。
[0026]7、參照上述1-6步，將C端第4-20個氨基酸的依次偶聯；
其中第3-20個氨基酸的用量如下:
Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH: 0.51 kg,1.2mol
Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH: 0.51 kg,1.2mol
Fmoc-L-Pro-OH: 0.404 kg,1.2mol
Fmoc-L-1le-OH: 0.424 kg,1.2mol
Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH: 0.51 kg,1.2mol
Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH: 0.51 kg,1.2mol
Fmoc-L-Phe-OH: 0.464 kg,1.2mol
Fmoc-L-Asp(OtBu)-OH: 0.494 kg,1.2mol
Fmoc-Gly-OH: 0.356 kg,1.2mol
Fmoc-L-Asn(Trt)-OH: 0.716 kg,1.2mol
Fmoc-Gly-OH: 0.356 kg,1.2mol
Fmoc-Gly-OH: 0.356 kg,1.2mol
Fmoc-Gly-OH: 0.356 kg,1.2mol
Fmoc-Gly-OH: 0.356 kg,1.2mol
Fmoc-L-Pro-OH: 0.404 kg,1.2mol
Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH: 0.776 kg,1.2mol
Fmoc-L-Pro-OH: 0.404 kg,1.2mol
Fmoc-D-Phe-OH: 0.464 kg,1.2mol脫保護完成并洗滌完畢后，真空干燥處理得到2 kg肽樹脂；
8、裂解
室溫下，將所得肽樹脂分批加入到裝有10 L裂解液(Vtfa =Vtis:VH20=95:2.5:2.5)的反應器中，維持攪拌2.5 h。抽濾裂解液，使用3 L裂解液分兩次洗滌樹脂，洗滌液并入到裂解液中，將該裂解液滴入到約120 L冷乙醚中并激烈攪拌，離心洗滌。干燥得粗品1.2 kg，經高效液相法檢測，產品純度93% (譜圖如圖1所示)。
[0027]9、提純
將所得粗品采用反相高效液相色譜梯度洗脫純化分離，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相，洗脫劑 w(TFA):V(⑶):V(水)=1:250:750~1:400:600，流速 500 ml/min，檢測波長 214nm。旋蒸收集到的洗脫液，冷凍干燥后得到比伐盧定0.54kg，純度99.8%，總產率37%(譜圖如圖2所示)。
[0028]
對比實施例1
參照實施例1的合成工藝和投料比，將其中的洗滌劑乙酸乙酯改為DMF。反應粗品純度84 %，純化后純度99.8 %，總產率26 %。
[0029]
對比實施例2
參照實施例1的合成工藝和投料比，將其中第2步和第4步的洗滌劑乙酸乙酯改為DMF，將第6步的洗滌劑改為使用DMF (5LX4次)、甲醇(5LX I次)、二氯甲烷(5LX I次)依次洗滌，并在第7步中其他氨基酸縮合、脫保護的洗滌劑也作出對應改變。反應粗品純度86 %，純化后純度99.8 %，總產率28 %。
[0030]
本說明書中，各英文縮寫對應的試劑名稱如下:
【權利要求】
1.一種比伐盧定的固相合成方法，其特征在于所述合成方法包括偶聯反應步驟和脫保護步驟，在偶聯反應步驟和脫保護步驟完成后，使用3飛ml/g樹脂的乙酸乙酯作為反應完成后的洗滌劑，洗滌次數為1-9次。
2.根據權利要求1所述的合成方法，其特征在于所述偶聯反應步驟后，對應的乙酸乙酯的洗滌次數為廣3次；所述脫保護步驟后，對應的乙酸乙酯的洗滌次數為優選為5、次；所述乙酸乙酯的用量為4 ml/g樹脂。
3.根據權利要求1-2任意一項所述的合成方法，其特征在于所述方法包括下列步驟: 1)、以SD為0.5~1 mmol/g的Leu-Wang Resin樹脂為原料，使用偶聯劑和活化劑將樹脂與端位氨基被保護的氨基酸Tyr-OH縮合； 2)、除去反應液，固相使用乙酸乙酯洗滌； 3)、使用哌啶DMF溶液脫保護； 4)、除去反應液，固相使用乙酸乙酯洗滌； 5)、參照I)至4)的步驟，將其余十八個端位氨基被保護的氨基酸按照比伐盧定氨基酸序列依次縮合； 6)、用裂解試劑切割比伐盧定肽樹脂，收集裂解試劑，用乙醚沉淀粗肽； 7)、用反相高效液相法純化粗肽，干燥得純品。
4.根據權利要求3所述的合成方法，其特征在于所述合成方法使用的偶聯劑為DCC、DIC、HBTU、TBTU、PyBOP的一種或多種的混合物，所述偶聯劑的比例為I~1.1:1。
5.根據權利要求3所述的合成方法，其特征在于所述合成方法使用的活化劑為HOAt、HOBt中的一種或兩種的混合物，所述活化劑的比例為f 1.1:1。
6.根據權利要求3所述的合成方法，其特征在于所述步驟3)中的哌啶DMF溶液為體積分數為20%的哌啶DMF溶液，使用量為8-12 ml/g樹脂。
7.根據權利要求3所述的合成方法，其特征在于所述步驟6)的裂解試劑為TFA、TIS、H2O的混合溶劑，體積比為95:2.5:2.5，所述裂解試劑的用量為6_12 ml/g樹脂。
8.根據權利要求3所述的合成方法，其特征在于所述步驟6)中乙醚的體積用量是裂解試劑的8-10倍。
9.根據權利要求4-8中任意一項所述的合成方法，其特征在于所述方法包括下列步驟: .1)、以SD為0.6 mmol/g的Leu-Wang Resin樹脂為原料，以DIC為偶聯劑，HOBt為活化劑，DMF為溶劑，將樹脂與氨基酸Fmoc-Tyr-OH偶聯；所述偶聯劑與氨基酸的摩爾比為.1.1:1，所述活化劑與氨基酸的摩爾比為1.1:1 ; 2)、除去反應液，固相以4ml/g樹脂比例的乙酸乙酯洗滌I次； 3)、加入5ml/g樹脂的體積百分數為20%的哌啶DMF溶液脫保護； 4)、除去反應液，固相以4ml/g樹脂比例的乙酸乙酯分2次洗滌； 5)、加入5ml/g樹脂的體積百分數為20%的哌啶DMF重復脫保護； 6)、除去反應液，固相以4ml/g樹脂比例的乙酸乙酯分5次洗滌； 7)、參照I)至6)的步驟，以DIC為偶聯劑，HOBt為活化劑，DMF為溶劑，將其余十八個Fmoc保護的氨基酸按照比伐盧定氨基酸序列依次偶聯，所述偶聯劑與氨基酸的摩爾比為.1.1:1，所述活化劑與氨基酸的摩爾比為1.1:1 ;8)、用6-12ml/g樹脂的裂解液切割比伐盧定肽樹脂，收集裂解液，用8-10倍體積裂解液量的乙醚沉淀粗肽； 9)、用反相高效液相法梯度洗脫純化粗品，洗脫劑《_):V(ill):V(7K)=1:250:75(Tl:400:600，收集洗脫 劑，干燥后得純品。
10.一種比伐盧定產品，其特征在于采用權利要求1-9中任意一項所述的合成方法制備得到。
【文檔編號】C07K1/06GK103965293SQ201310045298
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年2月5日 優先權日:2013年2月5日
【發明者】田茂奎, 陳艷 申請人:深圳信立泰藥業股份有限公司