專利名稱：一種裂褶菌抗病毒蛋白及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物病害防治領域，具體地說涉及一種裂褶菌抗病毒蛋白，以及該蛋白的制備方法和和用途。
背景技術：
煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，簡稱為:TMV)能侵染爺科、葫蘆科、十字花科等300多種植物,是危害廣泛的植物病毒之一。目前，對于植物病毒病尚未有有效的防治方法。食用菌中的活性物質在提高免疫力、抗菌、抗癌方面有一定的作用。目前，對于食用菌中的活性物質的應用多集中在醫學領域，而用于植物病毒防治方面則較少。裂裙菌(Schizophyllum commune Fr.)又稱白參、樹花，屬于裂裙菌科(Schizophyllaceae),裂裙菌屬(Schizophyllum)。裂裙菌廣布于世界各地，我國大部分地區也都有分布。裂褶菌中含有多種抗菌消炎、抗腫瘤，抗輻射等活性物質。目前，對裂褶菌多糖研究較多，如專利申請《具有抗癌效果的蘑菇多糖體組合物及其制備方法》(公開號:CN101766644A)公開了包括裂褶菌多糖在內的幾種蘑菇多糖組合物在提高免疫活性和促進細胞因子方面的作用；《免疫刺激劑》(公開號:CN1798563A)公開了裂褶菌多糖在內的多糖復合體作為免疫刺激劑的用途；《裂褶菌多糖在防治煙草花葉病毒病上的應用》(專利號:ZL2011101609475)公開了裂褶菌多糖提取物在防治煙草花葉病毒病上的用途。有關裂褶菌蛋白方面，專利《裂褶菌蛋白提取物及其制備方法和應用》(專利號:ZL200810247561)公開了裂褶菌蛋白提取物在抗煙草花葉病毒病上的用途。李洋等(李洋等.中國農學通報.2012年第24期250-255頁)公開了裂 褶菌蛋白粗提液對煙草花葉病毒的鈍化作用，但上述研究并未明確具體是哪種蛋白質在發揮作用。因此，有必要對其進行進一步研究，以便更好地加以應用。

發明內容
本發明目的在于提供一種裂褶菌抗病毒蛋白。本發明另一目的在于提供上述裂褶菌抗病毒蛋白的制備方法。本發明第三目的在于提供上述裂褶菌抗病毒蛋白在防治煙草花葉病毒病上的應用。實現本發明的技術方案如下:本發明一種裂裙菌抗病毒蛋白(其英文名稱為:Schizophyllum communeantiviral protein,簡稱為:ScAP),其中所述的裂裙菌抗病毒蛋白來自于裂裙菌,其分子量為 28.5kDa。上述裂褶菌抗病毒蛋白中所述的病毒是指煙草花葉病毒等。 上述裂褶菌抗病毒蛋白，按照如下方法制備:(I)、按照裂褶菌菌絲粉與磷酸緩沖液之間重量體積比為Ig:10 20mL的比例，將裂褶菌菌絲粉與25mM、pH8.0的磷酸緩沖液混合，然后在4°C浸提I 3h ;再在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心20 30min,收集上清液,得裂裙菌粗提液；(2)、向步驟(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸銨至飽和度為40%，然后在4°C放置8 10h，再在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心20 30min，收集上清液；(3)、向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度為85%，然后在4°C放置8 IOh,再在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心20 30min,收集沉淀；(4)、將步驟(3)所得的沉淀用25mM、pH8.0磷酸緩沖液溶解，然后裝入截留分子量為7000Da的透析袋，在超純水中透析10-12h，每3小時更換I次超純水；再將透析袋中的液體在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心30min,收集上清液；(5)、將步驟(4)所得的上清液進行離子交換層析，所用層析柱為HiTrap ANX FF(high sub),用洗脫液A進行洗脫,流速為lmL/min,收集280nm下吸收峰溶液；將所得吸收峰溶液進行超濾濃縮，得濃縮溶液；所述的洗脫液A為20mM Tris+0.1MNaCL, pH8.0 ；(6)、將步驟(5)超濾濃縮后所得的濃縮溶液進行凝膠層析，用洗脫液B進行洗脫，流速為0.4mL/min，檢測280nm下紫外吸收值，收集第3個吸收峰，所得即為裂褶菌抗病毒蛋白的溶液；其中所述的洗脫液B為50mM磷酸鹽緩沖液+0.15M NaCL ；pH7.2。上述裂褶菌抗病毒蛋白步驟(I)中所述的裂褶菌菌絲粉的粒徑< 60目。上述裂褶菌抗病毒蛋白步驟(5)中所述的離子交換層析在AKTA Explore上于4°C層析柜中進行。上述裂裙菌抗病毒蛋白步驟(5)中所述的超濾濃縮是用Amicon Ultra_1550KD超濾離心管(Millipore公司生產)在4°C、4000rpm條件下超濾3-4次，15min/次。

上述裂裙菌抗病毒蛋白步驟(6)中所述的凝膠層析在在AKTA Explore上于4°C層析柜中進行；使用Superdex20010/300GL層析柱。上述裂褶菌抗病毒蛋白的制備方法，包括如下步驟:(I)、按照裂褶菌菌絲粉與磷酸緩沖液之間重量體積比為Ig:10 20mL的比例，將裂褶菌菌絲粉與25mM、pH8.0的磷酸緩沖液混合，然后在4°C浸提I 3h ;再在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心20 30min,收集上清液,得裂裙菌粗提液；(2)、向步驟(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸銨至飽和度為40%，然后在4°C放置8 10h，再在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心20 30min，收集上清液；(3)、向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度為85%，然后在4°C放置8 IOh,再在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心20 30min,收集沉淀；(4)、將步驟(3)所得的沉淀用25mM、pH8.0磷酸緩沖液溶解，然后裝入截留分子量為7000Da的透析袋，在超純水中透析10-12h，每3小時更換I次超純水；再將透析袋中的液體在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心30min,收集上清液；(5)、將步驟(4)所得的上清液進行離子交換層析，所用層析柱為HiTrap ANX FF(high sub),用洗脫液A進行洗脫,流速為lmL/min,收集280nm下吸收峰溶液；將所得吸收峰溶液進行超濾濃縮，得濃縮溶液；所述的洗脫液A為20mM Tris+0.1MNaCL, pH8.0 ；(6)、將步驟(5)超濾濃縮后所得的濃縮溶液進行凝膠層析，用洗脫液B進行洗脫，流速為0.4mL/min，檢測280nm下紫外吸收值，收集第3個吸收峰，所得即為裂褶菌抗病毒蛋白的溶液；其中所述的洗脫液B為50mM磷酸鹽緩沖液+0.15M NaCL ；pH7.2。
上述制備方法步驟(5)中所述的離子交換層析在AKTA Explore上于4°C層析柜中進行。上述制備方法步驟(5)中所述的超濾濃縮是用Amicon Ultra_1550KD超濾離心管(Millipore公司生產)在4°C、4000rpm條件下超濾3-4次，15min/次。上述制備方法步驟(6)中所述的凝膠層析在在AKTA Explore上于4°C層析柜中進行；使用 Superdex20010/300GL 層析柱。上述裂褶菌抗病毒蛋白(或稱ScAP)在防治煙草花葉病毒病上的應用。本發明褶菌抗病毒蛋白的使用方法為將上述裂褶菌抗病毒蛋白的溶液稀釋成濃度為40ug/ml，噴施于3 5葉期的煙草、辣椒葉片上。本發明具有的優點:(1)本發明裂褶菌抗病毒蛋白對煙草花葉病毒的防治效果好，在噴施煙草72小時后，接種煙草花葉病毒，對煙草花葉病毒的抑制率可達到65%以上；
(2)本發明裂褶菌抗病毒蛋白為單一蛋白，為以后的測序和基因工程應用奠定了基礎。(3)本發明裂褶菌抗病毒蛋白屬于天然提取物，對人類和環境無害，可用于進一步開發生物農藥。


圖1;為裂褶菌抗病毒蛋白的電泳鑒定圖譜；其中I為裂褶菌抗病毒蛋白，2為分子量標準。圖2.為用凝膠層析鑒定牛血清白蛋白、雞卵清蛋白和為胰蛋白分子量的曲線圖。圖3.為用凝膠層析鑒定裂褶菌抗病毒蛋白分子量的曲線圖。
具體實施例方式實施例1、本發明裂褶菌抗病毒蛋白的制備(I)將裂褶菌菌絲粉30g與磷酸緩沖液(25mM，pH8.0)450mL混合，在4°C浸提lh，再在4°C、8000rpm離心30min,收集上清液,得到裂裙菌粗提液。(2 ) 向步驟(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸銨至飽和度為40%，在4°C放置8h，然后4°C、8000rpm離心30min,收集上清液。(3)向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度為85%，然后在4°C放置8h，再在4°C、8000rpm離心30min,收集沉淀。(4)將步驟(3)所得的沉淀用磷酸緩沖液(25mM，pH8.0)溶解，然后裝入截留分子量為7000Da的透析袋，在超純水中透析10h，每3h更換I次超純水；再將透析袋中的液體于4°C、8000rpm離心30min,收集上清液。(5)將步驟(4)所得的上清液進行離子交換層析，在AKTA Explore上于4°C下進行；使用HiTrap ANX FF (high sub)層析柱進行分離，用洗脫液A (20mM Tris+0.1MNaCL,pH8.0)進行洗脫，收集280nm下的吸收峰，吸收峰溶液用AmiconUltra_153KD超濾管(Millipore公司生產)在4°C、4000rpm條件下進行超濾濃縮4次，15min/次,得濃縮溶液。(6)將步驟(5)超濾后所得的濃縮溶液進行凝膠層析，在AKTA Explore上于4°C層析柜中進行；使用Superdex20010/300GL層析柱，用洗脫液B (50mM磷酸鹽緩沖液+0.15MNaCL ；pH7.2)進行洗脫，在280nm檢測其紫外吸收值，收集第3個吸收峰，即為裂褶菌抗病毒蛋白的溶液。實施例2、本發明裂褶菌抗病毒蛋白的制備(I)、將裂褶菌菌絲粉30g與磷酸緩沖液(25mM，pH8.0) 300mL混合，然后在4°C浸提2h，再于4°C、9000rpm離心25min，收集上清液，得到裂褶菌粗提液。(2)、向步驟(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸銨至飽和度為40%，然后在4°C放置9h，再于4°C、9000rpm離心25min，收集上清液。(3)、向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度為85%，然后在4°C放置9h，再于4°C、9000rpm離心25min,收集沉淀。(4)、將步驟(3)所得的沉淀用磷酸緩沖液(25mM，pH8.0)充分溶解，然后裝入截留分子量為7000Da的透析袋，在超純水中透析llh，每3h更換I次超純水，再于4°C、9000rpm離心30min,收集上清液。(5)、將步驟(4)所得的上清液進行離子交換層析，在AKTA Explore上于4°C下進行；使用HiTrap ANX FF (high sub)層析柱進行分離，用洗脫液A (20mM Tris+0.1MNaCL,pH8.0)進行洗脫，收集280nm下吸收峰，所得吸收峰溶液用Millipore公司的AmiconUltra-153KD 超濾管濃縮(4°C、4000rpm 下超濾 4 次，15min/ 次)。(6)、將步驟(5)超濾濃縮得到的濃縮溶液進行凝膠層析，在AKTA Explore上于4°C層析柜中進行；使用Superdex20010/300GL層析柱，用洗脫液B (50mM磷酸鹽緩沖液+0.15M NaCL ；pH7.2)進行洗脫，在280nm檢測其紫外吸收值，收集第3個吸收峰，即為裂褶菌抗病毒蛋白的溶液。實施例3、本發明裂褶菌抗病毒蛋白的制備

(I)、將裂褶菌菌絲粉30g與磷酸緩沖液(25mM，pH8.0) 600mL混合，然后在4°C浸提3h,再于4°C、IOOOOrpm離心20min,收集上清液,得到裂裙菌粗提液；(2)、向步驟(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸銨至飽和度為40%，然后在4°C放置10h，再于4°C、IOOOOrpm離心20min，收集上清液；(3)、向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度為85%，然后在4°C放置10h，再于4°C、IOOOOrpm離心20min,收集沉淀。(4)、將步驟(3)所得的沉淀用磷酸緩沖液(25mM，pH8.0)充分溶解后，裝入截留分子量為7000Da的透析袋，在超純水中透析12h，每3h更換I次超純水，然后于4°C、IOOOOrpm離心30min,收集上清液。(5)、將步驟(4)所得的上清液進行離子交換層析，在AKTA Explore上于4°C下進行；使用HiTrap ANX FF (high sub)層析柱進行分離，用洗脫液A (20mM Tris+0.1MNaCL,pH8.0)進行洗脫，收集280nm下吸收峰溶液，吸收峰溶液用Millipore公司的AmiconUltra-153KD 超濾管濃縮(4°C、4000rpm 下超濾 4 次，15min/ 次)。(6)、將步驟(5)超濾濃縮得到的濃縮溶液進行凝膠層析，在AKTA Explore上于4°C層析柜中進行；使用Superdex20010/300GL層析柱，用洗脫液B (50mM磷酸鹽緩沖液+0.15M NaCL ；pH7.2)進行洗脫，在280nm檢測其紫外吸收值，收集第3個吸收峰，即為裂褶菌抗病毒蛋白的溶液。實施例4、本發明裂褶菌抗病毒蛋白(ScAP)的電泳鑒定按照如下方法操作:
(I )、SDS-PAGE凝膠配制:分離膠濃度12% (5mL凝膠中含去離子水1.6mL，30%Acrylamide2.0mL,1.5M pH8.8Tris-HCll.3mL,10%SDS50u L,10% 過硫酸銨 50 y L,TEMED2 u L),濃縮膠濃度 5% (3mL 凝膠中含去離子水 2.1mL, 30%Acrylamide0.5mL, 1.5MpH8.8Tris-HC10.38mL, 10%SDS30 u L, 10% 過硫酸銨 30 u L, TEMED3 u L);制膠；等待膠凝固。(2)、電泳:將實施例1制備的裂褶菌抗病毒蛋白加入SDS-PAGE上樣緩沖液，在沸水浴中加熱5min，在冰塊中，待樣品冷卻后用微量進樣器每孔進樣20 u L。濃縮膠80V/cm，分離膠llOV/cm，待指示劑距離凝膠底端Icm時停止電泳。(3)、銀染法:固定(30min)-致敏(30min)-水洗(3次，每次IOmin)-銀染(20min)-水洗(2次，每次Imin)-顯色-終止(IOmin)-保存(1%冰醋酸中，4°C保存)(4)、電泳圖結果(見圖1)顯示只有一條蛋白條帶，無其他條帶，說明實施例1中所得的裂褶菌抗病毒蛋白為單一的蛋白質。實施例5、裂褶菌抗病毒蛋白的分子量測定在AKTA Explore上于4°C層析柜中進行，所用試劑均經過濾和脫氣處理。使用Superdex20010/300GL層析柱，緩沖液(50mM磷酸鹽緩沖液和0.15MNaCL;pH7.2)充分平衡至280nm紫外吸光值不再變化，流速為0.5ml/min，上樣量為IOOuL,標準蛋白濃度為2 3mg/mlo裂褶菌抗病毒蛋白經濃縮過濾后上樣，緩沖液(0.05M磷酸鹽緩沖液+0.15M Nacl,Ph7.2)，280nm檢測其紫外吸光值。標準蛋白分別采用牛血清白蛋白(66.2kDa)、雞卵清蛋白(44.28kDa)和胰蛋白酶(25.0kDa),以相同條件洗脫。分別記錄本發明裂褶菌抗病毒蛋白(或稱ScAP)及標準蛋白的洗脫體積，計算裂褶菌抗病毒蛋白(或稱ScAP)的分子量。結果(見圖2)顯示胰蛋白酶(25.0kDa)、雞卵清蛋白(44.28kDa)和牛血清白蛋白(66.2kDa)的洗脫體積分別為20.259mL、15.298mL、14.690mL ;裂褶菌抗病毒蛋白(或稱ScAP)(見圖3)的洗脫體積為19.02mL。根據標準蛋白的洗脫體積和分子量對數值繪制標準曲線，得到回歸方程，通 過裂褶菌抗病毒蛋白的洗脫體積計算出裂褶菌抗病毒蛋白(或稱ScAP)的分子量為28.5kDa。實施例6、本發明裂褶菌抗病毒蛋白的質譜鑒定經實施例4中SDS-PAGE電泳后切膠回收的裂褶菌抗病毒蛋白(或稱ScAP)送往北京華大蛋白質研究中心進行LC/MS/MS分析，結果獲得的酶解片段的一級(MS)和二級(MS/MS)質譜數據經MASCOT分析軟件處理后，通過網上蛋白質數據庫進行蛋白質搜索鑒定。結果顯示:得到的27個肽段中，所匹配上的肽段數量為23個。數據檢索時，ScAP與裂褶菌預測蛋白磷酸丙糖異構酶匹配率很高。實施例7、裂褶菌抗病毒蛋白誘導煙草抗煙草花葉病毒活性試驗1、蛋白濃度的測定用BCA蛋白濃度試劑盒(美國Pierce公司)檢測實施例1、2、3制備的裂褶菌抗病毒蛋白的濃度。2、抗病毒效果試驗(I)噴霧防治處理:分別將實施例1、2、3制備的ScAP配制成蛋白濃度為40 ii g/ml的溶液，分別對三至四葉期的枯斑三生煙進行整株噴霧，同時用清水噴施于三至四葉期的枯斑三生煙作為對照(CK)，設置三個重復，每個重復3株，每株3片葉子。(2)病毒接種液的制備:病毒來源為北京市農林科學院植物與環境保護研究所植病綜防研究室保存的TMV普通株系(以普通煙為繁殖寄主，活體保存)，將感染煙草花葉病毒TMV普通株系的普通煙的葉片去除主脈，與pH8.0的0.01mol/L磷酸緩沖液按lg/20ml混合，每20ml磷酸緩沖液加0.015g金剛砂，將葉片充分研磨，得到接種液。(3)接種:按步驟(I)的方法噴霧處理枯斑三生煙植株72小時后，用步驟(2)得到的接種液進行汁液摩擦接種(植病研究方法(第三版)，方中達，中國農業出版社)接種后立即用清水沖洗，于防蟲溫室中培養，培養條件為28°C光照12小時，18°C無光照12小時，交替進行。(4)枯斑抑制率計算:接種72小時后調查枯斑三生煙葉片產生枯斑數量，按下式計算出枯斑抑制率。X= (CK-Y)/CKX 100 (式 I)式I中，X為枯斑抑制率，單位:％ ；CK為清水對照葉片的平均枯斑數，單位:個；Y為經ScAP誘導處理后葉片的平均枯斑數，單位:個。結果(見表I)用實施例1、2、3所得的裂褶菌抗病毒蛋白處理過的煙草對煙草花葉病毒的抑制率在65%以上，說明裂褶菌抗病毒蛋白能夠誘導煙草對煙草花葉病毒產生抗性。表1.本發明裂褶菌抗病毒蛋白誘導煙草抗煙草花葉病毒活性試驗結果
權利要求
1.一種裂褶菌抗病毒蛋白，其特征在于所述的裂褶菌抗病毒蛋白來自于裂褶菌，其分子量為28.5kDa ;其中所述的病毒是指煙草花葉病毒。
2.權利要求1所述的裂褶菌抗病毒蛋白，其特征在于按照如下方法制備: (1)、按照裂褶菌菌絲粉與磷酸緩沖液之間重量體積比為Ig:10 20mL的比例，將裂褶菌菌絲粉與25mM、pH8.0的磷酸緩沖液混合，然后在4°C浸提I 3h ;再在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心20 30min,收集上清液,得裂裙菌粗提液； (2)、向步驟(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸銨至飽和度為40%，然后在4°C放置8 IOh,再在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心20 30min,收集上清液； (3)、向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度為85%，然后在4°C放置8 10h，再在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心20 30min,收集沉淀； (4)、將步驟(3)所得的沉淀用25mM、pH8.0磷酸緩沖液溶解，然后裝入截留分子量為7000Da的透析袋，在超純水中透析10-12h，每3小時更換I次超純水；再將透析袋中的液體在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心30min,收集上清液； (5)、將步驟(4)所得的上清液進行離子交換層析，所用層析柱為HiTrapANX FF (highsub)，用洗脫液A進行洗脫，流速為lmL/min，收集280nm下吸收峰溶液；將所得吸收峰溶液進行超濾濃縮，得濃縮溶液；所述的洗脫液A為20mM Tris+0.1MNaCL, pH8.0 ； (6)、將步驟(5)超濾濃縮后所得的濃縮溶液進行凝膠層析，用洗脫液B進行洗脫，流速為0.4mL/min,檢測280nm下紫外吸收值，收集第3個吸收峰，所得即為裂褶菌抗病毒蛋白的溶液；其中所述的洗 脫液B為50mM磷酸鹽緩沖液+0.15M NaCL ；pH7.2。
3.按照權 利要求2所述的裂褶菌抗病毒蛋白，其特征在于其步驟(I)中所述的裂褶菌菌絲粉的粒徑< 60目 。
4.按照權利要求2所述的裂褶菌抗病毒蛋白，其特征在于其步驟(5)中所述的離子交換層析在AKTA Explore上于4°C層析柜中進行。
5.按照權利要求2所述的裂褶菌抗病毒蛋白，其特征在于其步驟(5)中所述的超濾濃縮是用Amicon Ultra-1550KD超濾離心管在4°C >4000rpm條件下超濾3-4次，15min/次。
6.按照權利要求2所述的裂褶菌抗病毒蛋白，其特征在于其步驟(6)中所述的凝膠層析在在AKTA Explore上于4°C層析柜中進行；使用Superdex20010/300GL層析柱。
7.權利要求2所述的裂褶菌抗病毒蛋白的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)、按照裂褶菌菌絲粉與磷酸緩沖液之間重量體積比為Ig:10 20mL的比例，將裂褶菌菌絲粉與25mM、pH8.0的磷酸緩沖液混合，然后在4°C浸提I 3h ;再在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心20 30min,收集上清液,得裂裙菌粗提液； (2)、向步驟(I)所得的裂褶菌粗提液中加入硫酸銨至飽和度為40%，然后在4°C放置8 IOh,再在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心20 30min,收集上清液； (3)、向步驟(2)所得的上清液中加入硫酸銨至飽和度為85%，然后在4°C放置8 10h，再在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心20 30min,收集沉淀； (4)、將步驟(3)所得的沉淀用25mM、pH8.0磷酸緩沖液溶解，然后裝入截留分子量為7000Da的透析袋，在超純水中透析10-12h，每3小時更換I次超純水；再將透析袋中的液體在4°C、8000 IOOOOrpm條件下離心30min,收集上清液； (5)、將步驟(4)所得的上清液進行離子交換層析，所用層析柱為HiTrapANX FF (highsub)，用洗脫液A進行洗脫，流速為lmL/min，收集280nm下吸收峰溶液；將所得吸收峰溶液進行超濾濃縮，得濃縮溶液；所述的洗脫液A為20mM Tris+0.1MNaCL, pH8.0 ； (6)、將步驟(5)超濾濃縮后所得的濃縮溶液進行凝膠層析，用洗脫液B進行洗脫，流速為0.4mL/min,檢測280nm下紫外吸收值，收集第3個吸收峰，所得即為裂褶菌抗病毒蛋白的溶液；其中所述的洗脫液B為50mM磷酸鹽緩沖液+0.15M NaCL ；pH7.2。
8.按照權利要求7所述的制備方法，其特征在于其步驟(5)中所述的離子交換層析在AKTA Explore上于4°C層析柜中進行；所述的超濾濃縮是用Amicon Ultra_1550KD超濾離心管在4°C、4000rpm條件下超濾3-4次，15min/次。
9.按照權利要求7所述的制備方法，其特征在于其步驟(6)中所述的凝膠層析在在AKTA Explore上于4°C層析柜中進行；使用Superdex20010/300GL層析柱。
10.權利要求1 6任一 所述的裂褶菌抗病毒蛋白在防治煙草花葉病毒病上的應用。
全文摘要
本發明公開了一種裂褶菌抗病毒蛋白，屬于植物病害防治領域。本發明主要是將裂褶菌菌絲粉在磷酸緩沖液中浸提，離心后獲得粗提液；然后加入硫酸銨進行沉淀，再經透析、離子交換層析、超濾濃縮和凝膠層析，獲得單一的裂褶菌抗病毒蛋白，其分子量約為28.5kDa。本發明還公開了裂褶菌抗病毒蛋白的制備方法，以及在在防治煙草花葉病毒病上的應用。本發明裂褶菌抗病毒蛋白對煙草花葉病毒的防治效果好，在噴施煙草72小時后，對煙草花葉病毒的抑制率可達到65%以上；其次，本發明裂褶菌抗病毒蛋白為單一蛋白，為以后的測序和基因工程應用奠定了基礎；本發明裂褶菌抗病毒蛋白為天然提取物，對人類和環境無害，可用于開發生物農藥。
文檔編號C07K1/30GK103224549SQ201310204598
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月28日 優先權日2013年5月28日
發明者周瑩, 李洋, 嚴紅 申請人:北京市農林科學院