雙唾液酸化四糖的合成方法
【專利摘要】本發明公開了一種化學可控的酶法合成雙唾液酸化的四糖的合成方法。本發明還提供了兩種用于合成制備雙唾液酸化四糖的中間體，分別為通式Ⅳ、Ⅴ所示的化合物。本發明將化學合成法的靈活性和酶合成法的高區域選擇性和高效性結合到一起，首次實現了用化學干預的方法合成雙唾液酸化四糖的合成，解決了目前化學合成雙唾液酸化四糖的所面臨的底物反應活性低、合成步驟繁多、收率低等不足，以及酶法中唾液酸轉移酶獲得困難和只對糖肽識別的問題，具有底物反應活性高、收率高的優點，因而，本發明為在分子水平上研究唾液酸糖苷的生物功能和發展以此為基礎的糖藥物具有重要意義。
【專利說明】雙唾液酸化四糖的合成方法【技術領域】[0001]本發明涉及糖類物質的化學酶法合成方法，尤其涉及一類腫瘤相關糖抗原和對神經修復具有促進作用的雙唾液酸化四糖的化學酶法合成方法，屬于糖類藥物領域。【背景技術】[0002]雙唾液酸化四糖Neu5Ac α (2-3) Gal β (1-3) [Neu5Ac α (2-6) ] GalNAc (圖1)廣泛存在于各種類型細胞表面，并在眾多生理和病理過程中發揮著至關重要的作用。例如，該四糖是人類紅細胞表面高度糖基化的血型糖蛋白(glycophorin)上最主要的糖鏈,這一糖鏈除了可以避免紅細胞的聚集外，還參與了紅細胞所介導的眾多生理過程(J.Parkkinen, G.N.Rogers, T.Korhonen, ff.Dahr, J.Finne.1nfectionandimmolunity, 1986, 54, 37-42)；這一四糖也是腫瘤細胞過度表達的黏蛋白MUCII上的特異性腫瘤相關糖抗原，因而是合成以糖鏈為基礎的腫瘤疫苗的重要組成部分；此外，這一四糖也是神經節苷酯GQlba的組成部分，是髓磷脂相關糖蛋白(myelin-associatedglycoprotein, MAG)所能識別的最小結構單元，且為其結合活性最高的天然受體(B.E.Collins, H.1to, N.Sawada, H.1shida, M.Kiso, R.L.Schnaar, J.Biol.Chem.1999, 274, 37637);這一四糖還是促紅細胞生成素(EPO)上的唯一 O-聚糖鏈。 [0003]圖1是雙唾液酸化四糖的結構。[0004]鑒于上述情況，大量合成這種富含唾液酸的寡糖用于在分子水平上研究其功能是非常有價值的，同時一個高效、便捷的合成方法將極大地促進以其為先導化合物的藥物發現進程。然而由于這類天然唾液酸糖苷結構的復雜性及其不穩定性，給分離純化帶來了極大困難。雖然近年來化學合成寡糖獲得了快速的發展，但依然沒有一個統一、有效的普適性方法。化學法合成這類四糖需要進行反復的保護與脫保護操作，反應收率低，立體選擇性不高(J.B.Schwarz, S.D.Kuduk, X.Chen, D.Sames, P.ff.Glunz, andS.J.Danishefsky，J.Am.Chem.Soc.，1999，121，2662-2673)。同時，九碳糖唾液酸由于其自身獨特結構，不僅容易形成分子內氫鍵，且在Cl位的羧基、C3位的脫氧、C5位的氮雜原子取代等使得唾液酸糖苷鍵的化學合成一直以來都是糖合成領域的難點(X.Chen.，A.Varki, ACSChem.Biol.，2010，5，2，163-176)。酶法合成這類雙唾液酸化的四糖需要使用 α 2，3唾液酸轉移酶和α 2，6唾液酸轉移酶來分別將兩個唾液酸引入不同位置。目前， 僅有的一例酶法合成報道(0.Blixt, K.Allin, L.Pereira, A.Datta, andj.C.Paulson, J.Am.Chem.Soc.，2002，124，5739-5746)，采用的是哺乳動物來源的兩個唾液酸轉移酶來分別引入四糖表位中的兩個唾液酸。利用哺乳動物來源的唾液酸轉移酶面臨以下幾方面的困難:(1)哺乳動物來源的唾液酸轉移酶均為跨膜蛋白，現有技術手段很難實現可溶性蛋白的大量表達；(2)該系列酶往往具有很強的底物專一性，底物適用性窄，例如報道中的唾液酸轉移酶只對糖肽有較高的反應活性(0.BI ixt，K.Al I in，L.Pereira, A.Datta, andj.C.Paulson.J.Am.Chem.Soc.2002，124，5739-5746)。近年來發現細菌來源的唾液酸轉移酶具有表達量高，底物適應性寬等優點(J.Yan, X.Chen, F.Wang, H.Ca0.0rg.Biomol.Chem.2013，11，842-848)，但是，其中的α 2, 6唾液酸轉移酶卻不能區分核心二糖 Gal^ (1-3)GalNAc的半乳糖(Gal)或乙酰氨基半乳糖(GalNAc)。為解決這些問題，本發明首次成功運用含有內酯的寡糖進行化學酶法的合成，實現了雙唾液酸化四糖及其類似物的快速、高效合成，解決了目前化學或酶法合成中的不足。
【發明內容】
[0005]針對上述現狀，本發明首先要面臨的技術問題是解決酶法合成中使用到的細菌來源的α 2，6唾液酸轉移酶不能區分核心二糖Galii (1-3)GalNAc的半乳糖(Gal)或乙酰氨基半乳糖(GalNAc)的問題，從而將第二個唾液酸引入到正確的位置。[0006]本發明所要解決的另一個技術問題提供一種快速、高效的化學操縱的酶法合成雙唾液酸化四糖及其類似物的方法。[0007]本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的:[0008]一類雙唾液酸化四糖的合成方法，具體步驟如下:[0009](I)利用化學法合成β -構型的N-乙酰氨基半乳糖苷GalNAc β O R1 (如圖2的通式I所示);其中=R1為氫原子、α -或β -構型絲氨酸殘基、α -或β -構型蘇氨酸殘基、疊氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或α _或β _構型取代烷基；[0010](2)利用“一鍋雙酶法”將通式I的化合物和半乳糖立體選擇性偶聯合成二糖 GalP (1-S)GalNAcOR1 (如圖3的通式II所示)，所述”一鍋雙酶法”中先后用到的酶分別為半乳糖激酶(GalK)和己糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP);其中=R1為氫原子、α -或β -構型絲氨酸殘基、α -或β -構型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α -或 β-構型取代烷基；[0011](3)利用“一鍋雙酶法”合成通式III的三糖(如圖4所示)，所述“一鍋雙酶法”唾液酸化中用到的酶指CMP-唾液酸合成酶(NmCSS)和α 2，3唾液酸轉移酶(PmSTl) (J.Yan, X.Chen, F.Wang, H.Ca0.0rg.Biomol.Chem.2013，11，842-848);其中:R1 為氫原子、α -或β-構型絲氨酸殘基、α-或β-構型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或構型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或置氣；[0012](4)利用乙酰化和選擇性脫乙酰基的方法，合成含唾液酸的內酯三糖(如圖5的通式IV所示);其中=R1為氫原子、α -或β -構型絲氨酸殘基、α -或β -構型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或β-構型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、`羥基或疊氮；[0013](5)利用酶法合成雙唾液酸化的內酯四糖(如圖6的通式V所示)，所述酶法唾液酸化中用到的酶指α 2，6唾液酸轉移酶；其中=R1為氫原子、α -或β -`構型絲氨酸殘基、 α-或β_構型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或β_構型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；[0014](6)堿性水溶液中水解上述雙唾液酸化四糖的內酯，得到雙唾液酸化四糖(如圖7 的通式VI所示)；其中=R1為氫原子、α -或β -構型絲氨酸殘基、α -或β -構型蘇氨酸殘基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或ct -或β -構型取代烷基；R2為氣原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮。[0015]本發明中，通過步驟(2)和步驟(3)，我們利用α 2，3唾液酸轉移酶(PmSTl)和己糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP)，高效、快速的實現了對單唾液三糖的底物積累，對于這兩種酶的底物適應性的考察(含R1和R2所列基團)可見相關報道(K.Lau, H.Yu, V.Thon, Z.Khedri, M.E.Leon, B.K.TranandX.Chen, Org.Biomol.Chem., 2011, 9, 2784 ；H.Yu, H.Yu, R.KarpelandX.Chen.Bioorg.Med.Chem.12, 2004, 6427)。但是，基于之前對 α 2, 6 唾液酸轉移酶在上述三糖上引入第二個唾液酸的實驗，發現α 2，6唾液酸轉移酶不能區分核心二糖 Galii (1-3) GalNAc的半乳糖(Gal)或乙酰氨基半乳糖(GalNAc)，為解決此關鍵性問題，我們運用化學手段合成了內酯三糖[具體見步驟(4)]，實現了對非還原末端二糖構象的鎖定，使構象改變的半乳糖不再是α2，6唾液酸轉移酶(PdST)的最適底物；通過步驟(5)，發現α2，6唾液酸轉移酶(PdST)還能以內酯三糖作為底物，高效的對還原端的乙酰氨基半乳糖進行唾液酸化；通過步驟(6)，實現了目的雙唾液酸四糖的高效合成。而且，通過步驟(4) 和步驟(5)，擴充了 α 2，6唾液酸轉移酶的底物適應范圍，利用內酯進行酶法合成也未見相關報道。[0016]所述步驟(1)中的β_構型的N-乙酰氨基半乳糖苷采用以下方法合成:將半乳糖氨鹽酸鹽與醋酐進行反應后，將其全部羥基用乙酰基保護；然后在微波條件下進行β_構型糖苷化反應，然后依次疊氮化和脫保護后即得可作為下步酶反應受體的N-乙酰氨基半乳糖苷(圖8)。[0017]所述步驟(2)中的二糖Gaie (1-3) GalNAc O R1合成方法是:將化合物1、半乳糖 (1.5-3.0 當量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP) (1.5-5.0 當量),MgCl2 (5-100mmol) ,Tris-HCl 緩沖液(10-500mmol，pH5.0-10.0)配制水溶液，將反應體系的pH值調節至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶(GalK)和己糖磷酸化酶(BiGalHexNAcP)，待反應完成后，純化即可直接獲得二糖化合物II。[0018]所述當量是指物質相互作用時的物質的量的比值，如:半乳糖(1.5-3.0當量)的含義即為:半乳糖與化合物I的物質的量的比為1.5-3.0。下同。[0019]所述步驟(3)中的α 2，3唾液酸化二糖的合成方法:將化合物I1、唾液酸(Neu5Ac) (1.5-5.0 當量)、胞苷三磷酸(CTP) (0.5-10.0 當量)'MgCl2 (5.0-1OOmmol)和 Tris-HCl 緩沖液(10-500mmOl，pH5.0-10.5)配制水溶液，加入CMP-唾液酸合成酶和α 2，3唾液酸轉移酶，實現“一鍋雙酶法”唾液酸化，反應完成后，純化即可直接獲得化合物III。[0020]所述反應完成采用薄層色譜法(TLC)跟蹤反應進程，展開劑為 EA:CH3OH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.1 來檢測。[0021]所述步驟(4)中α 2，3唾液酸化內酯三糖合成方法是:在冰浴的條件下，加入化合物II1、吡啶、醋酐，反應5-24小時后旋蒸蒸干，拌入硅膠，柱分離純化，得到全乙酰化的化合物IV。之后將全乙酰化的中間體溶于甲醇，加入甲醇鈉粉末，使反應體系的pH值保持7-9 大約5-10小時，然后柱分離純化即得化合物IV。[0022]所述反應完成采用薄層色譜法(TLC)跟蹤反應進程，展開劑為 EA:CH3OH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.1 來檢測。
[0023]所述步驟(5)中雙唾液酸化四糖的合成方法是:將化合物IV、CMP-唾液酸(CMP-Neu5Ac) (1.5-5.0 當量)、MgCl2 (5.0-lOOmmol)和 Tris-HCl 緩沖液(10-500mmol, pH5.0-10.5)配制水溶液，加入α 2，6唾液酸轉移酶，實現酶法唾液酸化，反應完成后，純化即可直接獲得化合物V。[0024]所述步驟(6)中將化合物V溶于氫氧化鈉水溶液(0.1-1mol)中，反應2_12小時， 純化即可直接獲得化合物VI。[0025]當然，可以制備本發明化合物堿加成的鹽，這些鹽包括在發明之中。[0026]所述步驟(2)中“一鍋雙酶法”中先后用到的酶分別是 Ε.coliK_12galactokinase (GalK)和Bifidobacterium infantis D-galactosyl- β 1-3-Ν-acetyl-D-hexosamine phosphorylase (BiGalHexNAcP),反應時間為 3-72 小時。[0027]所述步驟(3)中“一鍋雙酶法”唾液酸化中用到的酶是 NeisseriameningitidisCMP-sialic acid synthetase (NmCSS)和 Pasteurella multocida sialyl transferase I (PmSTl)，反應時間為 5 分鐘-30 小時。[0028]所述步驟(2)和步驟(3)中“一鍋雙酶法”合成中反應溫度為0_37°C，轉速為 0-240r/min ;所述酶反應的停止方法是向反應中加入與反應液等體積的4°C無水乙醇并在 4°C下孵育0-30分鐘。[0029]本發明還提供了兩種用于合成制備雙唾液酸化四糖的中間體，分別為通式IV、V 所示的化合物。[0030]本發明提供了一種高效簡捷的化學可控的酶法合成雙唾液酸化的四糖的合成方法。本發明將化學合成法的靈活性和酶合成法的高區域選擇性和高效性結合到一起，首次實現了用化學干預的方法合成雙唾液酸化四糖的合成，解決了目前化學合成雙唾液酸化四糖的所面臨的底物反應活性低、合成步驟繁多、收率低等不足，以及酶法中唾液酸轉移酶獲得困難和只對糖肽識別的問題，具有底物反應活性高、收率高的優點，因而，本發明為在分子水平上研究唾液酸糖苷的生物功能和發展以此為基礎的糖藥物具有重要意義。【專利附圖】

【附圖說明】[0031]圖1:雙唾液酸化四糖的結構。[0032]圖2:通式I所示化合物。[0033]圖3:通式II所示化合物。[0034]圖4:通式III所示化合物。[0035]圖5:通式IV所示化合物。[0036]圖6:通式V所示化合物。[0037]圖7:通式VI所示化 合物。[0038]圖8:化學法合成β -構型的單糖化合物I的反應方程式。[0039]圖9 一鍋雙酶法”合成二糖化合物通式II的反應方程式(現有技術)。[0040]圖:10 一鍋雙酶法”合成二糖化合物2的反應方程式。[0041]圖11 一鍋雙酶法”合成三糖化合物通式III的反應方程式(現有技術)。[0042]圖12 一鍋雙酶法”合成三糖化合物3的反應方程式。[0043]圖13:化學法合成內酯三糖4的反應方程式。[0044]圖14:酶法法合成內酯四糖5的反應方程式。[0045]圖15:化學法合成雙唾液酸四糖6的反應方程式。【具體實施方式】[0046]下面結合具體實施例和附圖對本發明作進一步的闡述。應該說明的是，實施例僅是示范性的，并不對本發明構成任何限制。[0047]本發明中所提及的化合物1、2、3、4、5、6分別對應于R1為疊氮取代烷基、R2為氮乙酰氨基、R3為氮乙酰氨基的通式1、11、111、1￥、乂、/1的化合物。[0048]下述實施例中所涉及的反應原料、溶劑等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規產品，所涉及的合成方法、工藝，若無特別說明，均為所屬領域的常規技術手段。[0049]實施例1化學酶法合成雙唾液酸化四糖[Neu5Ac α (2-3) Gal β (1-3) [Neu5Ac α (2-6)]GalNAc][0050]步驟如下:[0051 ] (I)化學法合成β -構型的單糖衍生物1:[0052]化合物I (GalNAc β ProN3)的合成[0053]反應方程式如圖8所示；[0054]向500mL圓底燒瓶中，加入半乳糖氨鹽酸鹽(8.0g, 37.1mmol)、醋酐(38mL)、批啶(160mL)、二甲氨基吡啶(DMAP，0.3g，2.46mmol)，室溫攪拌12小時。薄層色譜檢測 (EA:MeOH=IO:1)反應完全后,旋蒸濃縮,之后向反應液中加入甲苯20mL,旋蒸濃縮，反復進行3次。所得固體復溶于300mL甲醇，在4°C條件下靜置12小時重結晶。過濾，棄除濾液， 收集所得固體，干燥，獲得白色固體化合物7(11.7g, 84%)。[0055]向容積為IOmL的微波專用反應管中，加入化合物7 (1.00g，2.57mmol)、1,2-二氯乙燒(5mL)、1-氯-3-丙醇(0.34mL, 5.14mmol),、硫酸-硅膠(17mg)，磁子攪拌，微波條件下110°C反應15分鐘。按照相同的反應條件，平行開5組相同的反應。之后收集反應液，過濾，二氯甲烷沖洗，濾液用飽和碳酸氫鈉溶液萃取兩次，半飽和食鹽水萃取一次，之后分離有機相，再用無水硫酸鈉干燥有機相，過濾，蒸干，獲得白色固體化合物8(5.45g, 92%)。[0056]向250mL圓底燒瓶中加入化合物8 (4.82g, 11.4mmol)、N, N-二甲基甲酰胺(70mL)、 疊氮鈉(3.7g, 56.9mmol)，110°C攪拌回流12小時。薄層色譜檢測(PE:EtOAc=1: 8)反應完全后，使用硅藻土過濾，二氯甲烷沖洗，半飽和食鹽水40mL萃取，反復三次，再用無水硫酸鈉干燥有機相，旋蒸濃縮，獲得棕色糖漿狀化合物9 (4.4g, 90%)。[0057]向250mL圓底燒瓶中加入化合物9、甲醇(60mL)、甲醇鈉，直至溶液體系pH 值到9.5左右，室溫攪拌4小時，薄層色譜檢測(EtOAc:MeOH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.2) 反應完全后，旋蒸濃縮，快速柱分離純化，得到白色固體化合物I (3.96g, 91%)。 參數如下:1 關MR(600MHz, D2O) δ 4.40 (d, J=8.4Hz, 1H)，3.94 (dt, J=I0.8，5.6Hz, 1H) , 3.89 (d, J = 3.1 Hz, 1H) , 3.83 (dd, J=19.6, 10.9 Hz, IH), 3.80-3.70 (m, 2H)，3.68 (dd, J=I0.8，3.2Hz, 1H), 3.65 - 3.60 (m, 2H), 3.43 - 3.27 (m, 2H)，2.04 (s, 3H), 1.80 (m, 2H).[0058](2) “一鍋雙酶`法”合成二糖化合物 2 [Gal β (1-3)GalNAc β ProN3][0059]“一鍋雙酶法”的一般操作方法如圖9所示(現有技術中的方法)；[0060]本發明的化合物2 [Gal β (1-3) GalNAc β ProN3]的合成[0061 ] 反應方程式如圖10所示；[0062]將受體化合物I (200mg)、半乳糖(176mg)、ATP (540mg)、Tris-HCl 緩沖液 (lOOmmol, pH7.5)和氯化鎂(20mmol) (Tris和氯化鎂的用量由最終反應液的體積來計算確定)溶于 50mL 離心管中，加入 GalK (7.2-8.0mg)和 BiGalHexNAcP (8.5 - 11.0mg)，加雙蒸水至總體積30mL后，將反應體系置于搖床中，37°C、140r/min孵育48小時。薄層色譜 EtOAc:MeOH:H2O:EtOH=4:2:1:0.2跟蹤檢測反應完成后，加入與反應體系等體積的無水乙醇4°C、140r/min孵育30min以終止反應。然后將反應體系4°C、12000r/min離心10分鐘， 收集上清液，旋蒸濃縮，通過硅膠柱快速柱分離，獲得白色化合物2 (1.03g, 83%)。參數如下: 1HNMR (600MHz, D2O) δ 4.45 (d, J=8.4Hz, 1H)，4.40 (d, J=7.8Hz, 1H)，4.14 (s, 1H)，3.95 (t, J=9?3Hz, 2H)，3.86 (s, 1H)，3.82 (d, J=I0.8Hz, 1H), 3.79 - 3.68 (m, 4H)，3.65 (d, J=3.5Hz, 2H)，3?62 (s, 1H)，3.57 (d, J=I0.0Hz, 1H)，3.48 (t, J=8.4Hz, 1H)，3.34 (s, 2H)，1.99 (s, 3H)，1.80 (s ，2H).[0063](3) “一鍋雙酶法”合成三糖化合物 3 [Neu5Ac α (2-3) Gal β (1-3) GalNAc β ProN3][0064]“一鍋雙酶法”唾液酸化的一般操作方法如圖11所示(現有技術中的方法);[0065]本發明的化合物3 [Neu5Ac α (2-3) Gal β (1-3) GalNAc β ProN3]的合成[0066]反應方程式如圖12所示；[0067]向50mL離心管中，加入由“一鍋雙酶法”合成得到的二糖受體2(0.22g, 0.47mmol)、N-乙酰神經氨酸(Neu5Ac，0.22g)、胞苷三磷酸(CTP, 0.44g)、 Tris-HCl緩沖液(lOOmmol, pH8.5)和氯化鎂(20mmol) (Tris和氯化鎂的用量由最終反應液的體積來計算確定)，加雙蒸水調節總體積為20mL，振動攪勻后加入酶 NmCSS(3-6mg)和 PmSTl (0.2-0.6mg)，在 37 °C、140r/min 條件下孵育 0.5 小時。薄層色譜(EA:CH3OH:H2O:H0Ac=4:2:1:0.1)跟蹤檢測反應完成后，加入與反應體系等體積的無水乙醇，4°C、140r/min孵育0.5h中止反應。之后將反應體系4°C、12000r/min離心10分鐘，收集上清液。旋蒸濃縮，通過快速柱分離，獲得白色化合物3(1.04g，97%)。參數如下: 1HNMR (300MHz, D2O) δ 4.54 (d, J=8.4Hz, 1H,), 4.52 (d, 1H, J=7.8Hz)，4.20 (d, J=3.3Hz, 1H)，4.09 (dd, J=9.9，3.1Hz, 1H), 4.06 - 4.01 (m, 1H)，3.99 (d, J=4.1Hz, 1H)，3.95 (d, J=3.1Hz, 1H), 3.91 (dd, J=5.8，2.8Hz, 2H)，3.86 (dd, J=6.0，2.9Hz, 2H), 3.84 - 3.81 (m, 1H)，3.81 -3.77 (m, 2H), 3.77 - 3.50 (m, 13H)，3.41 (t, J=6.6Hz, 2H)，2.77 (dd, J=12.6，4.5Hz, 1H)，2.04 (d, J=5.7Hz, 6H), 1.88 (dd, J=12.8，6.4Hz, 2H), 1.80 (t, J=I 1.7Hz, 1H).[0068]( 4 )化學法合成內酯三糖4[0069]化合物3-疊氮丙基-[5-乙酰氨基-3，5- 二脫氧_D_甘油- α -吡喃九碳酮糖酸-(I ”一 4’)-內酯]-(2 — 3) -O- β -D-吡喃半乳糖基-(I — 3) - β -D-2-乙酰氨基_2_脫氧-β -D-吡喃半乳糖苷4的合成[0070]反應方程式如圖13所示；[0071]向50mL圓底燒瓶中加入化合物3 (130mg)、醋酐(ImL)、吡啶(2mL)，冰浴條件下攪拌12h。薄層色譜檢測(EA:Me0H=10:1)反應完全后，旋蒸濃縮，之后向反應液中加入2mL甲苯，旋蒸濃縮，反復進行3次。之后，通過快速柱分離，獲得白色化合物10(160mg，87%)。[0072]向50mL圓底燒瓶中加入化合物IO(IlOmg)、甲醇(5mL),室溫下攪拌溶解，再加入甲醇鈉，薄層色譜(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.1)跟蹤檢測反應完成后，旋蒸濃縮，通過快速柱分離，獲得白色化合物4 (38mg, 49.4%)。參數如下:1HNMR (600MHz，D2O) δ 4.53 (d, J=7.8Hz, 1H)，4.46 (d, J=9.0Hz, 1H)，4.32 - 4.19 (m, 2H)，4.08 (s, 1H)，4.01 -3.94 (m, 1H)，3.93 (t, J=5.9Hz, 1H)，3.85 (dd, J=18.5，8.3Hz, 2H), 3.82 - 3.79 (m, 1H)，3.7-8 (d, J = 5.5Hz, 1H) , 3.76 - 3.68 (m, 3H) , 3.64 (dd, J=I0.8, 6.1Hz，2H)，3.62 -3.56 (m, 3H), 3.54 - 3.49 (m, 3H)，3.33 (dd, J=17.0，10.5Hz, 3H)，2.55 (dd, J=13.3，5.2Hz, I H) ,2.12- 1.95 (m, 5H)，1.77 (dt, J=35.8，14.7Hz, 3H).[0073]( 5 )酶法法合成內酯四糖5[0074]化合物3-疊氮丙基-[5-乙酰氨基-3，5- 二脫氧_D_甘油-α -2-吡喃九碳酮糖酸-(I ”一 4’)-內酯]-(2 — 3) -O- β -D-吡喃半乳糖基-(I — 3) - [ (5-乙酰氨基 _3，5- 二脫氧-D-甘油-β -D-吡喃九碳酮糖酸)-(2 — 6) - β -D-2-乙酰氨基-2-脫氧-β -D-吡喃半乳糖苷5的合成[0075]反應方程式如圖14所示；[0076]向50mL離心管中，加入內酯三糖受體4(40mg, 0.05mmol)、胞苷二磷酸-N-乙酰神經氨酸(CMP-Neu5Ac，0.17mmol )、雙蒸水(4mL)，調節溶液pH值至中性，加入酶 PdST (0.75mg)，加雙蒸水調節總體積為8mL，在37°C、140r/min條件下孵育2小時。薄層色譜(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.I)跟蹤檢測反應完成后，旋蒸濃縮，通過快速柱分離， 獲得白色化合物 5(48mg, 86%)。參數如下:1HNMR(600MHz, D2O) δ 4.50 (d, J=7.8Hz, 1H), 4.43 (d, J=8.4Hz, 1H), 4.26 - 4.21 (m, 1H)，4.11 (d, J=2.6Hz, 1H)，3.98 - 3.86 (m, 4H)，3.86 -3.79 (m, 4H), 3.78 - 3.69 (m, 4H), 3.68 - 3.55 (m, 9H), 3.55 - 3.46 (m, 5H), 3.36 - 3.27 (m, 2H )，2.67 (dd, J=12.4，4.4Hz, 1H)，2.54 (dd, J=13.4，5.4Hz, 1H)，1.99 (dd, J=16.9，13.5Hz, 7H)，1.86 (s, 9H)，1.82 - 1.71 (m, 3H)，1.64 (t, J=12.6Hz, 1H).[0077](6)化學法合成雙唾液酸化四糖6[0078]化合物3-疊氮丙基-[(5-乙酰氨基-3，5- 二脫氧_D_甘油- α -吡喃九碳酮糖酸)-(2 — 3) ] - β -D-吡喃半乳糖基-(I — 3) [ (5-乙酰氨基-3，5- 二脫氧-D-甘油-α -吡喃九碳酮糖酸)-(2 — 6) ] - β -D-2-乙酰氨基-2-脫氧-β -D-吡喃半乳糖苷6的合成[0079]反應方程式如圖15所示；[0080]向50mL圓底燒瓶中加入化合物5 (35mg, 0.03mmol), ImolNaOH溶液(ImL),攪拌 4小時，薄層色譜(EA:CH30H:H20:H0Ac=4:2:1:0.I)跟蹤檢測反應完成后，加入Imol鹽酸中和反應液，之后溶液過0.22 μ m的微孔濾膜，通過Bio-gelP2凝膠分子排阻色譜進行組合純化，獲得純品化合物6 (34.8mg, 98%)。參數如下=1HNMR(300MHz, D2O) 54.51 (dd, J =8.1, 4.2Hz, 2H), 4.21 (d, J=2.9Hz, 1H)，4.13 - 4.05 (m, 1H)，4.05 - 4.00 (m, 1H)，4.00 -3.93 (m, 3H), 3.91 (d, J=2.5Hz, 1H) , 3.91 - 3.87 (m, 3H) , 3.87 - 3.84 (m, 2H) , 3.81 (t, J=3.9Hz, 1H)，3.77 (d, J=3.7`Hz, 1H), 3.75 - 3.70 (m, 4H), 3.70 - 3.57 (m, 9H)，3.54 (dd ，J=7.2，2.5Hz, 1H)，3.39 (dd, J=Il.8，5.1Hz, 2H)，2.85 - 2.67 (m, 2H)，2.05 (s, 9H)，1.87 (dd ，J=12.5，6.1Hz, 2H)，1.80 (t, J=7.9Hz, 1H)，1.70 (dd, J=14.6，9.5Hz, 1H).
【權利要求】
1.雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟如下:(1)利用化學法合成β-構型的N-乙酰半乳糖胺，結構如通式I所示，其中=R1為氫原子、α -或β -構型絲氨酸殘基、α -或β -構型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、 疏基取代烷基或Ct -或β -構型取代烷基；(2)利用“一鍋雙酶法”將通式I的化合物和半乳糖立體選擇性偶聯合成二糖 Gal^ (l^GalNAcOR1，結構如通式II所示，所述“一鍋雙酶法”中先后用到的酶分別為半乳糖激酶和己糖磷酸化酶；其中=R1為氫原子、α -或β -構型絲氨酸殘基、α -或β -構型蘇氣酸殘基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或α-或β _構型取代烷基； (3)利用“一鍋雙酶法”合成通式III的三糖，所述“一鍋雙酶法”唾液酸化中用到的酶指 CMP-唾液酸合成酶和α 2，3唾液酸轉移酶；其中=R1為氫原子、α-或β-構型絲氨酸殘基、 α-或β-構型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或β-構型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；(4)利用乙酰化和選擇性脫乙酰基的方法，合成含唾液酸的內酯三糖，結構如通式IV所示，其中=R1為氫原子、α-或β-構型絲氨酸殘基、α-或β-構型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或ct -或β -構型取代烷基；R2為氣原子、氣乙酸氣基、 氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；(5 )利用酶法合成雙唾液酸化內酯四糖，結構如通式V所示，所述酶法唾液酸化中用到的酶指α 2，6唾液酸轉移酶；其中=R1為氫原子、α -或β -構型絲氨酸殘基、α -或β -構型蘇氣酸殘基、置氣取代烷基、炔基取代烷基、疏基取代烷基或α-或β_構型取代烷基；R2 為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；(6)堿性水溶液中水解上述雙唾液酸化四糖的內酯，得到雙唾液酸化四糖，結構如通式 VI所示，其中=R1為氫原子、α-或構型絲氨酸殘基、α-或構型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或β-構型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮。
2.根據權利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(1)中的β -構型的N-乙酰半乳糖胺采用以下方法合成:將半乳糖氨鹽酸鹽與醋酐進行反應后， 將其全部羥基用乙酰基保護；然后在微波條件下進行β_構型糖苷化反應，然后依次疊氮化和脫保護后即得。
3.根據權利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(2)中的二糖Gal β (1-S)GalNAcOR1合成方法是:將化合物1、半乳糖(1.5-3.0當量)、腺嘌呤核苷三磷酸(ATP) (1.5-5.0當量)、MgCl2 (5-100mmol)、Tris-HCl緩沖液 (10-500mmol, pH5.0-10.0)配制水溶液，然后將反應體系的pH值調節至4.5-8.5，然后添加半乳糖激酶和己糖磷酸化酶，待反應完成后，純化即可直接獲得二糖化合物II。
4.根據權利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(3)中的α 2，3唾液酸化二糖的合成方法:將化合物I1、唾液酸(1.5-5.0當量)、胞苷三磷酸 (0.5-10.0 當量)、MgCl2 (5.0-1OOmmol)和 Tris-HCl 緩沖液(10-500mmol, ρΗ5.0-10.5)配制水溶液，加入CMP-唾液酸合成酶和α 2，3唾液酸轉移酶，實現“一鍋雙酶法”唾液酸化，反應完成后，純化即可直接獲得化合物III。
5.根據權利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(4)中 α 2，3唾液酸化內酯三糖合成方法是:在冰浴的條件下，加入化合物II1、吡啶、醋酐，反應 5-24小時后旋蒸蒸干，拌入硅膠，柱分離純化，得到全乙酰化的化合物IV ;之后將全乙酰化的中間體溶于甲醇，加入甲醇鈉粉末，使反應體系的pH值保持在7-9，反應5-10小時,然后柱分離純化即得化合物IV。
6.根據權利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(5)中雙唾液酸化四糖的合成方法是:將化合物IV、CMP-唾液酸(1.5-5.0當量)、 MgCl2(5.0-1OOmmol)和 Tris-HCl 緩沖液(10-500mmol, ρΗ5.0-10.5)配制水溶液，加入 α 2，6唾液酸轉移酶，實現酶法唾液酸化，反應完成后，純化即可直接獲得化合物V。
7.根據權利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(6)中將化合物V溶于氫氧化鈉水溶液(0.1-1mol)中，反應2-12小時，純化即可直接獲得化合物 VI。
8.根據權利要求1所述的雙唾液酸化四糖的合成方法，其特征在于:所述步驟(2)和步驟(3)中“一鍋雙酶法”合成中反應溫度為0-37°C，轉速為0-240rpm ;所述酶反應的停止方法是向反應體系中中加入與反應液等體積的4°C無水乙醇并在4°C下孵育0-30分鐘。
9.一種用于制備雙唾液酸化四糖的中間體，其特征在于:結構如通式IV所示，其中，R1 為氫原子、α-或構型絲氨酸殘基、α-或構型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或構型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮。
10.一種用于制備雙唾液酸化四糖的中間體，其特征在于:結構如通式V所示，其中，R1 為氫原子、α-或構型絲氨酸殘基、α-或構型蘇氨酸殘基、疊氮取代烷基、炔基取代烷基、巰基取代烷基或α-或構型取代烷基；R2為氟原子、氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮；R3為氟原子、 氮乙酰氨基、氮羥基乙酰氨基 、氮疊氮乙酰氨基、羥基或疊氮。
【文檔編號】C07H15/04GK103555796SQ201310508766
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月24日 優先權日:2013年10月24日
【發明者】曹鴻志, 王鳳山, 孟欣 申請人:山東大學