抗磷脂酶d4抗體的制作方法
【專利摘要】結合磷脂酶D4(PLD4)蛋白的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段。NITE BP-12112012.01.27NITE BP-12142012.01.27NITE BP-12132012.01.27NITE BP-12122012.01.27
【專利說明】抗磯脂酶D4抗體

【技術領域】
[0001] 本發明涉及結合磯脂酶D4的抗體。在下文中，"磯脂酶D"可被縮寫為PLD，并且 "磯脂酶D4"等可被縮寫為PLD4等。
[000引背景領域
[0003] 干擾素（在下文中，"干擾素"可被縮寫為IFN)是抗病毒免疫反應中最重要的細 胞因子。人血中的干擾素生成細胞（IPC JPC是未分化的基于淋己細胞的樹突細胞，其被定 位為樹突細胞值C)的前體細胞。IPC還可稱為漿細胞樣樹突細胞或漿細胞樣樹突狀細胞 (PDC)。此后，在本說明書中，IPC和pDC是同義的，并且在下文中一律W術語pDC相稱），表 達CD4和主要組織相容性復合物II類蛋白。然而，由于不充分的該樣的細胞的數量、快速 細胞調亡和另外地譜系（系統）標志物的缺乏，直至現在仍未進行細胞的分離或具體表征。 已發現pDC為樹突細胞的CD4+CD11(T2型前體細胞，并且發現在微生物的刺激后pDC產生的 IFN比其它血細胞產生的IFN要高200至1000倍。因此，pDC為抗病毒/抗腫瘤免疫反應 中的決定性免疫系統效應細胞。
[0004] IFNa和IFN目被稱為I型IFN，其具有抗病毒活性或抗腫瘤活性。在另一方面，已 發現IFNa與自身免疫疾病相關。例如，已報導具有自身免疫疾病例如系統性紅斑狼瘡和 慢性類風濕關節炎的患者中的IFNa的異常產生。此外，已報導了其中在施用重組IFNa 2 或IFN后自身免疫疾病癥狀表達或加重的病例。還已提出自身免疫癥狀可能通過IFNa的 中和來緩和。
[0005] 此外，還已顯示IFNa誘導樹突細胞值C)的分化。已預期樹突細胞的分化的誘 導構成了自身免疫疾病的重要機制，因為樹突細胞是抗原呈遞細胞。事實上，已有人提出 IFNa的樹突細胞分化的誘導與系統性紅斑狼瘡的發生深度相關。如上所述，已指出了 IFNa與自身免疫疾病W及抗腫瘤活性的密切關系。此外，IFNa還與銀屑病的發生深度相 關。
[0006] 僅少數pDC存在于血液中。預期占據外周血淋己細胞的pDC的比率為1 %或更少。 然而，pDC具有極高的IFN產生能力。pDC的IFN產生能力達到例如3000pg/mL/104個細胞。 也就是說，可認為在病毒感染時在血液中產生的大多數IFNa或IFN目由pDC引起，盡管細 胞數目很少。
[0007] pDC通過病毒刺激分化成樹突細胞，并且誘導T細胞產生IFN-Y或白細胞介素 (IL)-10。此外，pDC還通過IL-3刺激分化成樹突細胞。在IL-3刺激后分化的樹突細胞誘 導T細胞產生化2細胞因子（比-4、比-5、比-10)。如上所述，pDC具有該樣的性質；取決于 刺激的不同其分化成不同的樹突細胞。
[0008] 因此，pDC是具有個方面的細胞，即一方面作為IFN生成細胞，另一方面作為樹突 細胞的前體細胞。細胞的任一方面在免疫系統中都起著重要作用。目P，pDC是在各個方面 支持免疫系統的重要細胞之一。
[0009] 在體液因子例如IFN的活性調節中，識別所述因子的抗體的施用是有效的。例如， 利用抗IL-I或IL-4抗體治療自身免疫疾病的嘗試是實用的。此外，也類似地對于IFN，中 和抗體被當作自身免疫疾病的治療劑。可預期相似的方法對于IFN生成pDC是有效的。然 而，該樣的方法基于在產生后體液因子的作用的抑制。如果期望的體液因子的產生可被直 接控制，則可獲得進一步的基本療效。
[0010] 已報導了識別人pDC的抗體。例如，抗-抓CA-2單克隆抗體為人pDC-特異性 單克隆抗體值zionek,A.等人 J. Immunol, 165:6037-6046,2000)。已發現抗-BDCA-2 單 克隆抗體具有抑制人pDC的IFN產生的作用（J. Exp. Med. 194 :1823-1834, 2001)。此外， 還已報導識別小鼠干擾素生成細胞的單克隆抗體抑制干擾素的產生炬Iood 2004化n 1:103/11 :4201-4206. Epub 2003Dec)。還已報導小鼠pDC的單克隆抗體減少樹突細胞的數 目 Q. Immunol. 2003, 171 :6466-6477)。
[0011] 類似地，如果提供可識別人pDC并且調節活性的抗體，則其將是有用的。例如，本 發明人已顯示識別Ly49Q的抗體特異性結合小鼠pDC。然而，Ly49Q的抗體不干擾小鼠pDC 的活性炬Iood, 2005年4月1日，第105卷，第7卷，PP. 2787-2792)。
[0012] PLD是催化磯脂醜膽堿的水解反應W產生磯脂酸和膽堿，并且在不同細胞中引起 信號轉導的酶。預期產生的磯脂酸作為脂質信號分子。
[0013] PLDl和PLD2常規地已知為兩種類型的哺乳動物PLD，并且在其N末端區域包含 化OX同源結構域（PX結構域）（其可與磯脂醜肌醇醋鍵合）和血小板白細胞C激酶底物同 源性結構域（pleckstrin homology domain) (PH結構域）。兩個結構域都參與PLD膜祀向。
[0014] PLDl和PLD2還包含兩個His-X-Lys-X-X-X-X-Asp序列（H邸基序）。該H邸基序 是PLD活性的必需結構域。
[0015] 已預期由PLDl和PLD2產生磯脂酸參與細胞骨架的重構、胞吐作用、吞瞻作用、癌 化、細胞粘附、趨化作用等，并且在神經系統、免疫系統等中起著中樞作用。
[0016] 盡管迄今人化-K4和小鼠SAM9被正式命名為PLD3,但它們缺乏PX和PH結構域， 并且未顯示PLD活性，盡管它們具有2個HKD基序。此外，盡管存在3個PLD家族成員，即 PLD4、PLD5和PLD6,但該些非經典PLD幾乎不為人知。
[0017] 搜索小鼠小腦發育中的基因表達模式的小腦發育轉錄組數據庫（CDT-DB)，作 為其結果，鑒定了 PLD4,其為在發育時受控制的轉錄產物（參見Tao等人，化t. Methods 2巧)，591-598 (2005))。PLD4的基本特征未曾報導。考慮從現在應當確定PLD4是否顯示酶 促活性，W及PLD4的去糖基化形式是否具有PLD活性。
[001引 PLD4為由SEQ ID NO ; 1所示的506個氨基酸的序列（Tao等人，化t. Methods 2(8),591-598(2005)和 Clark 等人，Genome Res. 13 (10) ,2265-2270 (2003))。PLD4 蛋白 具有兩個假定的PDE區域（磯酸二醋酶基序）（其由兩個在C末端區域中保守的HKD基序 化is-x-Lys-x-x-x-x-Asp的氨基酸序列，其中X為其它氨基酸）構成）和假定的磯酸化位 點（T虹472)。PLD4蛋白的結構預測為II型單變跨膜蛋白（monotropic transmembrane protein)。此外，PLD4蛋白的N末端區域不具有PX區域和PH區域，所述區域由為經典PLD 家族的PLDl和PLD2所具有（圖1和2)。
[0019] 在另一個方面，盡管根據其具有兩個HKD基序的事實，PLD4屬于PLD家族，但PLD4 缺乏PX結構域和PH結構域，而是具有替代的假定的跨膜結構域。
[0020] 在優選地位于出生后1周的小鼠的脫腑體和白質區（包括小腦白質）周圍 的細胞亞群中發現了特征性的從低水平至中等水平的PLD4的mRNA表達。該些表達 PUMmRNA的細胞已被鑒定為Ibal陽性小神經膠質細胞（參見Tao等人，化t. Methods 2巧)，591-598(2005))。
[0021] 出生后1周的時期是當髓磯脂形成的活化在小鼠的脫腑體和小腦白質中開始時 的時期。在該時期中，PLD4在存在于白質中的變形蟲樣（活化狀態）小神經膠質細胞中高 度表達。根據該些事實，預期了白質中的PLD4表達細胞在該時期參與髓磯脂形成的可能 性。特別地，PLD4在吞瞻小泡中的積累變得明顯，并且提出了化D4表達細胞參與吞瞻作用 的可能性。從處于活化狀態的變形蟲樣小神經膠質細胞，各種細胞因子或生長因子被分泌， 吞瞻作用也被活化。預期額外的少突膠質細胞（中樞神經系統中的神經膠質細胞，其形成 包卷和連接至軸突的髓磯脂）在發育階段引起腦的白質中的細胞調亡。已預期了該樣的可 能性；額外的少突膠質細胞被降解并從變形蟲樣小神經膠質細胞被除去W分泌信號分子， 從而安排在白質中髓磯脂形成的環境。已提出PLD4參與該些過程，包括髓磯脂形成。
[0022] PUMmRNA表達也普遍地見于非神經組織中，但主要分布在脾中。在脾紅髓的邊緣 帶周圍檢測到強PLD4表達，并且從細胞的膜級分收集的脾PLD4蛋白被高度N-糖基化。當 PLD4在異質性細胞系統中表達時，它們位于內質網和高爾基體中。異源表達的PLD4未顯示 PLD 酶促活性（Plos ONE WWW. plosone. org, November 2010,第 5 卷，Issue 11, el3932)。
[0023] 根據在時間和位置方面受限的PLD4表達的模式，已提出PLD4在出生后最初階段 的腦發育時期在小神經膠質細胞或脾邊緣區的細胞的共同功能中起作用。
[0024] 上文中已概述了神經組織和非神經組織中PUMmRNA的表達和PLD4分布。然而， 本發明人發現PUMmRNA W下文中描述的細胞種類的水平在處于靜止期的pDC(靜息pDC) 中特異性高度表達。
[00巧]抗全長人PLD4蛋白的小鼠抗-人PLD4多克隆抗體是商購可得的（PLD4純化的 Max化b小鼠多克隆抗體炬Ol巧，目錄號冊0122618-B01P，由Abnova Co巧oration生產的）。 然而，一直未獲得僅結合PLD4的特定位點的單克隆抗體或可特異性結合PLD4的單克隆抗 體。
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[00測發明概述
[0040] 技術問題
[0041] 待由本發明解決的問題是提供結合PLD4的抗體，和檢測、鑒定或分離pDC。此外， 待由本發明解決的問題是調節PDC的活性。
[004引 問題的解決
[0043] 本發明人通過PLD4的研究確認了 PLD4的表達在pDC，特別地，除了處于活化期的 PDC W外，處于靜止期的pDC中特異性升高。因此，本發明人嘗試制備PLD4抗體和闡明其作 用。
[0044] 為了獲得識別少量來源于活生物體的蛋白質的抗體，通常將通過基因重組技術制 備的蛋白質用作免疫原。本發明人嘗試基于已被顯示（化t. Methods 2巧)，591-598 (2005)) 的PUMcDNA的堿基序列和由其編碼的氨基酸序列佑enBank登錄號NM_138790. 2)的信息 表達化D4。
[0045] 為了獲得蛋白質的抗體，通常嘗試將天然蛋白質的部分氨基酸序列用作免疫原。 然而，為了獲得識別細胞表面上的分子的抗體，必需選擇構成被抗體識別為細胞表面上的 表位的部分的區域。因此，已預期使用片段氨基酸序列作為免疫原來獲得特異于PLD4的抗 體是不現實的。
[0046] 在該樣的情況下，本發明人顯示特定免疫原的使用允許獲得結合pDC的抗體。此 夕F，本發明人確認了所獲得的抗體特異性識別人PDC，并且還具有調節其活性的作用，從而 完成了本發明。目P，本發明涉及下文中描述的抗-PLD4抗體、其制備方法及其用途。
[0047] 本發明如下：
[004引 （1)結合磯脂酶D4(PLD4)蛋白的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段。
[0049] (2)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區 中具有作為 CDRl 的序列 SYWMH(SEQ ID NO ;2)、作為 CDR2 的序列 DIYPGSDSTNY肥KFKS(SEQ ID NO ;3) W及作為 CDR3 的序列 GGWLDAMOT(SEQ ID NO ;4)。
[0050] (3)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區 中具有作為CDRl的序列RAS孤ISNYLN(SEQ ID NO ;5)、作為CDR2的序列YTSRLHS (SEQ ID NO ;6)，W及作為 CDR3 的序列 QQGNTLPW(SEQ ID NO ;7)。
[0051] (4)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區 中具有作為CDRl的序列SYWMH、作為CDR2的序列DIYPGSDSTNYNEKFKS W及作為CDR3的 序列GGWLDAMDY，和在輕鏈可變區中具有作為CDRl的序列RAS孤ISNYLN、作為CDR2的序列 YTSRLHS W及作為 CDR3 的序列 QQGNTLPW。
[0052] 妨上述（1)中描述的單克隆抗體（3B4抗體）或包含其抗原結合區的片 段，其在重鏈可變區中具有作為CDRl的序列TYWMH(SEQ ID N0;8)、作為CDR2的序列 AIYPGNSETSYNQKFKG(SEQ ID N0;9) W及作為 CDR3 的序列 6￥50抑^569 ID N0;10)。
[0053] (6)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區 中具有作為 CDRl 的序列 HASQGIRSNIG(SEQ ID NO ;11)、作為 CDR2 的序列 HGTNL邸(SEQ ID NO ;12) W及作為 CDR3 的序列 VQYVQFP(SEQ ID NO ;13)。
[0054] (7)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區 中具有作為CDRl的序列TYWMH、作為CDR2的序列AIYPGNSETSYNQKFKG W及作為CDR3的序 列GYSD抑Y，和在輕鏈可變區具有作為CDRl的序列HASQGIRSNIG、作為CDR2的序列HGTNL邸 W及作為CDR3的序列VQYVQFP。
[0055] 做上述（I)中描述的單克隆抗體巧B7抗體）或包含其抗原結合區的片段， 其在重鏈可變區中具有作為CDRl的序列DYNLH(SEQ ID N0;14)、作為CDR2的序列 YIYPYNGNTGYNQKFKR(SEQ ID N0;15) W 及作為 CDR3 的序列 GGIY 孤 YYDYAIOT(SEQ ID NO: 16)。
[0056] (9)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區 中具有作為 CDRl 的序列 RASENIYSHIA(SEQ ID NO ;17)、作為 CDR2 的序列 GATNLAH(SEQ ID NO ;18) W及作為 CDR3 的序列 QHFWGTP(SEQ ID NO ;19)。
[0057] (10)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區 中具有作為CDRl的序列DYNLH、作為CDR2的序列YIYPYNGNTGYNQKFKR W及作為CDR3的序 列GGIY孤YYDYAIDY，和在輕鏈可變區中具有作為CDRl的序列RASENIY甜IA、作為CDR2的序 列GATNLAH W及作為CDR3的序列QHFWGTP。
[0058] (11)上述（1)中描述的單克隆抗體巧Cll抗體）或包含其抗原結合區的片 段，其在重鏈可變區中具有作為CDRl的序列SYYLY(SEQ ID NO ;20)、作為CDR2的序列 LINPTNSDTIF肥KFKS(SEQ ID N0;21) W及作為 CDR3 的序列 EGGYGYGPFAY(SEQ ID N0;22)。
[0059] (12)上述（I)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區 中具有作為 CDRl 的序列TSSQTLVHSNGNTYLH(SEQ ID NO ;23)、作為CDR2 的序列KVSNRFS(SEQ ID NO ;24) W及作為 CDR3 的序列 HSTHVP(SEQ ID NO ;2W。
[0060] (13)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區 中具有作為CDRl的序列SYYLY、作為CDR2的序列LINPTNSDTIFNEKFKS W及作為CDR3的序 列EGGYGYGPFAY，和在輕鏈可變區具有作為CDRl的序列TSSQTLVHSNGNTYLH、作為CDR2的序 列KVSNRFS W及作為CDR3的序列HSTHVP。
[006。 （14)上述（1)中描述的單克隆抗體（10C3抗體）或包含其抗原結合區的片 段，其在重鏈可變區中具有作為CDRl的序列SYGMS(SEQ ID N0;26)、作為CDR2的序列 TISSGGSYIYYPESVKG(SEQ ID N0;27) W及作為CDR3 的序列LYGGRRGYGLOT(SEQ ID N0;28)。
[0062] (15)上述（I)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區 中具有作為CDRl的序列RSSK化L服DGITYLY (SEQ ID NO ;29)、作為CDR2的序列QMSNLAS (SEQ ID NO ;30) W及作為 CDR3 的序列 AQNLEUSEQ ID NO ;31)。
[0063] (16)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區 中具有作為CDRl的序列SYGMS、作為CDR2的序列TISSGGSYIYYPESVKG W及作為CDR3的序 列LYGGRRGYGLDY，和在輕鏈可變區具有作為CDRl的序列RSSKSUJ1SDGIITLY、作為CDR2的 序列QMSNLAS W及作為CDR3的序列AQNLEL。
[0064] (17)上述（1)中描述的單克隆抗體（13D4抗體）或包含其抗原結合區的片 段，其在重鏈可變區中具有作為CDRl的序列甜YYWT(SEQ ID NO ;32)、作為CDR2的序列 YISYDGSNNYNPSLKN(SEQ ID N0;33) W 及作為 CDR3 的序列 EGPLYYGNPYWY 抑 V(SEQ ID NO: 34)。
[0065] (18)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區 中具有作為 CDRl 的序列 RAS孤IDNYLN(SEQ ID NO ;35)、作為 CDR2 的序列 YTSRLHS (SEQ ID NO ;36) W及作為 CDR3 的序列 QQFNTLP(SEQ ID NO ;37)。
[0066] (19)上述（I)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區 中具有作為CDRl的序列甜YYWT、作為CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN W及作為CDR3的序 列EGPLYYGNPYWYFDV，和在輕鏈可變區中具有作為CDRl的序列RAS孤IDNYLN、作為CDR2的 序列YTSRLHS W及作為CDR3的序列QQFNTLP。
[0067] (20)上述（1)中描述的單克隆抗體（13H11)或包含其抗原結合區的片段， 其在重鏈可變區中具有作為CDRl的序列SHYYWS (SEQ ID NO ;38)、作為CDR2的序列 YISYDGSNNYNPSLKN(SEQ ID N0;39) W 及作為 CDR3 的序列 EGPLYYGNPYWY 抑 V(SEQ ID NO: 40)。
[0068] (21)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區 中具有作為 CDRl 的序列 RAS孤IDNYLN(SEQ ID NO ;41)、作為 CDR2 的序列 YTSRLHS (SEQ ID NO ;42) W及作為 CDR3 的序列 QQFNTLP(SEQ ID NO ;43)。
[0069] (22)上述（1)中描述的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區 中具有作為CDRl的序列甜YYWS、作為CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN W及作為CDR3的序 列EGPLYYGNPYWYFDV，和在輕鏈可變區具有作為CDRl的序列RAS孤IDNYLN、作為CDR2的序 列YTSRL服W及作為CDR3的序列QQFNTLP。
[0070] (23)通過在登錄號；NITE BP-1211、肌TE BP-1212、NITE BP-1213 和 NITE BP-1214 下保藏的雜交瘤mp5B7、mp7B4、mpl3D4和mpl3化1之任一產生的單克隆抗體或包含其抗原 結合區的片段。
[0071] (24)產生上述（1)或（2)中描述的單克隆抗體之任一的雜交瘤。
[0072] (25)在登錄號；NITE BP-121UNITE BP-1212、NITE BP-1213 或 NITE BP-1214 下 保藏的雜交瘤 mp5B7, mp7B4, mpl3D4 或 mpl3Hll。
[0073] (26)制備單克隆抗體的方法，包括培養上述（25)中描述的雜交瘤和從培養物收 集單克隆抗體的過程。
[0074] (27)制備產生結合PLD4的單克隆抗體的細胞的方法，包括下列過程：
[00巧]1)給免疫動物施用編碼包含PLD4細胞外結構域的氨基酸序列的重組PUM-Ig融 合蛋白的過程，和
[0076] 2)從免疫動物的抗體產生性細胞選擇產生結合PLD4的抗體的抗體產生性細胞的 過程。
[0077] (28)上述（27)中描述的方法，其中表達PLD4的細胞是W可表達的方式保留編碼 包含PLD4細胞外結構域的氨基酸序列的外源性多核巧酸的細胞。
[007引 （29)上述（28)中描述的方法，其中細胞為動物細胞。
[0079] (30)上述（29)中描述的方法，其中細胞為人來源的細胞。
[0080] (31)上述（30)中描述的方法，其中人來源的細胞為肥K-293T細胞。
[0081] (32)上述（27)至（31)的任一項中描述的方法，包括遞增地克隆獲得的抗體產生 性細胞的過程。
[0082] (33)制備結合PLD4細胞外結構域的單克隆抗體的方法，包括培養通過上述（29) 中描述的方法獲得的抗體產生性細胞和從培養物收集單克隆抗體的過程。
[0083] (34)識別PLD4的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其可通過下列過程獲 得：
[0084] I)給免疫動物施用編碼包含PLD4細胞外結構域的氨基酸序列的重組PLD4-Ig融 合蛋白的過程，
[0085] 2)從免疫動物的抗體產生性細胞選擇產生結合PLD4的抗體的抗體產生性細胞的 過程，和
[0086] 3)培養過程2)中選擇的抗體產生性細胞，和從培養物收集識別PLD4的抗體的過 程。
[0087] 做）用于制備結合PLD4的抗體的免疫原，其包含（a) W可表達的方式外源性地保 留編碼包含PLD4細胞外結構域的氨基酸序列的多核巧酸的動物細胞，或其細胞膜級分。
[0088] (36)上述（35)中描述的免疫原，其中動物細胞為人來源的細胞。
[0089] (37)檢測漿細胞樣樹突細胞的方法，包括將結合PLD4細胞外結構域的單克隆抗 體或包含其抗原結合區的片段與測試細胞接觸，隨后檢測結合細胞的單克隆抗體或包含其 抗原結合區的片段的過程。
[0090] (38)用于檢測漿細胞樣樹突細胞的試劑，其包含結合PLD4細胞外結構域的單克 隆抗體或包含其抗原結合區的片段。
[0091] (39)抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的方法，包括將下述組分的任一種與漿細胞樣 樹突細胞接觸的過程：
[0092] (a)結合PLD4并抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的單克隆抗體，或包含其抗原結合 區的片段，和
[0093] 化）免疫球蛋白或包含其抗原結合區的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了單克 隆抗體（a)的互補決定區。
[0094] (40)抑制活生物體的漿細胞樣樹突細胞的活性的方法，包括給活生物體施用下述 組分的任一種的過程：
[0095] (a)結合PLD4并抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的單克隆抗體，或包含其抗原結合 區的片段，和
[0096] 化）免疫球蛋白或包含其抗原結合區的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了單克 隆抗體（a)的互補決定區。
[0097] (41)上述（39)或（40)中描述的方法，其中漿細胞樣樹突細胞的活性是干擾素生 成活性和干擾素生成細胞的存活之一，或其兩者。
[0098] (42)用于抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的試劑，其包含下述組分的任一種作為活 性組分：
[0099] (a)結合PLD4并抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的單克隆抗體，或包含其抗原結合 區的片段，和
[0100] 化）免疫球蛋白或包含其抗原結合區的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了單克 隆抗體（a)的互補決定區。
[0101] (43)上述（42)中描述的用于抑制干擾素生成細胞的活性的試劑，其中漿細胞樣 樹突細胞的活性是干擾素生成活性和干擾素生成細胞的存活的任一種，或其兩者。
[0102] 本發明的作用
[0103] 本發明提供了特異性識別PLD4的抗體、在抗體的制備中有用的免疫W及使用免 疫原制備抗-PLD4抗體的方法。PLD4是屬于PLD4家族的膜蛋白。本發明人顯示特異性識 別PLD4的抗體可容易地獲得。可通過本發明獲得的抗-PLD4抗體是具有高度特異性的抗 體，其可區分人pDC與表達其它PLD家族的細胞。
[0104] 在優選方面，由本發明提供的抗-PLD4抗體結合人pDC。此外，本發明的抗體特異 性識別人pDC。因此，本發明的抗體對于pDC的檢測或分離是有用的。pDC是產生大部分I 型IFN的細胞。因此，該樣的檢測或分離在與pDC相關的疾病例如自身免疫疾病的診斷或 研究中是非常重要的。
[0105] 此外，在優選方面，由本發明提供的抗-PLD4抗體具有調節人pDC活性的作用。因 此，本發明的抗-PLD4抗體可用于抑制pDC活性。因此，如果使用本發明的抗體來進行pDC 活性的抑制，則可預期對于其中IFNa表達已上升的自身免疫疾病的患者的治療作用。
[0106] pDC在少量細胞中產生大量IFN。在IFN的中和中，抗體是必需的，該取決于IFN 分子的數目。然而，在本發明中，生產細胞的活性被直接抑制。作為其結果，相較于抗-IFN 抗體的中和，使用更少量的抗體可預期強有力的IFN抑制作用。此外，在其中連續產生IFN 的情況下，預期通過IFN抗體的中和將仍然為瞬時抑制。然而，在本發明，pDC活性被抑制， 并且據此，可預期在長時間內的IFN生成抑制作用。
[0107] 附圖概述
[010引圖1是舉例說明人PLD4(C14或fl75)蛋白的氨基酸序列巧06個殘基）的圖表。 可預見的是來自N末端的第31至第53殘基是跨膜結構域，如使用"S0SUI程序(http:// bp. nuap. nagova-u. ac. jp/sosui/sosui submit, html)"分析的,該程序是針對跨膜區域的 預測系統。第54至第506殘基包含兩個磯酸二醋酶基序，該蛋白被預測為II型跨膜蛋白：
[0109] 圖2是代表人PLD4蛋白的預測結構的示意圖。結構在氨基酸506個殘基中具有 2個服D OlxKxxxxD)基序，蘇氨酸殘基472可能是磯酸化位點：
[0110] 圖3是舉例說明人PLD4蛋白與異種動物的同源分子種類的同源性的圖表。PLD4 蛋白在從小鼠至人的進化過程中是保守的：
[0111] 圖4是舉例說明與人PLD4蛋白家族的同源性（旁系同源物）的圖表：
[0112] 圖5是舉例說明PLD4基因在負責人免疫的細胞中的人pDC-特異性表達的圖表。 PLD4基因在處于靜止期的pDC中高表達，在CD19+B細胞中低表達：
[0113] 圖6是舉例說明人PUMmRNA的組織表達模式的圖表。其在脾和外周血白細胞中 高表達：
[0114] 圖7是舉例說明重組人PUM-Ig融合蛋白的結構的示意圖。通過PCR擴增對應于 人PLD4細胞外結構域巧6-506氨基酸）的CDNA片段。將該片段插入在N末端包含小鼠 IgK前導區段和小鼠IgG2a重鏈恒定化區域（較鏈+C肥+C冊）的N-Flag PCDNA3. 1表達 載體的BamHI-EcoRI克隆位點。用質粒瞬時轉染293F細胞，收集培養上清液：
[0115] 圖8是舉例說明對人PLD4的結合特異性的FACS分析圖。mpllG9. 6和chllG9. 6 抗體特異性識別人PLD4,但不識別人PLD3-293T或PLD5-293T轉染子：
[0116] 圖9是舉例說明與食蟹猴PLD4的交叉反應性的FACS分析圖。mpllG9.6和 chllG9. 6抗體能夠識別293T轉染子上的食蟹猴PLD4:
[0117] 圖10是舉例說明人PBMC的mpllG9.6抗體的染色的FACS測量圖。mpllG9.6抗體 強有力地識別人PBMC中的抓CA2+PDC:
[0118] 圖11是舉例說明CAL-I細胞的純化的抗-PLD4抗體的染色的FACS分析圖：
[0119] 圖12是舉例說明人PLD4-CT125穩定細胞株的抗-PLD4抗體的染色的FACS分析 圖：
[0120] 圖13是舉例說明人PBMC的抗-PLD4抗體的染色的FACS分析圖。所有抗-PLD4 抗體能夠識別人PBMC中的抓CA2+PDC:
[0121] 圖14是表示人PLD、食蟹猴PLD4、恒河猴PLD4和小鼠PLD4的蛋白的多重比對和 同源性的圖表：
[0122] 圖15是舉例說明采用Flag標記的食蟹猴PLD4表達載體至人PLD4-293T細胞的瞬 時基因引入的抗-PLD4抗體的染色的FACS分析圖。通過抗-Flag抗體確認了食蟹猴PLD4 蛋白的細胞表面表達：
[0123] 圖16是舉例說明食蟹猴PLD4-CT125細胞的抗-PLD4抗體的染色的FACS測量圖。 在抗-PLD4抗體當中，7種（384、587、784、1304、13化1、14(：1和1169.6)抗體可結合食蟹猴 PLD4-CT125穩定轉染子：
[0124] 圖17是舉例說明采用Flag標記的恒河猴PLD4表達載體至人PLD4-293T細胞內 的瞬時基因引入的抗-PLD4抗體的染色的FACS分析圖。通過抗-Flag抗體確認了恒河猴 PLD4蛋白的細胞表面表達：
[0125] 圖18-1和圖18-2是舉例說明恒河猴PBMC的抗-PLD4抗體的染色的FACS分析圖。 在抗-PLD4抗體當中，5種（5B7、7B4、13D4、13H11和14C1)抗體特異性結合恒河猴PBMC中 的食蟹猴的pDC細胞群（譜系-CD123+HLA-DR+):
[0126] 圖19是舉例說明針對人PLD4-CT125穩定細胞株的抗-PLD4抗體的解離常數摩爾 濃度（nM單位，Kd值）的圖：
[0127] 圖20是舉例說明10種類型的抗-PLD4抗體的CDC活性的圖。祀細胞：人 PLD4-CT125(小鼠2B4T細胞淋己細胞）穩定轉染子抗體濃度；10y g/mL效應子；1%未成熟 家兔補體：
[0128] 圖21是舉例說明抗-PLD4抗體（mpllG9. 6抗體和chllG9. 6抗體）的CDC活性的 圖。祀細胞：人PLD4-CT125(小鼠2B4T細胞淋己細胞）穩定轉染子抗體濃度；0. 1 y g/mL 至30 y g/mL效應子；1 %未成熟家兔補體：
[0129] 圖22是舉例說明抗-PLD4嵌合抗體的ADCC活性的圖。祀細胞：人PLD4-C冊穩定 轉染子抗體濃度；IOy g/mL:
[0130] 圖23是舉例說明從3個健康個體分離的人PBMC中抗-PLD4嵌合抗體（chi 1G9. 6) 的處理對IFN-a分泌的抑制的測量（利用ELISA)的圖：和
[0131] 圖24是舉例說明在利用抗-PLD4嵌合抗體的處理后人pDC丟失的圖。
[0132] 圖25是利用抗人原代pDC的嵌合抗-PUMAb的ADCC測定的結果。
[0133] 圖26是在嵌合抗-PUMAb存在的情況下通過CpG2216誘導的來自PBMC的IFN a 產生。
[0134] 用于進行本發明的模式
[01巧]本發明人發現PLD4是在處于靜止期的漿細胞樣樹突細胞（靜息pDC)中在mRNA 水平和蛋白質水平上特異性表達的分子。未建立制備識別PLD4的抗體的方法。
[0136] 有報導認為小鼠PLD4是在出生后的最初階段的小腦或脫腑體中的處于發育期的 變形蟲樣（活化狀態）小神經膠質細胞中表達的分子。然而，人PLD4的表達直至現在還不 清楚。具體地，直至現在仍未報道人PLD4在免疫系統中的表達、細胞內定位、結構、功能等。 本發明確認直至現在被認為僅在細胞質中表達的人PLD4是在人漿細胞樣樹突細胞（pDC) 中表達為II型跨膜蛋白的細胞表面標志物。因此，PLD4抗體對pDC的結合成為可能，并且 已證明PLD4抗體可用作意欲調節B細胞和pDC細胞的功能的治療性抗體的分子祀。
[0137] 本發明人通過基因表達分析確認了 PLD4在人pDC中特異性表達。可W預見的是 如果獲得可在免疫學上區分PLD4與其它分子的抗體，則其可用于pDC研究。然而，在包含 PLD4的PLD家族中存在許多分子，其在結構上彼此十分相似。分子例如PLD1，PLD2, PLD3和 PLD5,包括作為PLD4的PLD，包含具有特別高的同源性的氨基酸序列（圖4)。因此，可W預 見的是使用利用構成PLD4(或細胞外結構域）的氨基酸序列（部分序列）的膚的免疫原難 W獲得彼此區分該些分子的抗體。因此，本發明人嘗試使用重組PUM-Ig融合蛋白作為免 疫原來獲得抗PLD4的抗體，所述重組PUM-Ig融合蛋白編碼包含PLD4細胞外結構域的氨 基酸序列。
[013引本發明人重復研究W獲得識別PLD4的抗體，并顯示使用重組PUM-Ig融合蛋白作 為免疫原獲得期望的抗體，并且完成了本發明。也就是說，本發明涉及結合PLD4細胞外結 構域的單克隆抗體，或包含其抗原結合區的片段。
[0139] 在本發明中，PLD4是在人pDC中表達的天然分子，或在免疫學上與在人pDC中表 達的PLD4等同的分子。在本發明中，可確認抗體對PLD4的結合，例如，如下文中描述的。
[0140] ?基于與人細胞的反應性的確認：
[0141] 根據本發明人獲得的發現，可W預見的是根據其在人pDC中顯示特異性表達的事 實，PLD4可用作pDC標志物。
[014引基于PLD4的該樣的表達特征譜，與pDC的至少部分亞組的結合活性是本發明中結 合PLD4的抗體的重要特征之一。一些細胞是pDC的事實可通過每一個細胞家族中固有的 細胞表面標志物來確定。例如，對期望的細胞的結合通過結合細胞表面標志物的抗體和結 合活性待確認的抗體的雙重染色來確認。也就是說，本發明中的pDC包括表達例如抓CA2 的細胞。
[0143] ?基于與表達PLD4基因的轉化細胞的反應性的確認：
[0144] 本發明人確認了當在某些條件下表達PLD4基因時在人pDC中表達的PLD4的免疫 學特征被重建。因此，與PLD4的反應性還可基于抗體對于其中已人工地引入了編碼PLD4 的基因的細胞的反應性來確認。也就是說，本發明涉及單克隆抗體或包含其抗原結合區的 片段，所述抗體結合包含構成PLD4細胞外結構域的氨基酸序列作為細胞外結構域的分子。 同時，細胞外結構域由對應于SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的從SEQ ID NO 1(圖1)的 N末端開始的54至506的氨基酸序列構成。
[0145] 例如，在用包含編碼PLD4的DNA的表達載體轉化的細胞中，在人pDC中表達的 PLD4的免疫學特征得W維持。因此，表達PLD4的轉化細胞優選作為用于在本發明中確認抗 體對PLD4的細胞外結構域的結合特性的細胞。當在本發明中通過轉化細胞確認抗體的反 應性時，非轉化細胞被期望地用作對照。
[0146] 隨后，本發明中結合PLD4的抗體可W是顯示與已知表達除PLD4外的PLD家族的 細胞家族的交叉性質的抗體，或可W是不顯示該樣的交叉性質的抗體。未顯示交叉性質的 抗體優選作為本發明中結合PLD4的抗體。具體地，本發明中結合PLD4的抗體優選為該樣 的抗體，在與其中對pDC的結合被確認的條件相同的條件下，可能不能確認所述抗體與已 知表達除PLD4外的PLD家族的細胞家族的結合。
[0147] 也就是說，本發明中結合PLD4細胞外結構域的單克隆抗體優選包括具有下述免 疫學特征的單克隆抗體。
[0148] a)結合人 pDC，
[0149] b)在允許結合人pDC的條件下，可能不能確認對選自單核細胞、巨瞻細胞、CD34陽 性細胞和來源于該些細胞的樹突細胞的一個或多個種類的細胞的結合。
[0150] 具體地，本發明的單克隆抗體優選為該樣的抗體，在允許結合人pDC的條件下，可 能不能確認所述抗體對單核細胞、巨瞻細胞、B細胞、CD34陽性細胞和來源于該些細胞的樹 突細胞的結合。
[0151] 或者，本發明中結合PLD4細胞外結構域的單克隆抗體優選包括具有下述免疫學 特征的單克隆抗體。
[015引 C)對利用W可表達的方式保留編碼PLD4的DNA的表達載體轉化的轉化細胞的結 厶 I=I ?
[0153] d)在允許結合轉化細胞C)的條件下，可能不能確認與被轉化前的C)的宿主細胞 的結合。
[0154] 本發明中抗-PLD4單克隆抗體不與PLD家族的其它分子交叉反應的事實，可通過 使用其中每一個PLD家族被強制表達的細胞來確認。也就是說，通過將編碼每一個PLD家 族的氨基酸序列的CDNA引入適當的宿主細胞來進行強制表達。將獲得的轉化細胞與交叉 性質待確認的抗-PLD4單克隆抗體接觸。如果未顯示對表達除PLD4外的PLD家族分子的 細胞的結合，則可確認抗體可在免疫學上區分PLD4與其它PLD家族分子。例如，在下文中 描述的實例中確認了大多數通過本發明獲得的抗-PLD4單克隆抗體不與與PLD4具有特別 高的同源性的PLD3和PLD5 W及另外的PLDl和PLD2交叉反應。因此，本發明中的單克隆 抗體優選為結合PLD4但可能不能檢測到其在相同條件下對PLD3, PLD5, PLDl或PLD2的結 合的單克隆抗體。如果使用可在免疫學上區分該些PLD家族分子與PLD4的抗體，則可特異 性地檢測PLD4表達的變化。
[0155] 可W例如根據流式細胞術原理來確認結合活性待確認的單克隆抗體對每一個種 類的細胞的結合。為了通過流式細胞術原理確認抗體的反應性，用產生可檢測信號的分子 或原子團標記抗體是有利的。一般地，使用英光標記或發光標記。為了通過流式細胞術的原 理分析英光標記抗體對細胞的結合，可使用英光激活細胞分選術（FACS)。通過使用FACS， 可有效地確認抗體對細胞的多重結合。
[0156] 具體地，例如，將最初已知能夠鑒定pDC的抗體A和待分析對pDC的結合特征的抗 體B同時與包括pDC的細胞家族反應。抗體A和抗體B已用可彼此區分它們的英光信號進 行了標記。如果從相同細胞家族檢測到兩種信號，則可確認該樣的抗體結合相同細胞家族。 也就是說，發現抗體A和抗體B具有相同結合特征。如果抗體A和抗體B結合不同的細胞 家族，則很明顯它們的結合特征彼此不同。
[0157] 本發明的優選單克隆抗體的實例包括例如由雜交瘤mp5B7、mp7B4、mp 13D4和 mpl3化1產生的單克隆抗體。
[0巧引 雜交瘤111口587、111口784、111口1304和111口13化1于2012年1月27日在登錄號；化1￡ BP-1211、NITE BP-1212、NITE BP-1213和NITE BP-1214下被保藏于獨立行政法人制品評 價技術基盤機構專利微生物保藏中也（NITC)。下面將描述詳細說明保藏的內容。
[0159] (1)保藏機構的名稱和地址
[0160] 名稱；獨立行政法人制品評價技術基盤機構專利微生物保藏中也（WTC)
[0161]地址；2-5-8Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Qiiba-ken, 292-0818JAPAN
[0162] (2)保藏日期：2012年I月27日
[0163] (3)登錄號 NITE BP-1211 (雜交瘤 mp5B7)
[0164] NITE BP-1212 (雜交瘤 mp7B4)
[0165] WTE BP-1213 (雜交瘤 mpl3D4)
[0166] WTE BP-1214(雜交瘤 mpl3Hll)
[0167] 本發明的單克隆抗體可W是包含其抗原結合區的片段。例如，通過IgG酶促消化 產生的包含抗原結合位點的抗體片段可在本發明中用作抗體。具體地，通過用木瓜蛋白酶 或胃蛋白酶進行消化，可獲得抗體片段例如F油或F(油'）2。此外，包含其中植入某一單克 隆抗體的互補決定區（CDR)的可變區的免疫球蛋白片段包括在包含抗原結合區的片段中。 眾所周知，該些抗體片段可用作對抗原具有結合親和力的抗體分子。或者，可使用通過基因 重組構建的抗體，只要其維持抗原結合所必需的活性。通過基因重組構建的抗體的實例包 括，例如，嵌合抗體、CDR移植抗體、單鏈Fv、雙特異性抗體（雙體）、線性抗體和通過抗體片 段形成的多特異性抗體等。基于單克隆抗體獲得該樣的抗體的方法或產生其的抗體產生性 細胞是已知的。
[0168] 本發明的單克隆抗體可通過使用重組PUM-Ig融合蛋白或表達人PLD4的轉化細 胞作為免疫原來獲得。目P，本發明涉及制備產生結合PLD4細胞外結構域的單克隆抗體的細 胞的方法，所述方法包括下列過程。
[0169] (1)給免疫動物施用包含PLD4細胞外結構域的外源蛋白的過程，和
[0170] (2)從免疫動物的抗體產生性細胞選擇產生結合PLD4的抗體的抗體產生性細胞 的過程。
[0171] 可培養該樣獲得的抗體產生性細胞或抗體產生性細胞的永生化細胞，可從培養物 收集期望的單克隆抗體。已知多種方法為用于永生化抗體產生性細胞的方法。
[0172] 可W例如通過制備其中W可表達的方式保留下文描述的編碼包含PLD4細胞外結 構域的氨基酸序列的外源性多核巧酸（a)的細胞，來獲得在本發明中用作免疫原的轉化細 胞。
[0173] 本發明中的外源性多核巧酸是指通過人工引入宿主細胞的多核巧酸。在其中人細 胞用作細胞的情況下，將人基因引入人細胞。在該樣的組合中，人工引入的多核巧酸也稱為 外源性多核巧酸。因此，PLD4的異位表達包括在外源性多核巧酸表達中。
[0174] 本發明的PLD4細胞外結構域是指對應于SEQ ID NO 1中所述的氨基酸序列的細 胞外結構域的位置54-506的氨基酸序列。例如，按下列順序從N末端側包含每一個區域的 氨基酸序列優選在本發明中作為包含PLD4細胞外結構域的氨基酸序列。
[0175] [細胞內區域+跨膜結構域+細胞外結構域]
[0176] 或者，如下描述的部分缺乏細胞內區域的氨基酸序列也包括在本發明的包含PLD4 細胞外結構域的氨基酸序列中。
[0177] [部分細胞內區域+跨膜結構域+細胞外結構域]
[0178] 此外，如下描述的缺乏細胞內區域的結構包括在本發明的包含PLD4細胞外結構 域的氨基酸序列中。
[0179] [跨膜結構域+細胞外結構域]
[0180] 上述結構中除細胞外結構域外的其它區域可W是選自由SEQ ID NO 1所示的氨基 酸序列的序列，或可W是與另一個同源氨基酸序列的組合。例如，構成信號序列、跨膜結構 域和細胞內區域的氨基酸序列可用作除PLD4外的PLD家族分子的氨基酸序列。或者，還可 組合除人外的其它物種的PLD家族的氨基酸序列。此外，構成除細胞外結構域外的其它區 域的氨基酸序列可在其中可維持區域的每一個功能的范圍內包含突變。此外，可將其它區 域插在所述區域的每一個區域之間。例如，在信號序列與細胞外結構域之間，還可插入表位 標記例如FLAG。具體地，信號序列是在蛋白質翻譯后轉移至細胞膜的步驟中經歷加工，隨后 除去的區域。因此，誘導翻譯的蛋白質穿過細胞膜的任意氨基酸序列可用作信號序列。更 具體地，PLD4的氨基酸序列（SEQ ID NO 1)優選作為包含PLD4細胞外結構域的氨基酸序 列。
[0181] 因此，本發明的上述多核巧酸（a)可W是編碼構成上述結構[細胞內區域+跨膜 結構域+細胞外結構域]的氨基酸序列的任意堿基序列。例如，SEQ ID NO 1的氨基酸序 列由SEQ ID NO 44中描述的cDNA堿基序列編碼。
[0182] 作為本發明的免疫原的重組PUM-Ig融合蛋白可通過將W可表達的方式保留上 述多核巧酸的表達載體引入適當的宿主細胞來獲得。重組PUM-Ig融合蛋白的CDNA堿基 序列由SEQ ID NO 125表示，氨基酸序列由SEQ ID NO 126表示。
[0183] 本發明的宿主細胞優選為哺乳動物細胞。具體地，來源于人、猴、小鼠或大鼠的 細胞可用作宿主細胞。具體地，人來源的細胞優選作為宿主細胞。例如，肥K-293T細胞為 可優選在本發明中用作宿主細胞的人胚胎來源的腎細胞株。肥K-293T細胞可作為ATCC 邸L-11268來獲得。除此W外，來源于免疫動物的細胞可用作宿主細胞。如果來源于免疫動 物的細胞用作免疫原，針對宿主細胞的免疫反應是小的。因此，可有效地獲得外源性地表達 的抗PLD4細胞外結構域的抗體。因此，例如，當小鼠用作免疫動物時，來源于小鼠的細胞也 可用作巧王細胞。
[0184] 可將上述多核巧酸加載至可在宿主細胞中誘導表達的載體，W轉化細胞。可使用 可在哺乳動物細胞中誘導表達的商購可得的載體。例如，表達載體例如pCMV-Script (R)載 體、pSG5 載體（由 Stratagene 生產的）、pcDNA3. 1 (由 Invitrogen 生產的）、pMXs-IP 逆轉 錄病毒載體（由Cell Bi化油S生產的）等可用于本發明。
[0185] 將該樣獲得的轉化細胞與另外的組分例如佐劑（必要時）一起給免疫動物施 用。作為佐劑，可使用弗氏完全佐劑等。在其中小鼠用作免疫動物的情況下，將純化的重組 PUM-Ig融合蛋白給BALB/c小鼠施用。作為佐劑，使用完全和不完全弗氏佐劑（由SIGMA 生產的），在第一次W 200 y g/小鼠施用，在第二次至第四次W 50 y g/小鼠施用。通常地， 間隔性地多次施用免疫原，直至抗體滴度增加。例如，在短時間免疫法的情況下，W 2至4 天，更具體地3天的間隔施用轉化細胞，在施用2至3次后，收集抗體產生性細胞。此外，還 可在W每周約1次的間隔施用5至6次后收集抗體產生性細胞。
[0186] 為了獲得本發明的單克隆抗體，克隆收集的抗體產生性細胞。為了進行克隆， 優選使抗體產生性細胞永生化。例如，可將W雜交瘤法為代表的細胞融合法或通過 Epstein-Barr病毒巧BV)進行的轉化用作永生化抗體產生性細胞的方法。
[0187] 抗體產生性細胞每一個細胞產生一種抗體。因此，如果可建立來源于一個細胞的 細胞群（也就是說，克隆），則可獲得單克隆抗體。雜交瘤法是指其中將抗體產生性細胞與 適當的細胞株融合、永生化，隨后克隆的方法。永生化的抗體產生性細胞可通過方法例如有 限稀釋法來克隆。許多用于雜交瘤法的細胞株是已知的。該些細胞株在基于淋己細胞的細 胞的永生化效率上是優秀的，并且具有選擇細胞融合已獲成功的細胞所必需的各種基因標 志物。此外，在其中期望獲得抗體產生性細胞的情況下，還可使用缺乏抗體產生能力的細胞 株。
[0188] 例如，小鼠骨髓瘤 P3x63A妍.653(ATCC C化-1580)或 P3x63A妍U. !(ATCC 0?L-1597)普遍用作用于小鼠或大鼠的細胞融合法的有用細胞株。一般而言，雜交瘤通過同 種的細胞的融合來制備。然而，還可從近緣的異種物種之間的異種雜交瘤獲得單克隆抗體。
[0189] 細胞融合的具體方案是已知的。也就是說，將免疫動物的抗體產生性細胞與適當 的融合伴侶混合，和經歷細胞融合。作為抗體產生性細胞，可使用脾細胞、從淋己結收集的 淋己細胞、外周血B細胞等。作為融合伴侶，可使用上述各種細胞株。對于細胞融合，使用 聚己二醇法或電融合法。
[0190] 隨后，基于融合細胞具有的選擇標志物選擇細胞融合已獲成功能的細胞。例如，在 其中將HAT敏感性細胞株用于細胞融合的情況下，通過選擇在HAT培養基中生長的細胞來 選擇細胞融合已獲成功的細胞。此外，確認由選擇的細胞產生的抗體是否具有期望的反應 性。
[0191] 基于抗體的反應性篩選每一個雜交瘤。也就是說，通過上述方法選擇產生結合 PLD4的抗體的雜交瘤。優選，在其中亞克隆選擇的雜交瘤并且期望的抗體的產生最終被確 認的情況下，將雜交瘤選擇作為產生本發明的單克隆抗體的雜交瘤。
[0192] 具體地，可基于與人細胞的反應性或與表達PLD4基因的轉化細胞的反應性來選 擇期望的雜交瘤。可根據免疫測定的原理檢測結合細胞的抗體。例如，可將其中將細胞用 作抗原的化ISA用于檢測期望的抗體。具體地，將雜交瘤的培養上清液與固定人pDC或用 作免疫原的轉化細胞的載體接觸。在其中培養上清液包含期望的抗體的情況下，抗體被固 定在載體上的細胞捕獲。隨后，將固相與培養上清液分離，必需時洗涂，隨后可檢測被捕獲 在固相上的抗體。在抗體的檢測中，可使用識別抗體的抗體。例如，可利用抗-小鼠免疫球 蛋白抗體檢測小鼠的抗體。如果識別抗體的抗體已被標記，則其檢測非常容易。作為標記， 可使用酶、英光色素、發光色素等。
[0193] 在另一個方面，作為固定細胞的載體，可使用顆粒或微量滴定板的內壁。塑料制成 的顆粒或容器的表面可通過物理吸附固定細胞。例如，聚苯己帰制成的珠粒或反應容器可 用作用于固定細胞的載體。
[0194] 在選擇雜交瘤中，可存在預測的不是抗PLD4抗體的產生，而是針對用作免疫原的 轉化細胞的宿主細胞的抗體的產生的情況。例如，當如實施例中所示人細胞用作免疫原并 且小鼠用作免疫動物時，人細胞被當作外來物質，并且預測產生結合其的抗體。在本發明 中，期望獲得識別PLD4的抗體。因此，識別除PLD4外的其它人細胞抗原的抗體的獲得不是 必需的。為了通過篩選排除產生該樣的抗體的雜交瘤，可在確認抗體反應性之前初步吸附 不期望的抗體。
[0195] 可利用結合預測存在的抗體的抗原吸附不期望的抗體。具體地，例如，可利用其中 可能未檢測到PLD4的表達的細胞吸附針對除PLD4外的其它人細胞抗原的抗體。在本發明 中，用于免疫原的宿主細胞優選作為用于吸附不期望的抗體的抗原。
[0196] 必要時，確認經確認具有對抗原的結合活性的單克隆抗體的對pDC的活性的實際 影響。可W例如通過下述方法確認對pDC的影響。
[0197] 可從通過培養產生單克隆抗體的雜交瘤獲得的培養物收集本發明的單克隆抗體。 可體外或體內培養雜交瘤。在體外培養中，可使用已知的培養基例如RPMI 1640來培養雜 交瘤。由雜交瘤分泌的免疫球蛋白積累在培養上清液中。因此，本發明的單克隆抗體可通 過收集培養上清液和必要時純化其來獲得。免疫球蛋白的純化在未添加有血清的培養基中 是非常容易的。然而，為了雜交瘤的快速生長和抗體產量的提高，還可向培養基中添加10% 左右的胎牛血清。
[0198] 還可體內培養雜交瘤。具體地，可通過將雜交瘤接種至裸鼠的腹腔中來在腹腔中 培養雜交瘤。單克隆抗體在腹水中積累。因此，收集腹水，必要時純化其，W獲得必需的單 克隆抗體。取決于目的，可適當地修飾或加工獲得的單克隆抗體。
[0199] 可通過從雜交瘤獲得編碼抗體的抗原結合區的cDNA，將其插入適當的表達載體來 表達本發明的單克隆抗體。用于獲得編碼抗體的可變區的CDNA并在適當的宿主細胞中表 達其的技術是已知的。此外，其中將包含抗原結合區的可變區連接于恒定區W產生嵌合抗 體的方法是已知的。例如，可通過將可變區的基因連接于分別編碼人IgGl重鏈恒定區和人 IgK輕鏈恒定區的基因來產生嵌合抗體。此外，已知可通過將構成可變區的CDR整合入另 一個免疫球蛋白分子的框架區來將單克隆抗體的抗原結合活性移植至所述另一個免疫球 蛋白。通過使用該樣的策略，建立了將異種免疫球蛋白所具有的抗原結合活性移植至人免 疫球蛋白的方法。例如，可存在其中將支持CDR的框架區的部分氨基酸序列從小鼠抗體的 可變區移植至人可變區的情況。隨后，可將人抗體的該些人源化、重建的可變區連接于人抗 體的恒定區，W獲得人源化抗體。
[0200] 本發明的優選單克隆抗體的實例包括例如，由分別在登錄號；NITE BP-1211、NITE BP-1212、NITE BP-1213 和 NITE BP-1214 下保藏的雜交瘤 mp5B7、mp7B4、mpl3D4、mpl3Hll 等產生的單克隆抗體。
[0201] 作為包含可變區的嵌合抗體，或其中構成可變區的CDR是移植的人源化抗體，具 有來源于IgG或IgM的恒定區的抗體優選包括在本發明的抗體中。具體地，本發明的抗體 更優選為具有如下組合作為構成抗體的可變區的CDR的序列的抗體：
[0202] 重鏈 CDRl ;DYNLH,
[0203] CDR2 ：YIYPYNGNTGYNQKFKR,
[0204] CDR3 ;GGIY孤YYDYAIDY 和
[0205] 輕鏈 CDRl ;RASENIYSHIA,
[0206] CDR2 =GATNLAH,
[0207] CDR3 =QHFWGTP,
[020引具有如下組合作為構成可變區的CDR的序列的抗體：
[0209]重鏈 CDRl ;SHYYWT,
[0210] CDR2 ：YISYDGSNNYNPSLKN,
[0211] CDR3 ;EGPLYYGNPYWYFDV 和
[0212] 輕鏈 CDRl ;RAS孤IDNYLN,
[0213] CDR2 ：YTSRLHS,
[0214] CDR3 ：QQFNTLP,
[0215] 或具有如下組合作為構成可變區的CDR的序列的抗體：
[0引引 重鏈 CDRl ;SHYYWS,
[0217] CDR2 ：YISYDGSNNYNPSLKN,
[0218] CDR3 ;EGPLYYGNPYWYFDV 和
[0219] 輕鏈 CDRl ;RAS孤IDNYLN,
[0220] CDR2 ;YTS化服，
[0221] CDR3 ; QQFNTLP。
[0222] 本發明人已確認抗PLD4單克隆抗體對PLD4表達細胞具有CDC作用。因此，具有 IgG-或IgM-來源的恒定區的抗體對PLD4表達細胞具有通過CDC作用產生的細胞毒性的作 用。該樣的抗體用于抑制PLD4表達細胞例如pDC的細胞數目。
[0223] 識別PLD4的嵌合抗體或人源化抗體可使用編碼它們的多核巧酸，通過基因工程 來制備。
[0224] 未獲得可特異性識別PLD4的抗體。通過利用本發明的免疫原，已第一次提供了識 別PLD4的抗體。也就是說，本發明提供了識別PLD4的抗體，其可通過下述方法來獲得。
[0225] (1)給免疫動物施用包含PLD4細胞外結構域的蛋白質的過程，
[0226] (2)從免疫動物的抗體產生性細胞選擇產生結合PLD4的抗體的抗體產生性細胞 的過程，和
[0227] 做培養（2)中選擇的抗體產生性細胞，從培養物收集識別PLD4的抗體的過程。 [022引已發現PLD4在人pDC中特異性表達。在人pDC中的特異性表達還由本發明人通 過利用SACiE的基因表達分析來獲得確認。然而，在過去的報導中PLD4表達水平全都基于 mRNA來分析。此外，已知PLD4蛋白僅在細胞質中表達。本發明已發現PLD4也在細胞表面 上表達。由于未提供可檢測PLD4的抗體，因此沒有常規地進行蛋白質表達狀態的分析。由 本發明提供的結合PLD4細胞外結構域的抗體已實現了 PLD4蛋白的分析。
[0229] 如實際上由本發明人確認的，基于本發明的結合PLD4細胞外結構域的單克隆抗 體已特異性地檢測到人pDC。也就是說，本發明涉及檢測漿細胞樣樹突細胞的方法，其包括 步驟：將結合PLD4細胞外結構域的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段與測試細胞接 觸，隨后檢測結合細胞的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段。
[0230] 通過基于本發明的PLD4的檢測，可確認一些細胞是否是pDC。也就是說，本發明提 供了使用PLD4作為指標鑒定pDC的方法。或者，可基于本發明分離對于其檢測到PLD4的 細胞，從而分離人pDC。也就是說，本發明提供了使用PLD4作為指標分離pDC的方法。
[0231] 在本發明中，結合PLD4細胞外結構域的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段 可具有標記。例如，可利用發光色素或英光色素標記其來容易地檢測抗體。更具體地，將英 光色素標記的抗體與可能含有PDC的細胞群接觸，隨后可使用英光色素作為指標來檢測結 合本發明的抗體的細胞。此外，如果分離利用英光色素檢測到的細胞，可分離pDC。可根據 FACS的原理容易地進行一系列步驟。
[0232] 或者，還可將本發明的抗體結合于固相載體例如磁珠。結合于固相載體的抗體識 別PLD4,從而將pDC捕獲在固相載體上。作為其結果，可檢測或分離pDC。
[0233] 基于本發明的pDC檢測法所必需的抗體可提供為用于檢測pDC的試劑。也就是 說，本發明提供了用于檢測PDC的試劑，其包含結合PLD4細胞外結構域的單克隆抗體或包 含其抗原結合區的片段。在本發明的用于檢測PDC的試劑中，除了抗體W外，還可組合陽性 對照或陰性對照。例如，可將用作免疫原的表達PLD4細胞外結構域的轉化細胞或從人收集 的pDC等用作陽性對照。通常地，僅可從外周血獲得少量人pDC。因此，轉化細胞在本發明 的試劑中特別優選作為陽性對照。另一方面，作為陰性對照，可使用不表達PLD4的任意細 胞。
[0234] 也就是說，本發明提供了用于檢測人pDC的試劑盒，其包含結合PLD4細胞外結構 域的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段。
[0235] 此外，本發明人分析了結合PLD4細胞外結構域的抗體對pDC的影響。作為其結果， 已確認結合PLD4細胞外結構域的抗體抑制pDC活性。也就是說，本發明涉及抑制干擾素生 成細胞的活性的方法，其包括將下列組分的任一種與pDC接觸的步驟：
[0236] (a)結合PLD4并抑制pDC活性的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，和
[0237] 化）其中植入單克隆抗體（a)的互補決定區的免疫球蛋白或包含其抗原結合區的 片段。
[023引或者，本發明涉及抑制活生物體中的pDC活性的方法，其包括給活生物體施用下 列組分的任一種的步驟：
[0239] (a)結合PLD4并抑制pDC活性的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，
[0240] 化）其中植入單克隆抗體（a)的互補決定區的免疫球蛋白或包含其抗原結合區的 片段，和
[0241] (C)編碼（a)或化）中描述的組分的多核巧酸。
[0242] 本發明的pDC是指具有IFN產生能力并且在細胞表面上表達PLD4的細胞。在 下文中，除非明確地另有所指，否則pDC不僅是作為樹突細胞的前體細胞的細胞，而且還 包括具有IFN產生能力和在細胞表面上表達PLD4的細胞。鑒定該樣的pDC的方法是已 知的。例如，可使用幾種細胞表面標志物作為指標區分pDC與其它血液細胞。具體地，人 pDC細胞表面標志物的特征譜是如下文中描述的（Shodman,K.和Liu, YJ.化化re Reviews 2;151-161，2002)。近年來，還有報導將抓CA-2陽性細胞指定為pDC(Dzione k，A.等人 J. Immunol. 165 :6037-6046, 2000)〇
[024引[人pDC的細胞表面抗原的特征譜]
[0244] CD4陽性和CDI23陽性，
[0245] 譜系（CD3、CD14、CD16、CD19、CD20 和 CD56)陰性，CDllc 陰性
[0246] 因此，具有該些已知標志物的表達特征譜和具有IFN產生能力的細胞也可稱為 pDC。此外，屬于具有與該些標志物的表達特征譜的表達模式不同的特征譜，但具有在活生 物體中產生IFN的能力的細胞家族的細胞包括在pDC中。
[0247] 此外，由人pDC顯示的共同特征的實例包括下述特征。
[024引[細胞的形態學特征]
[0249] ?與漿細胞相似
[0250] ?具有平滑細胞表面的圓形細胞
[0巧1] ?相對大的細胞核
[0252][細胞的功能特征]
[0巧引 ?病毒感染時在短時間內產生大量I型IFN
[0254] ?病毒感染后分化成樹突細胞
[0巧引本發明中pDC活性的抑制是指pDC的至少一個功能的抑巧IJ。pDC功能的實例包括 IFN產生和細胞存活。細胞存活可另外地被稱為細胞數目。因此，該些功能的一個或兩個 的抑制稱為pDC活性的抑制。已發現由pDC產生的I型IFN是各種疾病的原因。因此，pDC 細胞數目或INF產生的抑制可用作治療該樣的疾病的策略。
[0巧引例如，已指出自身免疫疾病的病理狀態與IFNa的關系。大部分IFNa由pDC產 生。因此，如果其產生被抑制，則可緩解由IFNa引起的病理狀態。同時，在本發明中，pDC 的INF產生的抑制是指由pDC產生的至少一種IFN的產生的抑制。本發明的IFN優選為I 型IFN。在它們當中，IFNa是重要的。
[0巧7] 也就是說，本發明涉及IFN產生的抑制劑，其包含結合PLD4細胞外結構域的抗體 作為活性成分。或者，本發明提供了抑制IFN產生的方法，其包括施用結合PLD4細胞外結 構域的抗體的過程。此外，本發明涉及結合PLD4細胞外結構域的抗體在制備抑制IFN產生 的藥物組合物中的用途。
[0巧引在少量細胞中產生大量IFN的細胞包括在pDC中。例如，接受病毒等的刺激的樹 突細胞的前體細胞產生大部分由活生物體產生的IFN。產生大量IFN的pDC的細胞數目的 抑制的結果是導致IFN產生的抑制。因此，pDC細胞數目的抑制也可緩解由IFNa引起的 病理狀態。
[0巧9] 在本發明的優選方面，確認了抗-PLD4單克隆抗體結合PLD4表達細胞，并且通過 補體依賴細胞毒性（CDC)作用賦予細胞毒性。CDC作用是抗體藥物的重要作用機制之一。 本發明的抗-PLD4單克隆抗體還具有通過CDC作用產生的對于PLD4表達細胞例如pDC的 強細胞毒性作用。也就是說，在優選方面，可預期抗-PLD4單克隆抗體的不僅通過抑制IFN 產生的機制，而且還通過對于pDC的細胞毒性產生的抑制IFN產生的作用。
[0260] 本發明使用的識別PLD4細胞外結構域的抗體可基于上述方法獲得。本發明的抗 體可W是任何種類。此外，抗體所源自的生物種類不受限制。此外，包含抗體的抗原結合區 的片段可用作抗體。例如，通過IgG的酶促消化產生的包含抗原結合部位的抗體片段可用 作本發明的抗體。具體地，抗體片段例如F油或F(油'）2可通過利用木瓜蛋白酶或胃蛋白 酶的消化來獲得。眾所周知該些抗體片段可用作對抗原具有親和力的抗體分子。或者，還 可使用通過基因重組構建的抗體，只要其維持必需的抗原結合活性。通過基因重組構建的 抗體的實例包括嵌合抗體、CDR移植抗體、單鏈Fv、雙特異性抗體（雙體）、線性抗體和由抗 體片段形成的多特異性抗體等。基于單克隆抗體獲得該些抗體的方法是已知的。
[0261] 必要時可修飾本發明的抗體。根據本發明，識別PLD4細胞外結構域的抗體具有抑 巧Ij PDC活性的作用。也就是說，已預見了抗體本身具有對于pDC的細胞毒性的可能性。顯 示強效應子作用的抗體的亞類是已知的。或者，還可通過用細胞毒性劑修飾抗體來增強抑 制pDC活性的作用。細胞毒性劑的實例包括下述試劑。
[026引毒素；假單胞桿菌內毒素牌)、白喉毒素和籬麻毒素 [026引 放射性同位素；Tc99m、Sr89、1131和Y90
[0264] 抗癌劑：卡奇霉素、絲裂霉素和紫杉醇。
[0265] 包含蛋白的毒素可通過雙功能試劑結合抗體、其片段等。或者，還可用編碼抗體的 基因綴合編碼毒性的基因來產生它們的融合蛋白。將放射性同位素與抗體結合的方法也是 已知的。例如，使用馨合劑，利用放射性同位素標記抗體的方法是已知的。此外，可通過使 用糖鏈、雙功能試劑等將抗癌劑結合于抗體。
[0266] 在本發明中，還可將人工地結構修飾的抗體用作活性組分。例如，已知增強抗體 的細胞毒性或穩定性的各種修飾。具體地，其中重鏈的糖鏈被修飾的免疫球蛋白是已知的 (Shinkawa, T.等人J. Biol. Chem. 278 :3466-3473. 2003)。糖鏈的修飾增強免疫球蛋白的抗 體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC)活性。
[0267] 當將結合PLD4細胞外結構域的抗體與pDC接觸時，其抑制pDC的活性。因此，該 樣的抗體可用作抑制PDC活性的試劑，或用于抑制pDC的方法。也就是說，本發明提供了用 于抑制pDC活性的試劑，其包含至少一個種類的選自下述（a)至（C)的組分作為活性組分。 或者，本發明涉及抑制pDC活性的方法，其包括施用至少一個種類的選自下述（a)至（C)的 組分的步驟。此外，本發明涉及至少一個種類的選自下述（a)至（C)的組分用于制備用于 調節pDC活性的試劑的用途。
[026引 （a)結合PLD4細胞外結構域的抗體或包含其抗原結合區的片段，
[0269] 化）其中植入單克隆抗體（a)的互補決定區的免疫球蛋白或包含其抗原結合區的 片段。
[0270] 作為本發明的抑制pDC活性的單克隆抗體，可使用識別PLD4細胞外結構域的單克 隆抗體。可將一個種類或多個種類的單克隆抗體用于本發明。例如，可混合多個種類的識 別PLD4細胞外結構域的單克隆抗體，將其用于本發明。
[027。 可W W下述方式確認抗體具有抑制pDC的IFN產生活性的作用的事實。pDC在病毒 刺激后產生大量IFN。在病毒刺激之前、之后或與之同時給pDC提供抗體，將IFN產生能力 與其中未給pDC提供抗體的對照相比較。可通過測量pDC培養物的上清液中包含的IFN-a 或IFN-目來評價IFN產生能力。作為比較的結果，如果抗體的添加顯著地減少了上清液中 IFN的量，可確認測試的抗體具有抑制IFN產生活性的作用。測量該些IFN的方法是已知 的。pDC是在活生物體中產生大部分IFN的細胞。因此，pDC的IFN產生活性的抑制可在活 生物體中調節IFN的產生狀態。
[0272] 本發明的pDC的活性包括pDC細胞數目的維持。因此，本發明的pDC活性的抑制 包括pDC細胞數目的抑制。如果確認pDC細胞數目在抗體存在的情況下被抑制，則認為抗 體抑制pDC活性。與IFN產生類似，可將來源于與活性待確認的抗體的物種相同的動物物 種的無活性免疫球蛋白用作比較的對照。可通過細胞計數來定量比較pDC細胞數目。可用 FACS或顯微鏡來計數細胞數目。
[0273] 此外，還假定作為病毒感染等的結果pDC分化成稱為樹突細胞2 (DC2)的誘導化2 的細胞。如果病毒刺激后產生IFN的pDC被抑制，則存在至化2的分化也可被抑制的可能 性。因此，還可預期抑制IFN產生的本發明的單克隆抗體具有針對各種過敏性疾病的治療 作用。
[0274] 在其中給與抗體所源自的生物物種不同的宿主施用識別PLD4細胞外結構域的抗 體的情況下，期望將抗體加工成幾乎不被宿主識別為外來物質的形式。例如，可通過如下所 述加工分子來使免疫球蛋白幾乎不被識別為外來物質。下述加工免疫球蛋白分子的方法是 已知的。
[027引 ?從其刪除恒定區的包含抗原結合區的片段（Monoclonal AntibodiesiPrinciples and Practice,第 3 片反，Academic Press Limited. 1995: Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)
[0276] ?利用單克隆抗體的抗原結合區和宿主免疫球蛋白的恒定區構成的嵌合抗體 (Gene Expression Experiment Manual, Kodansha Ltd. 1994 (由 Isao ISHIDA 和 Tamie ANDO編輯的））
[0277] ?其中用單克隆抗體的CDR置換了宿主免疫球蛋白中的互補決定區仰R)的CDR 置換抗體（Gene Expression Experiment Manual, Kodansha Ltd. 1994(由 Isao ISHIDA 和 Tamie ANDO 編輯的））
[027引或者，人免疫球蛋白可變區的基因還可通過瞻菌體展示法（McCaffedy J 等人，Nature 348:552-554,1990:Kretzschmar T 等人，Curr Opin Biotechnol. 2002Dec: 13(6) :598-602.)獲得。在瞻菌體展示法中，將編碼人免疫球蛋白可 變區的基因整合入瞻菌體基因。通過使用不同的免疫球蛋白基因作為來源，還可制備瞻菌 體文庫。瞻菌體將可變區表達為構成其本身的蛋白質的融合蛋白。由瞻菌體表達在瞻菌體 表面上的可變區維持對抗原的結合活性。因此，結合抗原或其中表達抗原的細胞等的瞻菌 體的選擇可從瞻菌體文庫篩選其中表達具有期望的結合活性的可變區的瞻菌體。此外，該 樣選擇的瞻菌體顆粒保留編碼具有期望的結合活性的可變區的基因。也就是說，編碼具有 期望結合活性的可變區的基因可在瞻菌體展示法中使用可變區的結合活性作為指標來獲 得。
[0279] 可將根據本發明的用于抑制pDC活性的試劑或抑制pDC活性的方法中的識別PLD4 細胞外結構域的抗體或包含至少其抗原結合區的抗體片段W蛋白質或編碼蛋白質的多核 巧酸的形式進行施用。在施用多核巧酸中，期望使用其中將編碼期望的蛋白質的多核巧酸 置于適當的啟動子控制之下W表達期望的蛋白質的載體。在載體中，還可放置增強子或終 止子。保留構成免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的基因并且可表達免疫球蛋白分子的載體是已知 的。可表達免疫球蛋白的載體可通過將其引入細胞來施用。在對活生物體的施用中，可經 由施用至活生物體中來感染細胞的載體可就該樣直接施用。或者，還可首先將載體引入從 活生物體分離的淋己細胞，隨后將其再返還至活生物體內（離體）。
[0280] 在基于本發明的用于抑制pDC活性的試劑中或抑制pDC活性的方法中給活生物體 施用的單克隆抗體的量，通常為作為免疫球蛋白每化g的體重0. 5mg至lOOmg，例如Img至 50mg，優選2mg至IOmg的量。可適當的調整給活生物體施用抗體的間隔，W便可在治療期 間維持免疫球蛋白在生物體中的有效濃度。具體地，可W例如W 1至2周的間隔進行施用。 施用途徑是任意的。本領域技術人員可在治療中適當地選擇有效施用途徑。具體地，施用 途徑的實例包括口服或非口服施用。例如，可通過靜脈內注射、肌內注射、腹膜內注射、皮下 注射等全身性或局部施用抗體。本發明中用于非口服施用的適當制劑的實例包括注射劑、 栓劑、噴霧劑等。此外，在其中給細胞施用免疫球蛋白的情況下，將免疫球蛋白W通常Iyg/ mU優選IOy g/mL或更高，更優選50]i g/mL或更高，更優選0. 5mg/mL或更高的濃度施用至 培養液。
[0281] 在本發明的用于抑制pDC活性的試劑或抑制pDC活性的方法中，可通過任何方法 將單克隆抗體給活生物體施用。通常地，將單克隆抗體與藥學上可接受的載體混合。必要 時，可將添加劑例如增稠劑、穩定劑、防腐劑和增溶劑與單克隆抗體混合在一起。該樣的載 體或添加劑的實例包括乳糖、巧樣酸、硬脂酸、硬脂酸鎮、藏糖、淀粉、滑石、明膠、瓊脂、植物 油、己二醇等。稱為"藥學上可接受的"的術語是指由每一個國家的政府監管機構批準的，或 每一個國家的藥典或被廣泛承認的藥典中列出的用于動物、哺乳動物和特別地人的那些。 還可W W單次劑量或多份劑量的凍干粉劑或片劑的形式提供本發明的用于抑制pDC活性 的試劑。還可在施用前將凍干粉劑或片劑與無菌水、生理鹽水或注射用緩沖液組合W將組 合物溶解至期望的濃度。
[0282] 此外，在其中W免疫球蛋白表達載體的形式施用本發明的用于抑制pDC活性的試 劑的情況下，用分開的質粒共轉染重鏈和輕鏈，可W W每Ikg體重0. 1至IOmg,例如，1至 Smg的量施用每一種質粒。此外，將1至SygAO6個細胞的載體用于體外引入細胞。在下 文中，將基于實施例更具體地解釋本發明。
[0283] 同時，將本說明書中引用的全部現有技術文獻通過引用并入本說明書。
[0284] 盡管將利用下文中的實施例更具體地描述本發明，但本發明絕不限于該樣的實施 例。 實施例 陽2財 連施例1
[0286] A. PLD4表達的分析
[0287] A-1)使用SAGE文庫的分析
[028引利用SAGE?(基因表達系列分析）法比較靜息pDC、人單核細胞和利用滅活瘡疹病 毒化SV-1)處理的活化pDC中的基因表達。分析方法是如下描述的。
[0289] 從人外周血將單核細胞分離為CD14陽性細胞，利用抓CA-4+分離試劑盒 (Miltenyi Biotec公司）和MACS系統（MiItenyi Biotec公司）將人pDC細胞分離為 抓CA-4陽性細胞。此外，在滅活的HSV-I存在的情況下培養人pDC細胞12小時，從而制 備活化的pDC(pDC+HSV)。從每一種細胞提取總RNA，使用I-SAGE?試劑盒（Invitrogen公 司）制備SAGE文庫。利用SAGE2000分析軟件（Invitrogen公司）分析獲得的約100, 000 個標記的堿基序列的數據。作為其結果，單核細胞/pDC/pDC+HSV的分值為0/9/0基因，也 就是說，發現了 PLD4(磯脂酶D家族，成員4，C14或fl75:GenBank登錄號；NM_138790. 2)， 其為已知的基因，為顯示靜息pDC細胞特異性表達的基因（圖1，Tao等人，化t. Methods 2 巧），591-598 (2005): Clark 等人，Genome Res. 13 (10) ,2265-2270 (2003))。PLD4 為由 SEQ ID N0;44所示的堿基序列編碼的506個氨基酸的序列（SEQ ID N0;1)。PLD4蛋白 具有兩個假定的PDE區域（磯酸二醋酶基序）（由兩個在C末端區域中保守的HKD基序 化is-x-Lys-x-x-x-x-Asp氨基酸序列，X為其它氨基酸）構成）和假定的磯酸化位點（T虹 472)。PLD4蛋白的結構被預測為II型單變跨膜蛋白。此外，PLD4蛋白在N末端區域不具 有PX區域化OX同源性結構域）和PH區域（Pleckstrin同源性結構域），所述區域為屬于 經典PLD家族的PLDl和PLD2所具有（圖I和2)。
[0290] A-2)通過定量實時PCR進行的人的負責免疫的各種細胞中PUMmRNA的表達分析。
[0291] 已特別地檢查了 PUMmRNA在血細胞中的表達。從人外周血通過細胞分選器分離 和獲取每一種細胞。從每一個分離和獲取的細胞家族提取RNA，隨后合成cDNA。通過使用 獲得的CDNA作為模板，進行定量實時PCR，分析PUMmRNA的表達水平。
[029引 對于定量實時PCR反應，使用Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG試劑盒 (Invitrogen公司）利用ABI PRISM 7000進行定量PCR。將序列檢測系統軟件（Applied Biosystem公司）用于數據分析。PCR反應條件和使用的引物的堿基序列如下。
[029引 PLD4 的正向引物：5, ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3'（沈Q ID NO ;扣）
[0294] PLD4 的反向引物；5'TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3'（SEQ ID NO ;46)
[029引 GAPDH 的正向引物；5'AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3'（SEQ ID NO ;47)
[0296] GAPBH 的反向引物；5'GCC CAA TAC GAC CAA ATC C 3'（SEQ ID NO ;48)
[0297] 1個循環，于58 C進行2分鐘，
[029引 1個循環，于95 C進行10分鐘，
[0299] 50個循環[于95 C進行15砂，和于6(TC進行60砂]，
[0300] 檢查了 pDC、利用服V刺激的pDC(pDC+服V)、B細胞（CD19+細胞）、活化的B細胞 (CD19+細胞）、T細胞（CD3+細胞）和利用肌霉素和PMA((12-)十四酸佛波醋（-13-)己 酸鹽）刺激的活化的T細胞。作為結果，顯示了 PLD4表達在處于靜止期的pDC中特別高， 在CDI9+B細胞中低。其它人血級分cDNA使用抓? MTC多組織cDNA板（Multiple Tissue cDNA Panels) (Cat. No. 636750, hkara Bio 公司）（圖 5)。
[030。 A-3)通過定量實時PCR進行的人組織中PUMmRNA的表達分析
[030引 此外，使用ABI PRISM 7000(Applied Biosystem公司）通過定量PCR檢查其 它器官或組織中的表達。作為cDM板，使用抓? MTC多組織CDNA板（Human I:化t. No. 636742, Human immune: Cat. No. 636748:全部來自 Takara Bio 公司）。使用的引物的堿 基序列顯示如下。
[030引 PLD4 的正向引物；5'ATG GAC TGG CGG TCT CTG 3'（SEQ ID NO ;49)
[0304] PLD4 的反向引物：5'TGG AAG GTC TTC TCC AGG TC 3'（SEQ ID NO ;50)
[030引 GAPDH 的正向引物；5'AGC CAC ATC GCT CAG ACA C 3'（SEQ ID NO ;51)
[030引 GAPDH 反向引物；5'GCC CAA TAC GAC CAA ATC C 3'（SEQ ID NO ;52)
[0307]使用 Platinum SYBR Green qPCR Super Mix-UDG 試劑盒（Invitrogen 公司）利 用ABI PRISM 7000進行定量PCR。使用序列檢測系統軟件（Applied Biosystem公司）進 行分析。反應條件描述如下。
[030引步驟1 ; 1個循環，于5(TC進行2分鐘
[0309] 步驟2 ; 1個循環，于95 C進行10分鐘
[0310] 步驟3 ; 50個循環，于95 C進行15砂和于6(TC進行1分鐘
[0311] 通過利用GAPDH(甘油酵-3-磯酸脫氨酶）的基因表達水平進行標準化來比較每 一個組織之間的PLD4基因的表達，已知GAPDH原狀穩定地表達。作為其結果，PUMmRNA在 脾和外周血白細胞中顯示相對高的表達。此外，已發現PUMmRNA廣泛地在其它組織中表 達。然而，PUMmRNA的表達水平少于靜息pDC細胞的表達水平的1/100 (圖6)。
[0312] 人PLD4表達載體的制備
[0313] 進行PLD4基因表達載體的制備W表達人PLD4蛋白。利用EcoRI酶從整合入 PCR4-T0P0 克隆性載體（Open Biosystem, Cat, No. M服4771-99610856)的 PUMcDNA 克隆僅 取出PLD4基因，隨后將其整合入PCDNA3. 1表達載體（人PLD4-PCDNA3. 1載體）。通過使 用獲得的人PLD4-PCDNA3. 1質粒作為模板，利用包含EcoRI、Not I和Kozak序列佑CC GCC ACC)的引物（引物的信息如下所述）擴增PLD4基因。利用pMX-IP逆轉錄病毒載體（人 PLD4-PMX-IP逆轉錄病毒載體）將PCR產物克隆在EcoRI和Not I位點。在PCR反應中，使 用1個單位的KOD Plus DNA聚合酶（T0Y0B0公司），反應條件為1個循環（于94C進行2 分鐘），隨后于94C進行15砂和于68C進行1分鐘30砂的25個循環。
[0314] 正向引物（SEQ ID NO ;53) GAA TTC gcc gcc acc ATG CTG AAG CCT 3'（30-聚體） 峽巧]反向引物（SEQ ID NO ;54) :5'aaa gcg gcc gcT CAG CCC TGC CAA ACG CAG TCC T 3'（34-聚體）
[0316] 與序列分析一起，利用人PLD4-PMX-IP逆轉錄病毒瞬時轉染肥K (人胚胎腎）-293T 細胞（在下文中，293T細胞），通過細胞染色，隨后進行FACS法來確認人PLD4是否在293T 細胞的表面上表達。 陽317] 連施例2
[031引抗-人PLD4抗體的特異性的檢查
[0319] 可利用其中強制表達每一個PLD家族的細胞來確認抗-PLD4單克隆抗體不與PLD 家族的其它分子交叉反應的事實。人PLD4屬于PLD家族，存在多個具有高度同源性的分子。 人口0)4顯示與人？0)3的約41%的同源性，和與人？0)5的約29.3%的同源性（圖4)。
[0320] 1)人PLD3和人PLD5的表達載體的制備
[032U 對于人 PLD3(cDNA SEQ ID NO ;55,氨基酸 SEQ ID NO ;127)和人 PLD5(cDNA SEQ ID N0;56,氨基酸SEQ ID側；123)，利用？0?從整合入9〔1￥-5?0^6載體的人？0)3克隆 化.K. DNAFORM 公司，Cat. No 5189261)，和整合入 pCR-Blunt II-TOPO 載體的人 PLD5 克隆 化.K. DNAFORM公司，Cat. No 40025860)僅擴增PLD3和PLD5基因，將每一個基因克隆在 Flag-標記的pcDNA3. 1 (Invitrogen公司）的Hind III和EcoRI位點上，從而制備表達載 體（引物的信息是如下描述的）。
[0322] (對于人 PLD3)
[0323] 正向引物；huPLD3-IF化ind III)
[0324] 序列；5' ttt MG CTT gcc gcc acc ATG MG CCT MA CTG ATG TAC 3'（39-聚體） 沈Q ID NO ;57)
[032引 反向引物；huPLD4-1518R(EcoRI)
[032引 序列：5' ttt gaa ttc TCA ctt ate gtc gtc ate ctt gta ate GAG CAG GCG GCA GGC GTT GCC 3,巧7-聚體）（SEQ ID NO ;58)
[0327] (對于人 PLD5)
[0328] 正向引物；huPLD5-IF化ind III)。
[0329] 序列；5' ttt MG CTT gcc gcc acc ATG GGA GAG GAT GAG GAT GGA 3'（39-聚體） (SEQ ID NO :59)
[0330] 反向引物；huPLD5-1383R (EcoRI)
[0331] 序列；5'ttt gaa ttc TCA ctt ate gtc gtc ate ctt gta ate TAC GTT CCG GGG ATC CTT TCC 3' 巧7-聚體）（SEQ ID NO ;60)
[0332] 在上述引物序列中，加W下劃線的部分代表編碼添加的FLAG標簽的堿基序列，斜 體字類型代表限制性內切酶的Hind III切割位點或EcoRI位點。
[0333] 與序列分析一起，利用人PLD3-PCDNA3. 1載體或人PLD5-PCDNA3. 1載體瞬時轉染 293T細胞，通過細胞染色，隨后通過FACS法確認人PLD4是否在293T細胞的表面上表達。
[0334] 作為其結果，抗體不與其中顯示表達人PLB3或人PLD5的細胞反應，該表明該些 抗-PLD4抗體特異性識別人PLD4分子（圖8)。
[0335] 人PLD4表達細胞穩定株的制備
[0336] 將制備的人PLD4-PMX-IP載體與作為逆轉錄病毒包裝載體的P化-Eco載體 (IMGE肥X，化t. No. 10045巧一起共轉染至293T細胞，從而進行基因引入。基因引入實驗 使用化GENE(注冊商標）皿轉染劑（Roche)作為轉染劑。2天后，收集其中分泌了含有人 PLD4基因的逆轉錄病毒的細胞培養上清液，用其感染CT125細胞株（2B4小鼠T細胞淋己細 胞腫瘤細胞系）。根據PMX-IP逆轉錄病毒載體包含抗嘿嶺霉素基因的事實，在嘿嶺霉素存 在的情況下培養感染的CT125細胞僅允許表達人PLD4的細胞存活，從而導致其選擇。通過 FACS分選術進一步將已選擇的人PLD4表達CT125細胞（在下文中，人PLD4-CT125)選擇 為僅允許人PLD4的更高表達的CT125細胞，培養所述細胞。為了確定人PLD4表達，利用調 整至5 y g/mL的商購可得的小鼠抗-人PLD4多克隆抗體（Abnova，Cat#:冊0122618-B01巧 對CT125細胞進行染色，隨后進行FACS分析。作為其結果，建立了人PLD4-CT125細胞穩定 株，將其用于雜交瘤的FACS篩選。
[0337] 食蟹猴和恒河猴的PLD4表達載體的構建，和人PLD4表達細胞穩定株的制備 [033引為了表達食蟹猴和恒河猴的PLD4蛋白，進行猴PLD4基因的克隆和表達載體的構 建。
[0339] 1)食蟹猴PLD4和恒河猴PLD4基因的克隆
[0340] 在Genbank數據庫狂M_002805227. 1)等中報道了恒河猴的PLD4的cDNA序列（但 為部分），其全長CDNA未見報道。此外，由于食蟹猴的PLD4基因序列仍無報導，因此從食蟹 猴和恒河猴的 PBMC (分別地 10血；SHIN NIPPON BIOMEDICAL LABORATORIES, LTD.)進行基 因克隆。
[0341] 從猴子的外周血提取總RNA，使用寡-dT引物和Superscript Choice System for cDNA Synthesis試劑盒從5 y g的總RNA合成cDNA。
[0342] 通過使用制備的cDNA作為模板，使用具有下列堿基序列的引物，利用PCR法擴增 食蟹猴PLD4和恒河猴PLD4基因。
[034引 正向引物（cynoPLD4-32巧；5'AGA TGC TGA AGC CTC TTC GGA GAG Cg 3'（沈Q ID NO ：61)
[0344]反向引物（cynoPLD4-1554R) ;5'TCA GCC CTG CCA AAC GCA GTC CTG G3'（SEQ ID NO :62)
[034引使用1 %瓊脂糖凝膠通過電泳分離經擴增的食蟹猴PLD4的約1521個堿基對和恒 河猴PUMcDNA片段的1521個堿基對，收集其，使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning試劑盒 (Invitrogen公司）將其克隆入pCR4Blunt-T0P0質粒載體（Invitrogen公司）。分析獲得 的基因的堿基序列，所述序列由SEQ ID NO ;63和SEQ ID NO ;124表示。確認了期望的食蟹 猴PLD4和恒河猴PLD4基因能夠被克隆。
[0346] 人PLD4蛋白顯示與食蟹猴PLD4(SEQ ID NO ;129)具有約94. 4%的蛋白質序列同 一性，和與恒河猴PLD4(SEQ ID N0;130)具有約94%的蛋白質序列同一性。圖14舉例說 明人口0)4與食蟹猴口0)4、恒河猴口0)4和小鼠口0)4(。0臟569 10^;131，氨基酸569 10 NO ;132)的蛋白質序列的同源性。
[0347] 2)食蟹猴PLD4表達細胞穩定株的制備
[0348] 食蟹猴PLD4表達細胞穩定株通過使用制備的食蟹猴PLD4-PMX-IP載體W與制備 人PLD4表達細胞穩定株的方法相同的方法，在嘿嶺霉素存在的情況下培養利用逆轉錄病 毒載體感染的CT125細胞來建立。
[0349] 為了確定食蟹猴的PLD4表達，用商購可得的小鼠抗-人PLD4多克隆抗體（其還 代表與猴PLD4的交叉反應性）（Abnova，Cat# ;冊0122618-B01巧對細胞進行染色，隨后進行 FACS分析。作為其結果，建立了食蟹猴PLD4-CT125細胞穩定株，將其用于雜交瘤的FACS篩 選（圖16)。
[0350] 人PUM-Ig融合蛋白的制備
[0351] 為了用作抗-人PLD4單克隆抗體的制備中的免疫原，利用2步PCR法擴增其中融 合人PLD4蛋白的細胞外區域（56-506a. a)與小鼠IgG2a化片段（包含重鏈較鏈的部分、 C肥和C冊的234個a. a)的2142bp的DNA片段，構建人PUM-Ig PCDNA3. 1和人PUM-Ig 祀E14. 4的表達載體質粒（cDNA和蛋白質的序列示于序列表中）。 防35引為了從培養上清液獲得蛋白質，將Maxi-prep DNA瞬時轉染至化eest^e 293F細 胞（在下文中，293F細胞，catalog No.R790-07:Invitrogen)。在轉染后7天，將共轉染 的293F細胞的培養液收集在50mL管中，在4°C于2, 070g的條件下離也5分鐘。利用具有 0. 45 y m孔徑的注射器式濾器（catalog No. 431220: CORNING)過濾上清液，將培養上清液 收集在一起。
[0巧3] 利用AKTA-FPLC系統的蛋白A親和柱純化收集的細胞培養上清液，純化重組人 PUM-Ig融合蛋白的蛋白質（圖7)。 。巧4] 連施例3
[0355] A.抗-人PLD4單克隆抗體的制備 [0巧6] A-1)免疫
[0巧7] 使用上述重組PUM-Ig融合蛋白作為免疫原。將PUM-Ig融合蛋白皮下施用至3 只BALB/c小鼠的背部。將弗氏佐劑（完全和不完全）（SIGMA)用作佐劑，第一次W 200 y g/ 小鼠施化第二至第四次W 50 y g/小鼠施用。
[0巧引 A-2)抗-血清滴度的確認
[0巧9] 在第3次免疫和第4次免疫后收集血液，利用化ISA評估血清中的抗-PUM-Ig滴 度。
[0360] 將PUM-Ig融合蛋白固相化于96孔微量滴定板中。將抗血清從1，000倍開始乘3 逐步稀釋，將稀釋系列制備至729, 000倍。將每一個樣品W 50 y L添加至抗原固相化的板 中，進行初次反應。洗涂后，利用HRP標記抗-小鼠IgG(K, A)抗體進行二次反應，隨后利 用OPD (鄰-苯二胺）進行顏色檢測（490nm)。
[036。 A-3)細胞融合
[036引從對于其抗血清滴度的增加得到驗證的小鼠分離脾細胞。利用陽G法融合分離的 脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞（P3U1)，從HAT培養基進行融合脾細胞的選擇和培養。
[0363] 使用CAL-I細胞的雜交瘤的FACS篩選
[0364] 利用FACS評價產生獲自HAT選擇培養的融合脾細胞的每一個克隆的抗體。將 2 X IO5個人pDC樣細胞株CAkl細胞與50 y L的每一個下述雜交瘤的培養上清液在4°C反 應15分鐘。用FACS緩沖液（1% FBS+PBS)洗涂細胞2次，隨后離也，取出上清液。使用PE 標記抗-小鼠IgG抗體炬D Bioscience :550589)作為第二抗體在4°C反應20分鐘。將從 HAT選擇培養開始10天后的培養液用作每一個克隆的培養上清液的原始倍數。作為其結 果，雜交瘤培養上清液的 3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1 和 11G9. 6 與 CAL-I細胞良好反應（圖11)。
[0365] 使用人PLD4-CT125穩定細胞株的雜交瘤的FACS篩選
[0366] 利用FACS評價產生獲自HAT選擇培養的融合脾細胞的每一個克隆的抗體。將 2 X IO5個人PLD4-CT125與50 y L的每一個下述雜交瘤的培養上清液在4°C反應15分鐘。用 FACS緩沖液（1 % FBS+PBS)洗涂細胞2次，隨后離也，取出上清液。使用陽標記抗-小鼠IgG 抗體炬D Bioscience :550589)作為第二抗體在4°C反應20分鐘。作為其結果，雜交瘤培 養上清液的 3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1 和 11G9. 6 與人 PLD4-CT125 細胞良好反應（圖12)。
[0367] A-5)使用人外周血pDC的FACS篩選 [036引[人PBMC的分離]
[036引收集20血的健康個體的外周血，使用HIST0PAQ肥-1077 (SIGMA公司）利用比重離 也機分離外周血單核細胞（PBMC)。將每一個樣品的IX IO6PBMC染色。用FACS緩沖液洗 涂細胞，隨后添加化封閉試劑（Militenyi公司）的5倍稀釋物25 y L在4°C反應15分 鐘。用FACS緩沖液洗涂細胞，隨后添加50 y L的每一個雜交瘤的細胞培養上清液和小鼠 IgG2b，K，在4°C反應20分鐘。用FACS緩沖液洗涂細胞，隨后添加PE標記抗-小鼠IgG抗 體，在4°C反應20分鐘。用FACS緩沖液洗涂細胞，隨后添加APC標記抗-BDCA2抗體的10 倍稀釋物50 y L，在4°C反應20分鐘。用FACS緩沖液洗涂細胞，隨后將其重息浮于300 y L 的FACS緩沖液中，利用FACS Calibur炬D)進行分析。mpllG9. 6抗體顯示對pDC的結合（圖 10)。
[0370]此外，9 個類型的 PLD4 抗體 3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11 和 14C1 顯示對于pDC細胞群的特異性結合反應，所述pDC細胞是抓CA2陽性細胞（圖13)。
[037。 A-6)抗-PLD4抗體對猴的交叉反應性
[0372] 使用食蟹猴PLD4-CT125穩定細胞株和恒河猴PLD4-293T瞬時轉染子細胞的雜交 瘤的FACS篩選
[0373] 利用FACS評價產生獲自HAT選擇培養的融合脾細胞的每一個克隆的抗體。將 2X IO5個人PLD4-CT125與50 y L的每一個下述雜交瘤的培養上清液在4°C反應15分鐘。 用FACS緩沖液（1% FBS+PBS)洗涂細胞2次，隨后離也，取出上清液。使用陽標記抗-小 鼠IgG抗體炬D Bioscience :550589)作為第二抗體在4°C反應20分鐘。作為其結果，10 個類型的PLD4抗體中有7個類型的抗體384、587、784、1304、13化1、14(：1和1169.6與食蟹 猴PLD4-CT125細胞和恒河猴PLD4-293T細胞良好反應（圖15,圖16和圖17)。
[0374] A-7)抗-PLD4抗體對猴PBMC的交叉反應性
[037引 使用 96% Ficol^化que (商標）化US (GE Healthcare 公司，Cat No. 17-1440-02) 利用比重從外周血（10血:SHIN NIPPON BIOMEDICAL LABORATORIES, LTD.)離也恒河猴的 PBMC。對于FACS,每樣品使用5X IO5個細胞。用FACS緩沖液洗涂細胞，隨后添加10 y L 的10%的利用FACS緩沖液稀釋的食蟹猴血清，在4°C反應20分鐘。用FACS緩沖液洗涂細 胞，隨后添加IOOy L的每一個雜交瘤的細胞培養上清液和IOy g/血的小鼠IgG2a，K或 小鼠IgGl, K，在4°C反應15分鐘。用FACS緩沖液洗涂細胞，隨后添加1 y g/mL的APC標 記抗-小鼠IgG抗體，在4°C反應20分鐘。用FACS緩沖液洗涂細胞，隨后添加FITC標記 抗-譜系1抗體、陽標記抗-CD123抗體和化rCP-切5. 5標記抗-HLA-DR抗體的10倍稀釋 物25 y L，在4°C進行15分鐘。用FACS緩沖液洗涂細胞，隨后重息浮于300 y L的FACS緩 沖液中，用FACS calibur進行分析。使用的雜交瘤培養上清液特異于PLD4,選擇與CAkl 細胞或人 pDC 良好結合的 10 種類型；3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1 和 11G9. 6。作為其結果，5個類型的雜交瘤細胞培養上清液即5B7、7B4、13D4、13H11和14C1特 異性結合食蟹猴的pDC細胞群（譜系-CD123+HLA-DR+)(圖18)。
[0376] A-8)通過有限稀釋法進行的雜交瘤的克隆
[0377] 1)通過有限稀釋法進行的克隆和第2次篩選
[0378] 為了 克隆經選擇的 9 個類型（3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11 和 14C1)的雜交瘤（除11G9. 6雜交瘤外），進行有限稀釋。將有限稀釋物接種在2塊96孔板 上。接種后6天，在顯微鏡下觀察細胞，收集所有孔中作為單克隆來源的并且顯示良好生長 的培養上清液。W收集的培養上清液作為樣品進行FACS分析。
[0379] 在FACS分析中，使用每一個克隆的培養上清液來對細胞株CAL-I的表面抗原進行 染色，隨后將PE標記抗-小鼠IgG抗體炬D Bioscience :550589)用作第二抗體來染色。 作為每一個克隆的培養上清液，將有限稀釋物接種后7天的培養液用作原始倍數。
[0380] 2)克隆和第3次篩選
[0381] 基于第2次篩選的FACS分析結果和每一個孔中的細胞狀態，從每一個克隆選擇1 個孔，再次進行有限稀釋。如2)類似地進行有限稀釋，W收集的培養上清液作為樣品進行 FACS分析（第3次）。基于FACS分析數據等，通過有限稀釋法克隆了下列9個類型（3B4、 5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11和14C1)的克隆，并將抗-人PLD4抗體生成雜交瘤 建立為穩定細胞株。
[0382] 3)至單個11G9. 6雜交瘤的轉化
[038引收集11G9. 6雜交瘤而非上述9個類型，用分選緩沖液（1% FBS/PB巧將其息浮至 lXl05個細胞/mL。使用FACS Aria炬D)進行單細胞分選。整合數據，將整合的數據產生 為X軸：FSC和Y軸；SSC的二維點陣圖。在點陣圖上，用口（gate)包圍活細胞。將口覆蓋 W從活細胞口中的細胞排除雙聯體，分離細胞群體，將其置于96孔平板中至為1個細胞/ 孔。將單細胞分選后的細胞培養在HAT培養基（RPMI1640+2mM k谷氨醜胺，10化it/mL青 霉素-鏈霉素，IOmM肥陽S，ImM丙麗酸軸，50 y M 2-ME) +雜交瘤生長補充劑HFCS (Roche 公司）中。隨后，使用雜交瘤的細胞培養上清液對CAL-I細胞、人PLD4-CT125表達穩定細 胞株、人PBMC和猴PLD4-CT125表達穩定細胞株進行染色，選擇單個雜交瘤的11G9. 6。
[0384] 4)冷凍細胞小瓶的制備和培養上清液的收集
[0385] 基于上述FACS分析結果和每一個孔的細胞狀態，從每一個克隆選擇1個孔。對于 選擇的孔，W 50mL規模進行擴增培養。培養基為包含10% FCS和青霉素-鏈霉素的RPMI 1640。將細胞培養至亞匯合，冷凍，W IX IO6個細胞/管的細胞數目進行保藏。作為用于 冷凍和保藏的液體，使用BAMBANKER(NIPPON Genetics, Co. Ltd.)。此外，收集和保藏此時的 培養上清液。
[0386] 實施例4
[0387] 抗體的純化
[038 引 通過使用蛋白 A 親和柱（rProtein A Se 地 arose Fast Flow (catalog No. 17-1279-01，GE Healthcare公司）的純化從雜交瘤的培養上清液獲得10個類型（3B4、 5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1 和 11G9. 6)的純化的抗體。使用 Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司）確認同種型。 作為其結果，3B4和14C1為小鼠IgGl，K，l0C3為小鼠IgG2a，K，其它為小鼠IgG2b，K。進 行內毒素濃度的測量，因為如果內毒素包含在純化的抗體中，則其可對性質測定試驗的結 果具有影響。使用的試劑盒為化dospecy ES-50M set、Toxicolor DIA-MP set和內毒素標 準CSE-L set (SEIKAGAKU BIOBUSI肥SS CORPORATION公司）。作為其結果，任何純化的抗體 的內毒素濃度為作為參照值的0. 3抓/mg或更少的Ab。
[0389] 純化的抗體的反應性的檢查
[0390] 利用為人pDC樣細胞株的CAL-I細胞確認純化的抗體的結合能力。作為結果，可 確認任何抗體維持對細胞表面上的人PLD4的結合能力（圖11)。此外，抗體還特異性結合 人外周血的pDC細胞群炬DCA化）（圖13)。
[0391] 純化的PLD4抗體的Kd值的計算
[0392] 對于純化的抗體的結合能力，將人PLD4-CT125表達穩定細胞株在低濃度至高濃 度化OOl y g/mL至30 y g/mL)的純化的PLD4抗體濃度上反應至幾乎100%的陽性染色率。 使用Graph Pad Prism第5版軟件對染色陽性的細胞的頻率和抗體進行數據分析，WnM為 單位計算解離常數摩爾濃度（Kd值）。根據抗-PLD4抗體的Kd值（nM)都為InM或更小或差 不多InM (除2個克隆3B4和14C1外）的事實，抗-PLD4抗體非常強地結合人PLD4-CT125 細胞（圖19)。
[039引 連施例5
[0394] 抗-PLD4抗體對于表達人PLD4-CT125細胞的補體依賴性細胞毒性活性
[0395] 使用未成熟兔血清作為補體來源針對表達人PLD4的CT125細胞穩定株（在下 文中，稱為化PLD4-CT-125)測量抗-PLD4抗體的補體依賴性細胞毒性活性（在下文中， 稱為CDC活性）。活性的指標為從由細胞釋放的乳糖酶脫氨酶（LDH)的測量值計算的細 胞毒性。將每一種細胞W 2X IO4個細胞/50 y L/孔分配至96孔U底板。在CDC培養基 (RPMI1640+0. 1% BSA+lOmM肥陽S+2mM心谷氨醜胺+1%化n-Strep)中制備1%幼兔補 體仰DARLANE公司）。給細胞添加IOy g/mL的小鼠同種型對照抗體（小鼠IgG2b，K )和 10 個類型的抗-PLD4 小鼠純化抗體（3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1 和 11G9. 6)，反應 1 小時。關于測定系統，使用切toTox 96Non-Radioactive 切totoxicity Assay(Promega公司）試劑盒。作為其結果，對于祀細胞HuPLD4-CT-125,8個類型的PLD4 抗體巧 B7、7B4、8Cll、10C3、llD10、13D4、13Hll和llG9.6)在10yg/mL的抗體濃度上顯示 約33. 5%至71. 1%的CDC活性（除2個類型的其重鏈同種型為小鼠IgGl的PLD4抗體3B4 和14C外）（圖20)。
[0396] 實施例6
[0397] 濃度依賴性、補體依賴性細胞毒性活性
[0398] 將抗-PLD4抗體（11G9. 6)的小鼠同種型對照抗體（小鼠IgG2b，K )、抗-PLD4小 鼠抗體（mpllG9. 6Ab)、人同種型對照抗體（人IgGl, K )和抗-PLD4嵌合抗體（chllG9Ab) 調整至0. 1 y g/mL至30 y g/mL的總共6個點的抗體濃度。作為測定系統，使用切toTox 96Non-Radioactive切totoxicity Assay(Promega公司）試劑盒。作為其結果，對于革己細 胞11證〇)4-口'-125，11^1169.646在311肖/血的抗體濃度上顯示約70%的濃度依賴性〔0(：活 性。在另一方面，作為嵌合抗體的chllG9Ab甚至在30y g/mL的高濃度上顯示10%或更小 的CDC活性（圖21)。
[039引 連施例7
[0400] 嵌合抗體的制備
[0401] 將10個類型制備為產生小鼠抗-PLD4抗體的雜交瘤，并使用。
[0402] 1.恒定區的同種型的確認
[0403] 確認從產生抗-PLD4抗體的雜交瘤產生的小鼠抗-PLD4抗體的恒定區的同種型。 使用 Pierce Rapid ELISA Mouse mAb Isotyping 試劑盒（Thermo Fisher Scientific 公 司）從 10 個類型（3B4、5B7、7B4、8C11、10C3、11D10、13D4、13H11、14C1 和 11G9. 6)的雜交瘤 的培養上清液確認同種型。作為其結果，3B4和14C1為小鼠IgGl和小鼠IgK，10C3為小鼠 IgG2a和小鼠IgK，其它為小鼠IgG化和小鼠IgK。
[0404] 2.編碼小鼠抗-PLD4抗體的可變區的cDNA的克隆
[040引 2-1)總RNA的分離
[0406] 按照試劑盒所附說明書，使用商購可得試劑盒"RNeasy Mini試劑盒"(Qiagen公 司，catalog No. :74106)從11G9. 6雜交瘤分離總RNA。從細胞數目為5X IO6個的雜交瘤 細胞株制備其，獲得約79 y g總RNA。
[0407] 2-2)編碼小鼠重鏈可變區的CDNA的擴增和片段化
[040引使用5y g在2-1)中分離的總RNA，通過5'RACE PCR法擴增編碼小鼠重鏈可變區 的cDNA。在擴增中，使用商購可得試劑盒"5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, 2.0 版試劑盒"（Invitrogen 公司，catalog No. :18374-058)。細節如下。首 先，通過逆轉錄酶從2-1)中獲得的總RNA合成單鏈cDNA。此時，使用的反義引物佑SP1)如 下。取決于每一條小鼠重鏈的同種型，不同地使用CDNA擴增中使用的GSPl引物。
[0409] 例如，在具有小鼠IgGl重鏈的3B4和14C1雜交瘤的重鏈可變區的克隆中，使用下 列反義引物。
[0410] GSPl 引物；mu IgGlVH-GSPl
[0411] 序列；5' -CCA GGA GAG TGG GAG AGG CTC TTC TCA GTA TGG TGG-3'（36-聚體） (SEQ ID NO ：64)
[0412] GSP2 引物：mu IgGlVH-GSP2
[0413] 序列；5' -GGC TCA GGG AAA TAG CCC TTG ACC AGG CAT CC-3,（32-聚體）（SEQ ID NO ;化）
[0414] 在具有小鼠IgG2a重鏈的10C3雜交瘤的重鏈可變區的克隆中，使用下列反義引 物。
[04巧]GSPl 引物：mu IgGHy I-GSPl
[041 引 序列：5, TCC AGA GTT CCA GGT CAC TGT CAC 3'（24-聚體）（SEQ ID NO ;66)
[0417] GSP2 引物：mu IgGHy 1-GSP2
[041 引 序列：5, AGG GGC CAG TGG ATA GAC AGA TGG 3'（24-聚體）（SEQ ID NO ;67)
[0419] 在具有小鼠 IgG化重鏈的 5B7、7B4、8C11、11D10、13D4、13H11 和 11G9. 6 雜交瘤的 重鏈可變區的克隆中，使用下列反義引物。
[0420] GSPl 引物；mu IgGHy 2B-GSP1
[04引]序列：5, TCC AGA GTT CCA AGT CAC AGT CAC 3'（24-聚體）（SEQ ID NO ;68)
[0422] GSP2 引物：mu IgGH Y 2B-GSP2
[0423] 序列：5, AGG GGC CAG TGG ATA GAC TGA TGG 3'（24-聚體）（SEQ ID NO ;69)
[0424] 此外，使用末端脫氧核巧醜轉移酶（TdT)向單鏈CDNA的3'末端添加為核巧酸同 聚物的dC。隨后，使用在3'末端具有與dC(銷定序列）互補的核巧酸聚合物的銷定引物 (SEQ ID N0;70)和反義引物佑SP2)通過PCR法擴增cDNA。此外，使用獲得的PCR產物作 為模板和使用AUAP引物（SEQ ID NO ;71)和表1中顯示的反義引物佑SP2)，通過巢式PCR 法擴增cDNA。此外，通過1. 5 %的低烙點瓊脂糖法純化該PCR產物。
[042引用于5' RACE的銷定引物（SEQ ID NO ;70)
[0426] 5' -GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3' 36-聚體）
[0427] 用于 5' RACE 的 AUAP 引物（SEQ ID NO ;71)
[0428] 5, -GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3, 20-聚體）
[0429] 2-3)編碼小鼠輕鏈可變區的CDNA的擴增和片段化
[0430] 與2-。類似地，從在2-1)中分離的總RNA擴增編碼小鼠輕鏈可變區的cDNA。此 時，取決于每一條小鼠輕鏈的同種型，不同地使用用于CDNA擴增的GSPl引物。
[0431] 由于10個類型的PLD4抗體具有小鼠IgK輕鏈，因此將下列反義引物用于輕鏈克 隆。
[0432] GSPl 引物：mu IgG VLk -GSPl
[0433] 序列；5,-CAC TAC TTC CTG TTG AAG CTC TTG ACG ATG G-3,（31-聚體）（SEQ ID NO ：72)
[0434] GSP2 引物：mu IgG VLk -GSP2
[04巧]序列；5' -GTG AGT GGC CTC ACA GGT ATA GC-3,（23-聚體）（SEQ ID NO ;7：3)
[0436] 通過1. 5%的低烙點瓊脂糖法純化獲得的PCR產物。
[0437] 2-4) CDNA堿基序列的確認和CDR區的確定
[0438] 按照試劑盒所附說明書，使用商購可得試劑盒"Zero Blunt TOPO PCR Cloning 試劑盒"（Invitrogen 公司，catalog No. :1325137),利用pCR4Blunt-T0P0 載體分別克隆 2-2)中獲得的重鏈可變區和2-3)中獲得的輕鏈可變區的cDNA片段，將克隆產物轉化至 大腸桿菌感受態細胞W獲得大腸桿菌轉化子。從該轉化子獲得質粒，將質粒DNA樣品送至 Operon Biotechnology Co. Ltd公司（Tokyo)進行序列分析，確認質粒中的cDNA堿基序列。 在序列分析中，使用"Sequencher DNA sequence assembly and analysis 軟件 4. 2. 2 版 (Gene Codes Co 巧 oration)"和"GE 肥 TYX-MAC 11. I. I 版軟件（GE 肥 TYX CORPORATION)"的 軟件。
[0439] 提取正確序列的轉錄物，不包括無活性RNA的轉錄物（因為移碼、無義突變等 存在于互補決定區（在下文中稱為"CDR區"）的周圍）。此外，對于質粒中包含的CDNA 堿基序列，確認與免疫球蛋白數據庫的同源性（I濁LAST,冊L ；www. ncbi. nlm. nih. rov/ I油last/)，按照K油at編號系統的分析方法化油at尊人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health Publication No. 91-3242,第 5 片反，united States Department of Health and Human Services, Bethesda, MD)，測定每 一個可變區中的CDR區（CDR:CDR1、CDR2和CDR3)、FW區（構架區）和可變區的序列。
[0440] 獲得的小鼠11G9. 6抗體的重鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;74,氨基酸序列 為SEQ ID NO ;75。小鼠11G9. 6抗體的重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分 別為沈Q ID NO ;2、SEQ ID NO ;3 和沈Q ID NO ;4。
[0441] 獲得的小鼠3B4抗體的重鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;76,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;77。小鼠3B4抗體的重鏈可變區的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;8、SEQ ID NO ;9 和沈Q ID NO ; 10。
[0442] 獲得的小鼠5B7抗體的重鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;78,氨基酸序列為 SEQ ID N0;79。小鼠地7抗體的重鏈可變區的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO; 14、沈Q ID NO; 15 和沈Q ID NO; 16。
[0443] 獲得的小鼠7B4抗體的重鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;80,氨基酸序列為 SEQ ID N0;81。小鼠7B4抗體的重鏈可變區的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO; 14、SEQ ID NO; 15和SEQ ID NO; 16。7B4抗體為具有與地7抗體的重鏈和輕鏈可變 區CDR序列相同的重鏈和輕鏈可變區CDR序列的抗體。
[0444] 獲得的小鼠8C11抗體的重鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;82,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;83。小鼠8C11抗體的重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為 沈Q ID NO ;20、沈Q ID NO ;21 和沈Q ID NO ;22。
[044引獲得的小鼠10C3抗體的重鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;84,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;85。小鼠10C3抗體的重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為 沈Q ID NO ;26、沈Q ID NO ;27 和沈Q ID NO ;28。
[0446] 獲得的小鼠IlDlO抗體的重鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;86,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;87。小鼠IlDlO抗體的重鏈可變區的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為 SEQ ID NO ;26、SEQ ID NO ;27 和 SEQ ID NO ;28。IlDlO 抗體為具有與 10C3 抗體的重鏈相 同的輕鏈可變區CDR序列的抗體。然而，重鏈同種型（10C3為小鼠IgG2a的恒定區，IlDlO 為小鼠IgG化的恒定區）不同。
[0447] 獲得的小鼠13D4抗體的重鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;88,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;89。小鼠13D4抗體的重鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為 沈Q ID NO ;32、沈Q ID NO ;33 和沈Q ID NO ;34。
[0448] 獲得的小鼠13化1抗體的重鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;90,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;91。小鼠13H11抗體的重鏈可變區的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為 沈Q ID NO ;38、沈Q ID NO ;39 和沈Q ID NO ;40。
[0449] 獲得的小鼠14C1抗體的重鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;92,氨基酸序列為 SEQ ID NO ;93。小鼠14C1抗體重鏈可變區的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;38、SEQ ID NO ;39和SEQ ID NO ;40。14C1抗體為具有與13H11抗體的重鏈和輕鏈 可變區的CDR序列相同的重鏈和輕鏈可變區的CDR序列的抗體。然而，重鏈同種型（13H11 為小鼠IgG化的恒定區，14C1為小鼠IgGl的恒定區）是不同的。
[0450] 小鼠11G9. 6抗體的輕鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;94,氨基酸序列為SEQ ID NO ;95。小鼠11G9. 6抗體的輕鏈可變區的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;5、SEQ ID NO ;6 和沈Q ID NO ;7。
[045。 小鼠3B4抗體的輕鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;96,氨基酸序列為SEQ ID NO ;97。小鼠3B4抗體的輕鏈可變區的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO : 11、沈Q ID N0;12 和沈Q ID N0;13。
[045引小鼠地7抗體的輕鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;98,氨基酸序列為SEQ ID NO ;99。小鼠地7抗體的輕鏈可變區的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO : 17、沈Q ID N0;18 和沈Q ID N0;19。
[0453] 小鼠7B4抗體的輕鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ; 100,氨基酸序列為SEQ ID NO ;101。小鼠7B4抗體的輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID N0;17、沈Q ID N0;18 和沈Q ID N0;19。
[0454] 小鼠8C11抗體的輕鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;102,氨基酸序列為SEQ ID NO ;103。小鼠8C11抗體的輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID N0;23、沈Q ID N0;24 和沈Q ID N0;25。
[045引小鼠10C3抗體的輕鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;104,氨基酸序列為SEQ ID NO ;105。小鼠10C3抗體的輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID N0;29、沈Q ID N0;30 和沈Q ID N0;31。
[045引小鼠IlDlO抗體的輕鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;106,氨基酸序列為SEQ ID NO ;107。小鼠IlDlO抗體的輕鏈可變區的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;29、沈Q ID NO ;30 和沈Q ID NO ;31。
[0457] 小鼠13D4抗體的輕鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;108,氨基酸序列為SEQ ID NO ;109。小鼠13D4抗體的輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;35、沈Q ID NO ;36 和沈Q ID NO ;37。
[045引小鼠13化1抗體的輕鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;100,氨基酸序列為SEQ ID NO ;111。小鼠13H11抗體的輕鏈可變區的CDRUCDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;41、沈Q ID NO ;42 和沈Q ID NO ;43。
[0459] 小鼠14C1抗體的輕鏈可變區的核酸序列為SEQ ID NO ;112,氨基酸序列為SEQ ID NO ;113。小鼠14C1抗體的輕鏈可變區的CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別為SEQ ID NO ;41、沈Q ID NO ;42 和沈Q ID NO ;43。
[0460] 3.嵌合抗體11G9. 6的表達載體的制備
[0461] 3-1.編碼人Ig恒定區的cDNA的克隆
[0462] 按照試劑盒所附說明書，使用商購可得試劑盒"Zero Blunt TOPO PCR Cloning試 劑盒"（由 Invitrogen 公司生產的，catalog No. :1325137),分別用 pCR4Blunt-T0P0 載 體從人PBMC的總RNA克隆人IgGl重鏈恒定區和人Ig K輕鏈恒定區的cDNA，將其轉化至 大腸桿菌感受態細胞W獲得大腸桿菌轉化子。從該轉化子獲得質粒，將質粒DNA樣品送至 Operon Biotechnology Co. Ltd(Tokyo)進行序列分析，確認質粒中的cDNA堿基序列。
[046引 3-2.編碼嵌合PLD4抗體的重鏈的cDNA的制備
[0464] 通過與具有在2-2中獲得的小鼠11G9. 6抗體的重鏈可變區和人IgGl的重鏈恒定 區的祀E6. 4載體表達載體的連接來制備編碼嵌合PLD4抗體的重鏈的cDNA。利用PCR法擴 增小鼠11G9. 6抗體的重鏈可變區，獲得約450個堿基長度的PCR產物。此時，引物是如表 1中顯示的。通過1. 5%的低烙點瓊脂糖法純化獲得的PCR產物。
[0465] [表 1]
[0466] 表 1
[0467]

【權利要求】
1. 一種結合磷脂酶D4(PLD4)蛋白的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段。
2. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有作為 CDR1的序列SYWMH、作為CDR2的序列DIYPGSDSTNYNEKFKS以及作為CDR3的序列GGWLDAMDY。
3. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區中具有作為 CDR1的序列RASQDISNYLN、作為CDR2的序列YTSRLHS，以及作為CDR3的序列QQGNTLPW。
4. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有作為 CDR1的序列SYWMH、作為CDR2的序列DIYPGSDSTNYNEKFKS以及作為CDR3的序列GGWLDAMDY， 并且在輕鏈可變區中具有作為CDR1的序列RASQDISNYLN、作為CDR2的序列YTSRLHS以及作 為 CDR3 的序列 QQGNTLPW。
5. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有作為 CDR1的序列TYWMH、作為CDR2的序列MYPGNSETSYNQKFKG以及作為CDR3的序列GYSDFDY。
6. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區中具有作為 CDR1的序列HASQGIRSNIG、作為CDR2的序列HGTNLED以及作為CDR3的序列VQYVQFP。
7. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有作為 CDR1的序列TYWMH、作為CDR2的序列MYPGNSETSYNQKFKG以及作為CDR3的序列GYSDFDY， 并且在輕鏈可變區具有作為CDR1的序列HASQGIRSNIG、作為CDR2的序列HGTNLED以及作為 CDR3 的序列 VQYVQFP。
8. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有 作為CDR1的序列DYNLH、作為CDR2的序列HYPYNGNTGYNQKFKR以及作為CDR3的序列 GGIYDDYYDYAIDY。
9. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區中具有作為 CDR1的序列RASENIYSHIA、作為CDR2的序列GATNLAH以及作為CDR3的序列QHFWGTP。
10. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有 作為CDR1的序列DYNLH、作為CDR2的序列HYPYNGNTGYNQKFKR以及作為CDR3的序列 GGIYDDYYDYAIDY，并且在輕鏈可變區中具有作為CDR1的序列RASENIYSHIA、作為CDR2的序 列GATNLAH以及作為CDR3的序列QHFWGTP。
11. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有 作為⑶R1的序列SYYLY、作為⑶R2的序列LINPTNSDTIFNEKFKS以及作為⑶R3的序列 EGGYGYGPFAY(8C11 抗體）。
12. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區中具有 作為⑶R1的序列TSSQTLVHSNGNTYLH、作為⑶R2的序列KVSNRFS以及作為⑶R3的序列 HSTHVP。
13. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有 作為⑶R1的序列SYYLY、作為⑶R2的序列LINPTNSDTIFNEKFKS以及作為⑶R3的序列 EGGYGYGPFAY，并且在輕鏈可變區具有作為CDR1的序列TSSQTLVHSNGNTYLH、作為CDR2的序 列KVSNRFS以及作為CDR3的序列HSTHVP。
14. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有 作為CDR1的序列SYGMS、作為CDR2的序列TISSGGSYRYPESVKG以及作為CDR3的序列 LYGGRRGYGLDY。
15. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區中具有 作為CDR1的序列RSSKSLLHSDGITYLY、作為CDR2的序列QMSNLAS以及作為CDR3的序列 AQNLEL。
16. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有 作為CDR1的序列SYGMS、作為CDR2的序列TISSGGSYRYPESVKG以及作為CDR3的序列 LYGGRRGYGLDY，并且在輕鏈可變區具有作為CDR1的序列RSSKSLLHSDGITYLY、作為CDR2的序 列QMSNLAS以及作為CDR3的序列AQNLEL。
17. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有 作為CDR1的序列SHYYWT、作為CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作為CDR3的序列 EGPLYYGNPYffYFDV〇
18. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區中具有作 為CDR1的序列RASQDIDNYLN、作為CDR2的序列YTSRLHS以及作為CDR3的序列QQFNTLP。
19. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有 作為CDR1的序列SHYYWT、作為CDR2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作為CDR3的序列 EGPLYYGNPYWYFDV，并且在輕鏈可變區中具有作為⑶R1的序列RASQDIDNYLN、作為⑶R2的序 列YTSRLHS以及作為CDR3的序列QQFNTLP。
20. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有 作為⑶R1的序列SHYYWS、作為⑶R2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作為⑶R3的序列 EGPLYYGNPYffYFDV〇
21. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在輕鏈可變區中具有作 為CDR1的序列RASQDIDNYLN、作為CDR2的序列YTSRLHS以及作為CDR3的序列QQFNTLP。
22. 權利要求1的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其在重鏈可變區中具有 作為⑶R1的序列SHYYWS、作為⑶R2的序列YISYDGSNNYNPSLKN以及作為⑶R3的序列 EGPLYYGNPYWYFDV，并且在輕鏈可變區具有作為⑶R1的序列RASQDIDNYLN、作為⑶R2的序列 YTSRLHS以及作為CDR3的序列QQFNTLP。
23. -種單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其由在登錄號：NITE BP-121UNITE BP-1212、NITE BP-1213 和 NITE BP-1214 下保藏的雜交瘤 mp5B7、mp7B4、mpl3D4 和 mpl3Hll 之任一個產生。
24. -種雜交瘤，其產生權利要求1或2的單克隆抗體之任一個。
25. 雜交瘤 mp5B7、mp7B4、mpl3D4 或 mpl3Hll，其在登錄號：NITE BP-1211、NITE BP-1212、NITE BP-1213 或 NITE BP-1214 下進行了保藏。
26. -種制備單克隆抗體的方法，包括培養權利要求25的雜交瘤：和從培養物收集單 克隆抗體。
27. -種制備產生結合PLD4的單克隆抗體的細胞的方法，包括下列過程： 1) 給免疫動物施用編碼包含PLD4細胞外結構域的氨基酸序列的重組PLD4-Ig融合蛋 白的過程，和 2) 從免疫動物的抗體產生性細胞選擇產生結合PLD4的抗體的抗體產生性細胞的過 程。
28. 權利要求27的方法，其中表達PLD4的細胞是以可表達的方式保留編碼包含PLD4 細胞外結構域的氨基酸序列的外源性多核苷酸的細胞。
29. 權利要求28的方法，其中所述細胞為動物細胞。
30. 權利要求29的方法，其中所述細胞為人來源的細胞。
31. 權利要求30的方法，其中所述人來源的細胞為HEK-293T細胞。
32. 權利要求27-31的任一項的方法，包括遞增地克隆獲得的抗體產生性細胞的過程。
33. -種制備結合PLD4細胞外結構域的單克隆抗體的方法，包括：培養通過權利要求 29的方法獲得的抗體產生性細胞：和從培養物收集單克隆抗體。
34. -種識別PLD4的單克隆抗體或包含其抗原結合區的片段，其能通過下列過程獲 得： 1) 給免疫動物施用編碼包含PLD4細胞外結構域的氨基酸序列的重組PLD4-Ig融合蛋 白， 2) 從免疫動物的抗體產生性細胞選擇產生結合PLD4的抗體的抗體產生性細胞，和 3) 培養過程2)中選擇的抗體產生性細胞，和從培養物收集識別PLD4的抗體。
35. -種用于制備結合PLD4的抗體的免疫原，其包含（a)以可表達的方式外源性地保 留編碼包含PLD4細胞外結構域的氨基酸序列的多核苷酸的動物細胞，或其細胞膜級分。
36. 權利要求35的免疫原，其中所述動物細胞為人來源的細胞。
37. -種檢測漿細胞樣樹突細胞的方法，其包括：將結合PLD4細胞外結構域的單克隆 抗體或包含其抗原結合區的片段與測試細胞接觸：和檢測結合細胞的單克隆抗體或包含 其抗原結合區的片段。
38. -種用于檢測漿細胞樣樹突細胞的試劑，其包含：結合PLD4細胞外結構域的單克 隆抗體；或包含其抗原結合區的片段。
39. -種抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的方法，包括：將下述組分的任一種與所述漿 細胞樣樹突細胞接觸： (a) 結合PLD4并抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的單克隆抗體，或包含其抗原結合區的 片段，和 (b) 免疫球蛋白或包含其抗原結合區的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了單克隆抗 體（a)的互補決定區。
40. -種抑制活生物體中的漿細胞樣樹突細胞的活性的方法，包括：給活生物體施用 下述組分的任一種： (a) 結合PLD4并抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的單克隆抗體，或包含其抗原結合區的 片段，和 (b) 免疫球蛋白或包含其抗原結合區的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了單克隆抗 體（a)的互補決定區。
41. 權利要求39或40的方法，其中漿細胞樣樹突細胞的活性是干擾素生成活性和干擾 素生成性細胞的存活之一，或兩者。
42. -種用于抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的試劑，其包含：下述組分之任一種作為 活性組分： (a)結合PLD4并抑制漿細胞樣樹突細胞的活性的單克隆抗體，或包含其抗原結合區的 片段，和 (b)免疫球蛋白或包含其抗原結合區的片段，其中所述免疫球蛋白中移植了單克隆抗 體（a)的互補決定區。
43.權利要求42的用于抑制干擾素生成性細胞的活性的試劑，其中漿細胞樣樹突細胞 的活性是干擾素生成活性和干擾素生成性細胞的存活之一，或兩者。
【文檔編號】C07K16/40GK104284903SQ201380018285
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年1月31日 優先權日:2012年1月31日
【發明者】趙民權, 山崎智英, 遠藤真由木, 石田晃司 申請人:Sbi生物技術有限公司