一種氣相擴散型結晶芯片及使用方法
【專利摘要】本發明涉及一種氣相擴散型結晶芯片及使用方法，其特征在于：①所述結晶芯片是由一個表面加工有微管道結構且具有疏水特性的基片和一個表面平整且具有親水特性的基片鍵合構成；②表面加工有微管道結構的基片為圓盤狀微流控芯片，包含多組輻射狀對稱排列的微結構單元，每個單元的結構至少包含一個結晶微反應腔、一個微隔離腔和一段結晶劑儲液微管道，其中微隔離腔兩側通過連接微管道分別與微反應腔和結晶劑儲液微管道相連，使得結晶微反應腔中的結晶液和結晶劑儲液微管道中的結晶劑處于一個共通的空間，彼此之間發生氣相物質交換。所述的氣相擴散型結晶芯片，克服了現有結晶微流控芯片無法實現氣相擴散型結晶操作的不足，大大降低珍貴樣品和試劑的消耗。
【專利說明】一種氣相擴散型結晶芯片及使用方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種氣相擴散型結晶芯片及使用方法，可應用于生物大分子的結晶條件高通量篩選和優化等領域。

【背景技術】
[0002]生物大分子結構與功能的研宄是生命科學的基本問題之一，對分子生物學、蛋白質工程以及新藥研制等都具有重要意義。基于X射線衍射的晶體學技術是研宄生物大分子三維結構的主要手段，根據國際蛋白質結構數據庫(roB，WWW.pdb.0rg)中的數據可知，X射線衍射技術解析了 88%以上的蛋白質結構。X射線衍射技術應用于生物大分子結構解析的前提是要獲得合適的單晶，然而從純度很高的蛋白質到生長出具備衍射質量蛋白質晶體的成功率不足13%，因此目前生物大分子結構研宄的最大瓶頸就在于生物大分子的結晶。生物大分子的結晶過程是一個非常復雜的過程，目前主要通過經驗性地大量試驗去篩選和優化結晶條件。對于一個生物大分子來說，要篩選出其合適的結晶條件，往往要經過數百次甚至上千次組合試驗。如果采用傳統的手工微孔板技術進行結晶條件的篩選和優化，這往往是一個非常艱巨的任務，需要耗費大量的人力、時間和珍貴的樣品，效率低下，嚴重限制了生物大分子結構與功能方面的研宄。雖然目前自動化微量移液裝置的出現大大降低了生物大分子結晶操作的勞動強度，并提高了結晶實驗通量，但是該類裝置價格昂貴、靈活性較差，且整個結晶過程仍為自發、被動形式，成功率較低，對生物大分子結構與功能方面研宄的貢獻比重較小。近年來，快速發展的微流控技術為生物大分子結晶條件的高通量、快速篩選提供了一個新的平臺，最典型的兩個技術:一個是加州理工大學Quake等人利用微腔體結合PDMS(polydimethysilane，PDMS)閥構建的微陣列液_液擴散型蛋白質結晶芯片[Hansen CL, Skordalakes E, Berger JM, Quake SR:A robust andscalable microfluidic metering method that allows protein crystal growth byfree interface diffus1n.Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99:16531-16536.],另一個是芝加哥大學的Ismagilov等人利用液滴型微流控芯片發展起來的微批量型蛋白質結晶芯片[Zheng B, Roach LS, Ismagilov RF:Screening of Protein Crystallizat1nCondit1ns on a Microfluidic Chip Using Nanoliter-Size Droplets.J.AM.CHEM.S0C.2003, 125:11170-11171.]o相比于傳統的蛋白質結晶條件篩選技術，微流控技術具有許多明顯的優勢:(I)降低樣品和試劑消耗量；(2)增加篩選條件的總數；(3)加快試驗速度。雖然微流控技術在蛋白質結晶條件篩選方面受到廣泛關注和研宄，但是目前該技術在蛋白質結晶方面并未得到充分應用和挖掘。傳統的蛋白質結晶方法主要有氣相擴散結晶法、批量結晶法、液-液擴散結晶法和透析結晶法。雖然Quake研宄小組和Ismagilov研宄小組分別成功地實現了可進行液-液擴散結晶和批量結晶的微流控芯片，但是目前結構生物學實驗室中應用最廣泛的氣相擴散結晶方法還未在微流控平臺上真正實現，由于每種結晶方法可篩選的結晶條件和范圍都有差異，且常規結構生物學實驗人員更熟悉和偏愛氣相擴散結晶方法，因此導致現有的微流控結晶芯片并未得到廣泛接納和應用。而且，現有的微流控結晶芯片與傳統的微孔板結晶裝置一樣，仍然是只適用于自發、被動式的結晶，結晶過程中無法實現對結晶體系主動的調控和原位優化。為了實現微流控技術在結構生物學領域的廣泛應用，充分發揮微流控技術低耗樣、高通量、快速的優勢，進一步提高生物大分子結晶效率，促進結構生物學的快速發展，迫切需要發展新型、可實現氣相擴散結晶模式以及具備主動調控功能的微流控結晶芯片。


【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一種氣相擴散型結晶芯片及使用方法，應用于生物大分子高通量結晶條件篩選和優化。
[0004]本發明提供的一種氣相擴散型結晶芯片，其特征在于:
[0005]①所述結晶芯片是由一個表面加工有微管道結構且具有疏水特性的基片和一個表面平整且具有親水特性的基片鍵合構成，使得該芯片利用毛細作用力實現微量液相樣品在微管道中的自動化進樣；表面加工有微管道結構的基片為圓盤狀微流控芯片，包含多組輻射狀對稱排列的微結構單元，每個單元的結構至少包含一個結晶微反應腔、一個微隔離腔和一段結晶劑儲液微管道，其中微隔離腔兩側通過連接微管道分別與微反應腔和結晶劑儲液微管道相連，使得結晶微反應腔中的結晶液和結晶劑儲液微管道中的結晶劑處于一個共通的空間，彼此之間可以發生氣相物質交換，從而可以實現基于氣相擴散模式的結晶篩選和優化實驗。
[0006]②所述圓盤狀微流控芯片呈輻射狀排列的每個結構單元除了包含一段樣品定容管道外至少還包含一個結晶劑進樣口、一段結晶劑進樣微管道、一段樣品定容微管道、一個通氣管道、一個結晶微反應腔、一個微隔離腔以及一個短結晶劑儲液微管道，其中樣品定容微管道和結晶劑定容管道的一端均與微反應腔相連。
[0007]③所述圓盤狀微流控芯片中每個單元的定容微管道和微反應腔連接處的定容微管道端的截面小于微反應腔端的截面，從而使得兩者相連處因管道截面突變形成毛細微閥結構，實現流體控制。
[0008]④所述圓盤狀微流控芯片利用毛細疏水閥和離心力的協同作用實現微量樣品和結晶劑的并行定量分配和混合。
[0009]⑤所述的微隔離腔兩側通過一組連接管道分別與結晶微反應腔和結晶劑儲液管道相連，且連接微管道與微隔離腔連接處的界面大大小于定容微管道與結晶反應腔連接處的截面，使得連接微管道與微隔離腔的連接處形成具有更大阻力的毛細微閥，阻止樣品和結晶劑離心分配過程中從結晶微反應腔進入微隔離腔中。
[0010]⑥所述圓盤狀微流控芯片中每個單元的結晶劑儲液微管道中包含的結晶劑濃度和成分通過更換相應結晶劑進樣口的溶液進行調節，從而利用結晶微反應腔中結晶液和結晶劑儲液微管道中結晶劑之間化學勢差的變化，主動調控結晶微反應腔中結晶液的過飽和度和過飽和速率。
[0011 ] ⑦圓盤狀微流控芯片中還包含油相進樣口、油相進樣微管道和油相廢液口，用以完成液樣分配后在管道中充入石蠟油，隔離各結晶微反應腔。
[0012]本發明所述的氣相擴散型結晶芯片的使用方法如下:首先，將待結晶的樣品和結晶劑分別滴加在結晶芯片對應的進樣口，使其在毛細作用的驅動下自動充滿相應的進樣微管道和定容微管道，并因毛細疏水閥的阻力作用而自動停在定容微管道與微反應腔相接處；然后，利用膠帶密封芯片所有進樣口，并將芯片置于離心裝置上，通過離心力作用使得各定容微管道中的樣品和試劑克服毛細疏水閥的阻力進入對應的結晶微反應腔中混合，從而實現的結晶樣品和結晶試劑的高通量并行定量分配和混合；完成結晶樣品和結晶劑分配后，剝離結晶樣品進樣口膠帶，并滴加石蠟油，石蠟油將在毛細力作用下充滿樣品進樣微管道和定容微管道，隔離各個結晶微反應腔；最后，將一層低通透性薄膜貼附于芯片上表面，抑制結晶過程中樣品的水分和溶劑的揮發；最后將芯片置于設定的常溫環境下，進行結晶實驗。
[0013]本發明所述的氣相擴散型結晶芯片也可應用于結晶液飽和速率的梯度調控，其特征在于:完成結晶芯片的樣品和結晶劑進樣和分配后，剝離密封各結晶試劑進樣口的膠帶，并吸干各進樣口的結晶試劑；然后，根據梯度設定在各進樣口中滴加不同濃度和配比的結晶試劑，使芯片上各結晶微反應腔中的結晶液與相應結晶劑儲液微管道中的結晶試劑之間化學勢差呈梯度分布，從而使得各結晶微反應腔中結晶液擴散失溶劑和趨向飽和的速率也呈梯度分布。由于結晶的成功與否以及結晶形成的晶體質量與結晶液的過飽和度和過飽和速率有很大關系，因此梯度式、系統地調節結晶體系的過飽和度和過飽和速率可以快速篩選較為優化的結晶條件。
[0014]另外，本發明所述的氣相擴散型結晶芯片還可應用于原位優化結晶結果，其特征在于:若觀測到結晶芯片的結晶微反應腔中出現沉淀或眾多小晶體或微晶，可剝離相應結晶試劑進樣口的密封膠帶，并吸干該進樣口的結晶劑，加入水溶液，再以膠帶重新密封結晶劑進樣口。由于水溶液化學勢高于結晶液的化學勢，水分子將從結晶劑儲液微管道擴散至結晶微反應腔的結晶液中，從而降低結晶液的飽和度，使得其中的沉淀、小晶體或微晶重新溶解。待絕大多數沉淀、小晶體或微晶溶解后，再次剝離相應結晶試劑進樣口的密封膠帶，并吸干該進樣口的水溶液，加入濃度低于初始篩選濃度的結晶劑，以膠帶重新密封結晶劑進樣口后靜置結晶。相對于初篩的結晶過程，結晶劑進樣口中加入低濃度結晶劑的情況，可以使得結晶過程在相對緩慢的過飽和速率和較低的過飽和度結晶體系中進行。若一次調整未能獲得理想的晶體，可多次重復上述步驟，逐步調整結晶劑濃度，直至結晶微反應腔中形成體積較大的、適于X射線衍射分析的單晶。
[0015]總之，本發明提供的氣相擴散型結晶芯片，克服了現有結晶微流控芯片無法實現氣相擴散型結晶操作的不足，與傳統的基于微孔板的懸滴式或座滴式氣相擴散型結晶裝置相比，可大大降低珍貴樣品和試劑的消耗，且該芯片采用毛細微閥和離心力的協同作用的流體驅動和控制方式，可簡便快速地實現微量樣品和結晶劑的并行定量分配和混合，大大降低了實驗人員的操作強度，具有明顯的操作和成本優勢。另外，相對于傳統的結晶方法和現有微流控結晶技術，本發明提供的氣象擴散型結晶芯片具有更高的靈活度，不僅可高通量篩選生物大分子結晶條件，而且還可梯度調控結晶液的過飽和速率以及原位優化初篩的結晶條件，一方面可大大拓展結晶條件篩選范圍，另一方面也可提高結晶實驗效率、降低結晶實驗成本。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為本發明氣相擴散型結晶芯片組合結構示意圖。
[0017]圖2-⑴為本發明氣相擴散型結晶芯片平面結構示意圖；圖2-⑵為圖2-⑴中微結構單元結構放大示意圖。
[0018]圖3為本發明氣相擴散型結晶芯片中結晶微反應腔局部放大示意圖。
[0019]圖4-⑴為本發明氣相擴散型結晶芯片實施毛細自動充樣后平面示意圖；圖
4-(2)為圖4-(1)虛線部分的放大示意圖。
[0020]圖5為本發明氣相擴散型結晶芯定量分配平面示意圖。
[0021]圖6-⑴為本發明氣相擴散型結晶芯片實施離心分配后平面示意圖；圖6-⑵為圖6-(1)中虛線的放大示意圖。

【具體實施方式】
[0022]下面結合實施例進一步說明本發明的實質性特點和顯著的進步。
[0023]實施例1
[0024]如圖1所示，本發明氣相擴散型結晶芯片為一種復合式圓盤形微流體芯片，該芯片由一表面加工有微管道且具有疏水特性的基片(I)和另一表面具有親水特性的平整基片⑵鍵合構成(如圖1所示)；其中，基片⑴為圓盤狀微流控芯片，它包含多組輻射狀對稱排列的微結構單元，所有的微結構單元均通過樣品進樣微結構(包括樣品進樣口(3)、樣品進樣微管道(4)和樣品定容微管道(5))串連起來(如圖2-(1)所示)，其中每個結構單元除了包含一段樣品定容微管道(5)外，還包含一個結晶劑進樣口(6)、一段結晶劑進樣微管道(7)、一段結晶劑定容微管道(8)、一個通氣管道(9)、一個結晶微反應腔(10)、一個微隔離腔(11)和一段結晶劑儲液微管道(12)(如圖2-(2)所示)，其中樣品定容微管道(5)和結晶劑定容微管道(8)的一端均與結晶微反應腔(10)相連，且連接處定容微管道的截面小于結晶微反應腔的截面，使得此處因管道截面的突變形成毛細微閥結構，實現流體控制；另外，微隔離腔(11)兩側通過一組連接微管道(13)分別與結晶微反應腔(10)和結晶劑儲液微管道(12)相連，且連接微管道與微隔離腔連接處的截面大大小于定容微管道與結晶微反應腔(10)連接處的截面(如圖3所示)，使得此處形成阻截能力更強的毛細微閥，阻止離心分配過程中微反應腔的液體因離心力作用進入微隔離腔，而導致結晶液與結晶劑儲液直接接觸。為了隔離各結晶微反應腔，保證結晶過程中各結晶微反應腔中氣相擴散過程的獨立性，圓盤狀微流控芯片中還包含油相進樣口(14)、油相進樣微管道(15)和油相廢液口
(16)，用以在完成液樣分配后在管道中充入石蠟油，隔離各結晶微反應腔。
[0025]氣相擴散型結晶芯片工作時，首先通過移液器在樣品進樣口(3)和結晶劑進樣口
(6)中分別加入待結晶的樣品和結晶劑，液樣在毛細力的作用下自動填充進樣管道，并因毛細微閥作用，停止于結晶微反應腔(10)前(如圖4-1和4-2所示)。然后利用膠帶密封結晶芯片所有結晶劑進樣口，并將芯片放置并固定于離心機上，通過旋轉芯片，利用離心力使待結晶的樣品溶液和結晶劑克服毛細微閥的阻力作用進入結晶微反應腔(10)中混合，由于微管道中液體所受離心的方向是從圓心輻射向外的，所以每個單元的微管道中僅有樣品定容微管道(5)和結晶劑定容微管道(8)中的液體被離心至結晶微反應腔(10)中從而實現定量分配混合，形成結晶液(如圖5陰影部分所示)；另外，由于結晶劑進樣口被密封，離心過程中結晶劑進樣口中的結晶劑不會被“甩”出芯片，因此，在離心結束后，毛細作用將驅使結晶劑重新充滿結晶劑定容微管道和結晶劑儲液微管道完成樣品和結晶劑分配后，在油相進樣口(14)加入石蠟油，在毛細作用下，石蠟油自動充滿油相進樣微管道(15)和樣品定容微管道(5)，然后再次離心，使得石蠟油進入結晶微反應腔，封閉結晶液內側(即靠近圓心的一側)，實現對各結晶微反應腔的隔離(如圖6-⑴和6-⑵所示)。最后，用一層低通透性的聚偏二氯乙烯(PVDC)膜貼附在結晶芯片上表面，以防止芯片中溶劑的揮發，并將結晶芯片放置于4°C或25°C條件下進行結晶，間隔一定時間后對結晶芯片中各結晶微反應腔中結晶結果進行觀察，以此確定合適的結晶條件。
[0026]實施例2
[0027]將實施例1制備的氣相擴散型結晶芯片應用于梯度調控蛋白質結晶液飽和度，篩選優化的結晶條件，其方式為:首先如實施例1所述，在結晶芯片中完成蛋白質樣品和結晶劑的進樣和分配，并剝離密封各結晶試劑進樣口的膠帶，以吸水紙吸干各進樣口的結晶劑；然后，根據梯度設計范圍，在各進樣口中滴加不同濃度和配比的結晶試劑，使得芯片上各結晶微反應腔中的結晶液與相應結晶劑儲液微管道中的結晶試劑之間的化學勢差呈梯度分布，從而使得各結晶微反應腔中蛋白質結晶液的溶劑擴散損失速率和趨向飽和的速率也呈梯度分布，由于蛋白質結晶液的過飽和度和過飽和速率對其形成晶體的大小和質量有直接影響，因此通過梯度式、系統地調控蛋白質結晶液的飽和速率，可以快速、高效地篩選出較優化的蛋白質結晶條件。
[0028]實施例3
[0029]將實施例1制備的氣相擴散型結晶芯片應用于結晶初篩結果的原位優化，其方式為:首先如實施例1所述，將蛋白質樣品溶液與多組結晶試劑定量分配混合，進行結晶條件的篩選；若觀測到結晶芯片的某些結晶微反應腔中出現沉淀或者大量的小晶體或微晶，可剝離相應結晶試劑進樣口的密封膠帶，并吸干該進樣口的結晶劑，在其中加入水溶液，再以膠帶重新密封結晶劑進樣口。由于水溶液的化學勢高于結晶微反應腔中結晶液的化學勢，因此，水分子將從結晶劑儲液微管道經微隔離腔擴散至結晶微反應腔中，降低結晶液的飽和度，使得結晶微反應腔中的沉淀、小晶體或微晶重新溶解；觀察到結晶微反應腔中絕大多數沉淀、小晶體或微晶溶解后，再次剝離相應結晶試劑進樣口的密封膠帶，并吸干該進樣口的水溶液，再加入濃度比初始篩選濃度低的結晶劑，以膠帶密封結晶劑進樣口后重新靜置結晶。由于在低飽和度的結晶液中，晶體生長速率與晶核生成速率的比值較大，結晶所形成的晶體也較大，晶形較完整，因此通過適當降低結晶劑的濃度，可以調控結晶液的趨向飽和的速率和結晶過程，優化結晶結果。若一次調控在結晶芯片中未獲得適于衍射分析的單晶，可多次重復上述步驟，逐步調整結晶劑濃度，直至結晶微反應腔中形成體積較大的、適于X射線衍射分析的單晶。
【權利要求】
1.一種氣相擴散型結晶芯片，其特征在于: ①所述結晶芯片是由一個表面加工有微管道結構且具有疏水特性的基片和一個表面平整且具有親水特性的基片鍵合構成，使得該芯片利用毛細作用力實現微量液相樣品在微管道中的自動化進樣； ②表面加工有微管道結構的基片為圓盤狀微流控芯片，包含多組輻射狀對稱排列的微結構單元，每個單元的結構至少包含一個結晶微反應腔、一個微隔離腔和一段結晶劑儲液微管道，其中微隔離腔兩側通過連接微管道分別與微反應腔和結晶劑儲液微管道相連，使得結晶微反應腔中的結晶液和結晶劑儲液微管道中的結晶劑處于一個共通的空間，彼此之間可以發生氣相物質交換，從而可以實現基于氣相擴散模式的結晶篩選和優化實驗。
2.根據權利要求1所述的結晶芯片，其特征在于所述圓盤狀微流控芯片呈輻射狀排列的每個結構單元除了包含一段樣品定容管道外至少還包含一個結晶劑進樣口、一段結晶劑進樣微管道、一段樣品定容微管道、一個通氣管道、一個結晶微反應腔、一個微隔離腔以及一個短結晶劑儲液微管道，其中樣品定容微管道和結晶劑定容管道的一端均與微反應腔相連。
3.根據權利要求1所述的結晶芯片，其特征在于所述圓盤狀微流控芯片中每個單元的定容微管道和微反應腔連接處的定容微管道端的截面小于微反應腔端的截面，從而使得兩者相連處因管道截面突變形成毛細微閥結構，實現流體控制。
4.根據權利要求1所述的結晶芯片，其特征在于所述圓盤狀微流控芯片利用毛細疏水閥和離心力的協同作用實現微量樣品和結晶劑的并行定量分配和混合。
5.根據權利要求1或2所述的結晶芯片，其特征在于所述的微隔離腔兩側通過一組連接管道分別與結晶微反應腔和結晶劑儲液管道相連，且連接微管道與微隔離腔連接處的界面小于定容微管道與結晶反應腔連接處的截面，使得連接微管道與微隔離腔的連接處形成具有更大阻力的毛細微閥，阻止樣品和結晶劑離心分配過程中從結晶微反應腔進入微隔離腔中。
6.根據權利要求1所述的結晶芯片，其特征在于所述圓盤狀微流控芯片中每個單元的結晶劑儲液微管道中包含的結晶劑濃度和成分通過更換相應結晶劑進樣口的溶液進行調節，從而利用結晶微反應腔中結晶液和結晶劑儲液微管道中結晶劑之間化學勢差的變化，主動調控結晶微反應腔中結晶液的過飽和度和過飽和速率。
7.根據權利要求1所述的結晶芯片，其特征在于圓盤狀微流控芯片中還包含油相進樣口、油相進樣微管道和油相廢液口，用以完成液樣分配后在管道中充入石蠟油，隔離各結晶微反應腔。
8.使用按權利要求1所述的氣相擴散型結晶芯片的方法，其特征在于包含以下步驟: 1)將待結晶的樣品和結晶劑分別滴加在對應的進樣口，使其在毛細作用的驅動下自動充滿進樣微管道和定容微管道，并因毛細疏水閥的阻力作用而自動停在定容微管道與微反應腔相接處； 2)利用膠帶密封芯片所有結晶劑進樣口，并將芯片置于離心裝置上，通過旋轉芯片，利用離心力使定容微管道中的樣品和試劑克服毛細疏水閥的阻力進入微反應腔混合，從而實現定量分配和混合； 3)完成樣品分配后，在芯片微管道中充入石蠟油，隔離各個結晶微反應腔，然后在芯片上表面貼附一層低通透性薄膜，抑制結晶過程中樣品的水分和溶劑的揮發； 4)最后將芯片置于設定的常溫環境下，進行結晶實驗。
9.所述的氣相擴散型結晶芯片用于結晶液飽和度的梯度調控，其特征在于:結晶芯片完成樣品和試劑進樣和分配后，剝離密封各結晶試劑進樣口的膠帶，并吸干各進樣口的結晶劑；然后，根據梯度設計，在各進樣口中滴加不同濃度和配比的結晶試劑，使得芯片上各結晶微反應腔中的結晶液與相應結晶劑儲液微管道中的結晶試劑之間的化學勢差呈梯度分布，從而使得各結晶微反應腔中結晶液的溶劑擴散損失速率和趨向飽和的速率也呈梯度分布，即可實現對芯片上各結晶反應腔中結晶液飽和度的梯度調控。
10.所述的氣相擴散型結晶芯片用于原位優化的結晶初篩，其特征在于:對于結晶芯片的結晶微反應腔中出現沉淀或眾多小晶體或微晶的情況，可剝離相應結晶試劑進樣口的密封膠帶，并吸干該進樣口的結晶劑，加入水溶液，再以膠帶重新密封結晶劑進樣口，使得結晶微反應腔中的沉淀、小晶體或微晶重新溶解；待絕大多數沉淀、小晶體或微晶溶解后，再次剝離相應結晶試劑進樣口的密封膠帶，并吸干該進樣口的水溶液，加入濃度低于初始篩選濃度的結晶劑，以膠帶重新密封結晶劑進樣口后靜置結晶；可多次重復上述步驟，逐步調整結晶劑濃度，直至結晶微反應腔中形成體積較大的、適于X射線衍射分析的單晶。
【文檔編號】C07K1/14GK104497099SQ201410723333
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月2日 優先權日:2014年12月2日
【發明者】李剛, 王麗, 高坤鵬, 趙建龍 申請人:中國科學院上海微系統與信息技術研究所