專利名稱：快速制備干燥劑陣列用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速制備干燥劑陣列的方法，該方法可以提高干燥劑制備效率，用于提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率，屬于蛋白質(zhì)結(jié)晶領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
根據(jù)結(jié)構(gòu)基因組計(jì)劃的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，從純度很高的蛋白質(zhì)到生長(zhǎng)出衍射質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體，其成功率不足20%。獲得蛋白質(zhì)晶體的過程是從表達(dá)開始到獲得結(jié)構(gòu)的一系列流程中，成功率最低的環(huán)節(jié)之一。因此，生長(zhǎng)高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體仍是結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域的瓶頸問題
之一 O蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率低的一個(gè)重要原因是篩選不到合適的結(jié)晶劑來(lái)生長(zhǎng)蛋白質(zhì)晶體。最常用的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選方法是氣相擴(kuò)散法。氣相擴(kuò)散法的原理是在一個(gè)封閉體系內(nèi)，由于不含蛋白質(zhì)的池液中結(jié)晶劑的濃度高于蛋白質(zhì)結(jié)晶液滴中結(jié)晶劑的濃度，導(dǎo)致溶劑不斷從低濃度的結(jié)晶液滴向高濃度的池液擴(kuò)散，從而使結(jié)晶液滴中蛋白質(zhì)溶液和結(jié)晶劑溶液的濃度不斷增加，在此過程中蛋白質(zhì)液滴逐漸達(dá)到過飽和，從而形成晶體。在傳統(tǒng)的氣相擴(kuò)散法中，結(jié)晶液滴濃度不斷濃縮直至與池液平衡，如果池液的濃度不足以使結(jié)晶液滴濃縮至蛋白質(zhì)形核的過飽 和度，則即使所使用的篩選試劑能在更高濃度下獲得晶體，但在實(shí)際篩選時(shí)卻得不到晶體。鹿芹芹等人在氣相擴(kuò)散法中利用硅膠干燥劑替代池液，干燥劑起到高度濃縮液滴的作用，使液滴的濃度范圍大幅擴(kuò)展，利用干燥劑法進(jìn)行蛋白質(zhì)分子結(jié)晶條件的篩選，提高了蛋白質(zhì)分子結(jié)晶篩選成功率(Replace reservoir solution with desiccant in vapordiffusion protein crystallization screening, Journal of Applied Crystallograph
I,2010，Vol.43:1021-1026)，后來(lái)又發(fā)展了逐級(jí)干燥法:分批加入硅膠干燥劑，逐級(jí)濃縮結(jié)晶液滴，使液滴的濃度范圍大幅擴(kuò)展直至液滴蒸干，以此掃描更寬范圍的溶液濃度，該方法進(jìn)一步提高了蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的成功率(A gradual desiccation method for improvingthe efficiency of protein crystallization screening, Journal of Applied Crystallography, 2012，Vol.45:758-765)。但是在推廣應(yīng)用逐級(jí)干燥方法時(shí)，存在一個(gè)障礙，即為每個(gè)結(jié)晶液滴制備合適量的干燥劑。以96條件結(jié)晶篩選試劑盒為例，在對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)晶篩選時(shí)，每次干燥，都需要控制96個(gè)結(jié)晶液滴使用的干燥劑的量。一次結(jié)晶干燥過程，需要稱重至少96次，尋找質(zhì)量相同的硅膠干燥劑，因此實(shí)施多次干燥時(shí)，至少要對(duì)干燥劑稱重96Xn次(η是干燥次數(shù))。此外，每個(gè)結(jié)晶液滴要用的干燥劑需要人工分配到結(jié)晶板的深孔中，這意味著需要另外96Χη次人工操作。所有的反復(fù)的人工操作是費(fèi)時(shí)費(fèi)力的。而且，如果硅膠干燥劑顆粒過大，通過壓碎、稱重，很難精確控制質(zhì)量，同時(shí)，每個(gè)結(jié)晶液滴所用的硅膠顆粒的尺寸經(jīng)常有差異，吸收溶劑的動(dòng)力學(xué)過程不一樣，這會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的重復(fù)性問題
發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)制備所需質(zhì)量的硅膠干燥劑費(fèi)時(shí)費(fèi)力，無(wú)法實(shí)現(xiàn)推廣應(yīng)用的不足，本發(fā)明提供一種快速制備干燥劑陣列的方法，該方法可以縮短制備干燥劑的時(shí)間，實(shí)現(xiàn)半自動(dòng)化，節(jié)省勞力，提高生產(chǎn)效率。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案包括以下步驟:I)配制化合物溶液，在光面紙上將該溶液按照與蛋白質(zhì)結(jié)晶板結(jié)晶池匹配的位置移液，制備成液滴陣列，烘干后獲得化合物干燥劑陣列，再用透明膠帶緊密粘貼在有干燥劑陣列的光面紙上，撕開透明膠帶獲得固態(tài)干燥劑陣列；或者，配制化合物溶液，將該溶液按照與蛋白質(zhì)結(jié)晶板結(jié)晶池匹配的位置直接移液到透明膠帶的覆膠面上，制備出化合物液滴陣列，將該液滴陣列烘干得到固態(tài)干燥劑陣列；2)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求配制單個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液；3)將蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液滴到結(jié)晶板的孔中，用粘有固態(tài)化合物干燥劑陣列的透明膠帶密封結(jié)晶板，使每粒干燥劑對(duì)應(yīng)一滴蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液，且相互不接觸，將結(jié)晶板控溫在0-55°C條件下進(jìn)行結(jié)晶，干燥劑陣列開始吸取結(jié)晶溶液中的溶劑，48-96小時(shí)后取出，觀察結(jié)晶結(jié)果；4)將結(jié)晶板上膠帶撕下，每次替換一片粘有固態(tài)化合物干燥劑陣列的透明膠帶，在密閉條件下重復(fù)進(jìn)行結(jié)晶處理，直到蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液全部干燥為止。本發(fā)明的有益效果是:利用化合物溶液替換硅膠干燥劑，在起到提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的同時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)快速制備干燥劑陣列，提高生產(chǎn)效率；同時(shí)，由于化合物的高一致性的吸濕率，結(jié)晶的可重復(fù)性同時(shí)得到提高。該方法能夠批量化生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)推廣應(yīng)用。


圖1是方法流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明包括以下步驟:I)在單面覆膠的透明密封膠帶覆膠面制備干燥劑陣列:配制化合物溶液，利用一些手段，實(shí)現(xiàn)固態(tài)化合物干燥劑顆粒陣列粘在單面透明密封膠帶覆膠面。所指手段包括兩種:a.在光面紙上將溶液按照與蛋白質(zhì)結(jié)晶板結(jié)晶池匹配的位置移液，制備成液滴陣列，烘干后獲得化合物干燥劑陣列，再用透明膠帶緊密粘貼在有干燥劑陣列的光面紙上，撕開透明膠帶，即在透明膠帶覆膠面獲得固態(tài)干燥劑陣列。b.用雙面膠將單面覆膠的透明密封膠帶的無(wú)膠面粘貼在平臺(tái)上，覆膠面朝上。選擇化合物溶液的體積、距離和陣列數(shù)量，用自動(dòng)移液系統(tǒng)或電動(dòng)移液器或手動(dòng)移液器將化合物溶液噴射到平臺(tái)上面的膠帶覆膠面上，形成化合物液滴陣列。將粘有液滴陣列的膠布從平臺(tái)上取下，放入烘干爐內(nèi)烘干，即可實(shí)現(xiàn)固態(tài)化合物干燥劑顆粒陣列粘在膠帶覆膠面。2)配制蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液，根據(jù)需求，配制單個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液。3)蛋白質(zhì) 結(jié)晶:將蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液滴到結(jié)晶板的相應(yīng)孔中，用粘有固態(tài)化合物干燥劑陣列的密封膠帶密封結(jié)晶板，使每粒干燥劑對(duì)應(yīng)一滴蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液，且相互不接觸，將結(jié)晶板控溫在0-55°C條件下，進(jìn)行結(jié)晶，干燥劑陣列開始吸取結(jié)晶溶液中的溶劑，48-96小時(shí)后取出，觀察結(jié)晶結(jié)果。每次替換一片干燥劑陣列，在密閉條件下重復(fù)進(jìn)行結(jié)晶處理，直到蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液全部干燥為止。其中，步驟I)中所述化合物為易溶于水的化合物或混合后溶于水不產(chǎn)生沉淀的多種易溶化合物的混合物；所述的化合物選自氯化鈷、氯化鋁、硫酸銅、氯化鈣、氯化鎂、氯化鋇、硫酸鎂、硫酸鈉中的一種或多種，將化合物溶于水中，配成化合物溶液，多種化合物溶液可以任意組合混合，前提是混合后不產(chǎn)生沉淀。其中，步驟2)中所述的蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液是指由擬研究的蛋白質(zhì)和結(jié)晶劑(可促使蛋白質(zhì)結(jié)晶的各種化學(xué)試劑，如各種鹽，有機(jī)分子及其混合物等)在緩沖液(維持溶液PH值的溶液)中混合的液體。實(shí)施例1:溶菌酶結(jié)晶條件的篩選。1、制備干燥 劑陣列用濃度為100mg/ml氯化鈷溶液替換噴墨打印機(jī)中的墨水，在計(jì)算機(jī)上設(shè)置打印顆粒的形狀為圓形，直徑為0.5mm,形成顆粒間距為9mm的12 X 8陣列，用打印機(jī)將氯化鈷溶液打印到光面紙的光面上，形成固態(tài)氯化鈷顆粒陣列。然后用單面覆膠的透明密封膠帶粘到光面紙光面上，將膠帶從光面紙上撕下，固態(tài)干燥劑顆粒陣列便粘附在膠帶覆膠面。2、制備溶菌酶結(jié)晶溶液將六次重結(jié)晶的溶菌酶(日本Seikagaku公司，貨號(hào)為100940)溶于pH為7.00，
0.025mol/L HEPES-Na緩沖液中，制得濃度為10mg/ml的溶菌酶溶液。用自動(dòng)移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號(hào)為HR2-144的IndeX 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔中，其中，添加到坐滴孔內(nèi)的結(jié)晶試劑的體積為I μ I/孔；接著將溶菌酶溶液轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的每個(gè)坐滴孔中，其中，每個(gè)坐滴孔內(nèi)溶菌酶溶液的體積為I μ 1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑混合后，每個(gè)坐滴孔中溶菌酶結(jié)晶溶液的體積是2 μ I。3、結(jié)晶處理用粘有干燥劑陣列的膠帶密封96孔坐滴板，每顆干燥劑對(duì)應(yīng)一滴結(jié)晶溶液，將坐滴板放入控溫箱，20° C恒溫靜置，溶菌酶進(jìn)行第一次結(jié)晶處理，48小時(shí)后，取出坐滴板，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)出獲得溶菌酶晶體的數(shù)目。用新的粘有干燥劑陣列的膠帶替換舊的膠帶，再次將坐滴板放入恒溫箱中，靜置48小時(shí)觀察結(jié)果；重復(fù)上述過程，直至全部溶菌酶結(jié)晶溶液蒸干，統(tǒng)計(jì)出最終獲得溶菌酶晶體的數(shù)目，計(jì)算溶菌酶最終的結(jié)晶成功率。結(jié)果如下:逐級(jí)干燥促使蛋白質(zhì)結(jié)晶，溶菌酶結(jié)晶的成功率與已有文獻(xiàn)報(bào)道(A gradual desiccation method for improving the efficiency of proteincrystallization screening, Journal of Applied Crystallography, 2012, Vol.45:758-765)的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法結(jié)果相比，成功率提高了 30%。實(shí)施例2:甜味蛋白結(jié)晶條件的篩選。1、制備干燥劑陣列用電動(dòng)移液器將濃度為20mg/ml氯化鈷與10mg/ml氯化鋁混合溶液移液到光面紙的光面上，形成顆粒間距為9mm的12 X 8陣列，液滴體積為0.5 μ I，烘干，然后用單面覆膠的透明密封膠帶粘到光面紙光面上，將膠帶從光面紙上撕下，固態(tài)干燥劑顆粒陣列便粘附在膠帶覆膠面。2、制備甜味蛋白結(jié)晶溶液將甜味蛋白(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為T7638)溶于pH為7.00，0.025mol/LHEPES-Na緩沖液中，制得濃度為5mg/ml的甜味蛋白溶液。用自動(dòng)移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號(hào)為HR2-144的IndeX 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔中，其中，添加到坐滴孔內(nèi)的結(jié)晶試劑的體積為I μ I/孔；接著將甜味蛋白溶液轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的每個(gè)坐滴孔中，其中，每個(gè)坐滴孔內(nèi)甜味蛋白溶液的體積為I μ 1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑混合后，每個(gè)坐滴孔中甜味蛋白結(jié)晶溶液的體積是2 μ I。3、結(jié)晶處理用粘有干燥劑陣列的膠帶密封96孔坐滴板，每顆干燥劑對(duì)應(yīng)一滴結(jié)晶溶液，將坐滴板放入控溫箱，20° C恒溫靜置，溶菌酶進(jìn)行第一次結(jié)晶處理，96小時(shí)后，取出坐滴板，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)出獲得甜味蛋白晶體的數(shù)目。用新的粘有干燥劑陣列的膠帶替換舊的膠帶，再次將坐滴板放入恒溫箱中，靜置96小時(shí)觀察結(jié)果；重復(fù)上述過程，直至全部甜味蛋白結(jié)晶溶液蒸干，統(tǒng)計(jì)出最終獲得甜味蛋白晶體的數(shù)目，計(jì)算甜味蛋白最終的結(jié)晶成功率。結(jié)果如下:逐級(jí)干燥促使蛋白質(zhì)結(jié)晶，甜味蛋白結(jié)晶的成功率與已有文獻(xiàn)報(bào)道(A gradual desiccation method for improving the efficiency of proteincrystallization screening,Journal of Applied Crystallography, 2012, Vol.45:758-765)的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法結(jié)果相比，成功率提高了 60%。實(shí)施例3:乳白蛋白結(jié)晶條件的篩選。1、制備干燥劑陣列

用自動(dòng)移液系統(tǒng)將濃度為30mg/ml氯化鎂溶液移液到光面紙的光面上，形成顆粒間距為9_的12X8陣列，液滴體積為0.3μ 1，烘干，然后用單面覆膠的透明密封膠帶粘到光面紙光面上，將膠帶從光面紙上撕下，固態(tài)干燥劑顆粒陣列便粘附在膠帶覆膠面。2、制備乳白蛋白結(jié)晶溶液將乳白蛋白(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為L(zhǎng)5385)溶于pH為7.00,0.025mol/LHEPES-Na緩沖液中，制得濃度為10mg/ml的乳白蛋白溶液。用自動(dòng)移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號(hào)為HR2-144的IndeX 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔中，其中，添加到坐滴孔內(nèi)的結(jié)晶試劑的體積為0.5 μ I/孔；接著將乳白蛋白溶液轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的每個(gè)坐滴孔中，其中，每個(gè)坐滴孔內(nèi)乳白蛋白溶液的體積為0.5 μ 1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑混合后，每個(gè)坐滴孔中乳白蛋白結(jié)晶溶液的體積是I μ I。3、結(jié)晶處理用粘有干燥劑陣列的膠帶密封96孔坐滴板，每顆干燥劑對(duì)應(yīng)一滴結(jié)晶溶液，將坐滴板放入控溫箱，20° C恒溫靜置，乳白蛋白進(jìn)行第一次結(jié)晶處理，72小時(shí)后，取出坐滴板，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)出獲得乳白蛋白晶體的數(shù)目。用新的粘有干燥劑陣列的膠帶替換舊的膠帶，再次將坐滴板放入恒溫箱中，靜置72小時(shí)觀察結(jié)果；重復(fù)上述過程，直至全部乳白蛋白結(jié)晶溶液蒸干，統(tǒng)計(jì)出最終獲得乳白蛋白晶體的數(shù)目，計(jì)算乳白蛋白最終的結(jié)晶成功率。結(jié)果如下:逐級(jí)干燥促使蛋白質(zhì)結(jié)晶，乳白蛋白結(jié)晶的成功率與已有文獻(xiàn)報(bào)道(A gradual desiccation method for improving the efficiency of proteincrystallization screening,Journal of Applied Crystallography, 2012, Vol.45:758-765)的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法結(jié)果相比，成功率提高了 100%。實(shí)施例4:蛋白酶K結(jié)晶條件的篩選。1、制備干燥劑陣列用雙面膠將單面覆膠的透明密封膠帶的無(wú)膠面粘貼在平臺(tái)上，覆膠面朝上。用電動(dòng)移液器將濃度為10mg/ml硫酸銅和硫酸鈉溶液噴到平臺(tái)上面的膠帶覆膠面上，形成距離為9_的12X8液滴陣列，液滴體積為I μ I。將該膠帶從平臺(tái)上取下，放入烘干爐內(nèi)烘干，膠帶覆膠面上便形成固態(tài)干燥劑陣列。2、制備蛋白酶K結(jié)晶溶液將蛋白酶K(美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為 Ρ6556)溶于pH為 7.00，0.025mol/L HEPES-Na緩沖液中，制得濃度10mg/ml蛋白酶K溶液。用自動(dòng)移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號(hào)為HR2-144的IndexTM96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔中，其中，添加到坐滴孔內(nèi)的結(jié)晶試劑的體積為I μ I/孔；接著將蛋白酶K溶液轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的每個(gè)坐滴孔中 ，其中，每個(gè)坐滴孔內(nèi)蛋白酶K溶液的體積為1μ 1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑混合后，每個(gè)坐滴孔中蛋白酶K結(jié)晶溶液的體積是2 μ I。3、結(jié)晶處理用粘有干燥劑陣列的膠帶密封96孔坐滴板，每顆干燥劑對(duì)應(yīng)一滴結(jié)晶溶液，將坐滴板放入控溫箱，20° C恒溫靜置，蛋白酶K進(jìn)行第一次結(jié)晶處理，72小時(shí)后，取出坐滴板，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)出獲得蛋白酶K晶體的數(shù)目。用新的粘有干燥劑陣列的膠帶替換舊的膠帶，再次將坐滴板放入恒溫箱中，靜置72小時(shí)觀察結(jié)果；重復(fù)上述過程，直至全部蛋白酶K結(jié)晶溶液蒸干，統(tǒng)計(jì)出最終獲得蛋白酶K晶體的數(shù)目，計(jì)算蛋白酶K最終的結(jié)晶成功率。結(jié)果如下:逐級(jí)干燥促使蛋白質(zhì)結(jié)晶，蛋白酶K結(jié)晶的成功率與已有文獻(xiàn)報(bào)道(A gradual desiccation method for improving the efficiency of proteincrystallization screening, Journal of Applied Crystallography, 2012, Vol.45:758-765)的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法結(jié)果相比，成功率提高了 80%。實(shí)施例5:糜蛋白酶原A II結(jié)晶條件的篩選。1、制備干燥劑陣列用雙面膠將單面覆膠的透明密封膠帶的無(wú)膠面粘貼在平臺(tái)上，覆膠面朝上。用自動(dòng)移液系統(tǒng)將濃度為20mg/ml氯化鈣溶液噴射到平臺(tái)上面的膠帶覆膠面上，形成距離為9mm的12X8液滴陣列，液滴體積為0.1 μ I。將該膠帶從平臺(tái)上取下，放入烘干爐內(nèi)烘干，膠帶覆膠面上便形成固態(tài)干燥劑陣列。2、制備糜蛋白酶原A II結(jié)晶溶液將糜蛋白酶原A II (美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為C4879)溶于pH為7.00，0.025mol/L HEPES-Na緩沖液中，制得濃度為10mg/ml的糜蛋白酶原A II溶液。用自動(dòng)移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號(hào)為HR2-144的IndeX 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔中，其中，添加到坐滴孔內(nèi)的結(jié)晶試劑的體積為0.7 μ I/孔；接著將糜蛋白酶原A II溶液轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的每個(gè)坐滴孔中，其中，每個(gè)坐滴孔內(nèi)糜蛋白酶原A II溶液的體積為0.7μ 1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑混合后，每個(gè)坐滴孔中糜蛋白酶原A II結(jié)晶溶液的體積是1.4 μ I。3、結(jié)晶處理用粘有干燥劑陣列的膠帶密封96孔 坐滴板，每顆干燥劑對(duì)應(yīng)一滴結(jié)晶溶液，將坐滴板放入控溫箱，20° C恒溫靜置，糜蛋白酶原A II進(jìn)行第一次結(jié)晶處理，72小時(shí)后，取出坐滴板，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)出獲得糜蛋白酶原A II晶體的數(shù)目。用新的粘有干燥劑陣列的膠帶替換舊的膠帶，再次將坐滴板放入恒溫箱中，靜置72小時(shí)觀察結(jié)果；重復(fù)上述過程，直至全部糜蛋白酶原A II結(jié)晶溶液蒸干，統(tǒng)計(jì)出最終獲得糜蛋白酶原A II晶體的數(shù)目，計(jì)算糜蛋白酶原A II最終的結(jié)晶成功率。結(jié)果如下:逐級(jí)干燥促使蛋白質(zhì)結(jié)晶，糜蛋白酶原A II結(jié)晶的成功率與已有文獻(xiàn)報(bào)道(A gradual desiccation method for improving the efficiency of proteincrystallization screening, Journal of Applied Crystallography, 2012, Vol.45:758-765)的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法結(jié)果相比，成功率提高了 120%。實(shí)施例6:刀豆球蛋白A VI結(jié)晶條件的篩選。1、制備干燥劑陣列用雙面膠將單面覆膠的透明密封膠帶的無(wú)膠面粘貼在平臺(tái)上，覆膠面朝上。用自動(dòng)移液系統(tǒng)將濃度為5mg/ml硫酸鎂溶液噴射到平臺(tái)上面的膠帶覆膠面上，形成距離為9mm的12X8液滴陣列，液滴體積為2μ I。將該膠帶從平臺(tái)上取下，放入烘干爐內(nèi)烘干，膠帶覆膠面上便形成固態(tài)干燥劑陣列。2、制備刀豆球蛋白A VI結(jié)晶溶液將刀豆球蛋白A VI (美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為L(zhǎng)7647)溶于pH為7.00，0.025mol/LHEPES-Na緩沖液中，制得濃度為10mg/ml的刀豆球蛋白A VI溶液。用自動(dòng)移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號(hào)為HR2-144的IndeX 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔中，其中，添加到坐滴孔內(nèi)的結(jié)晶試劑的體積為0.7 μ I/孔；接著將刀豆球蛋白A VI溶液轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的每個(gè)坐滴孔中，其中，每個(gè)坐滴孔內(nèi)溶菌酶溶液的體積為0.7 μ 1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑混合后，每個(gè)坐滴孔中刀豆球蛋白A VI結(jié)晶溶液的體積是1.4 μ I ο3、結(jié)晶處理用粘有干燥劑陣列的膠帶密封96孔坐滴板，每顆干燥劑對(duì)應(yīng)一滴結(jié)晶溶液，將坐滴板放入控溫箱，20° C恒溫靜置，溶菌酶進(jìn)行第一次結(jié)晶處理，72小時(shí)后，取出坐滴板，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)出獲得刀豆球蛋白A VI晶體的數(shù)目。用新的粘有干燥劑陣列的膠帶替換舊的膠帶，再次將坐滴板放入恒溫箱中，靜置72小時(shí)觀察結(jié)果；重復(fù)上述過程，直至全部刀豆球蛋白A VI結(jié)晶溶液蒸干，統(tǒng)計(jì)出最終獲得刀豆球蛋白A VI晶體的數(shù)目，計(jì)算刀豆球蛋白A VI最終的結(jié)晶成功率。結(jié)果如下:逐級(jí)干燥促使蛋白質(zhì)結(jié)晶，刀豆球蛋白A VI結(jié)晶的成功率與已有文獻(xiàn)報(bào)道(A gradual desiccation method for improving the efficiency of proteincrystallization screening, Journal of Applied Crystallography, 2012, Vol.45:758-765)的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法結(jié)果相比，成功率提高了 15%。實(shí)施例7:核糖核酸酶Al結(jié)晶條件的篩選。1、制備干燥劑陣列
用雙面膠將單面覆膠的透明密封膠帶的無(wú)膠面粘貼在平臺(tái)上，覆膠面朝上。用自動(dòng)移液系統(tǒng)將濃度為10mg/ml氯化鋇溶液噴射到平臺(tái)上面的膠帶覆膠面上，形成距離為9mm的12X8液滴陣列，液滴體積為I μ I。將該膠帶從平臺(tái)上取下，放入烘干爐內(nèi)烘干，膠帶覆膠面上便形成固態(tài)氯化鋁干燥劑陣列。2、制備糜蛋白酶原A II結(jié)晶溶液將核糖核酸酶Al (美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為R4875)溶于pH為7.00，0.025mol/L HEPES-Na緩沖液中，制得濃度為10mg/ml的核糖核酸酶Al溶液。用自動(dòng)移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號(hào)為HR2-144的IndeX 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔中，其中，添加到坐滴孔內(nèi)的結(jié)晶試劑的體積為I μ I/孔；接著將核糖核酸酶Al溶液轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的每個(gè)坐滴孔中，其中，每個(gè)坐滴孔內(nèi)核糖核酸酶Al溶液的體積為I μ 1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑混合后，每個(gè)坐滴孔中核糖核酸酶Al結(jié)晶溶液的體積是2 μ I。3、結(jié)晶處理用粘有干燥劑陣列的膠帶密封96孔坐滴板，每顆干燥劑對(duì)應(yīng)一滴結(jié)晶溶液，將坐滴板放入控溫箱，20° C恒溫靜置，核糖核酸酶Al進(jìn)行第一次結(jié)晶處理，72小時(shí)后，取出坐滴板，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)出獲得核糖核酸酶Al晶體的數(shù)目。用新的粘有干燥劑陣列的膠帶替換舊的膠帶，再次將坐滴板放入恒溫箱中，靜置72小時(shí)觀察結(jié)果；重復(fù)上述過程，直至全部核糖核酸酶Al結(jié)晶溶液蒸干，統(tǒng)計(jì)出最終獲得核糖核酸酶Al晶體的數(shù)目，計(jì)算核糖核酸酶Al最終的結(jié)晶成功率。結(jié)果如下:逐級(jí)干燥促使蛋白質(zhì)結(jié)晶，核糖核酸酶Al結(jié)晶的成功率與已有文獻(xiàn)報(bào)道(A gradual desiccation method for improving the efficiency of proteincrystallization screening,Journal of Applied Crystallography, 2012, Vol.45:758-765)的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法結(jié)果相比，成功率提高了 8倍。實(shí)施例8:細(xì)胞色素c結(jié)晶條件的篩選。1、制備干燥劑陣列用雙面膠將單面覆膠的透明密封膠帶的無(wú)膠面粘貼在平臺(tái)上，覆膠面朝上。用自動(dòng)移液系統(tǒng)將濃度為20mg/ml氯化鈷和氯化鋁溶液噴射到平臺(tái)上面的膠帶覆膠面上，形成距離為9mm的12X8液滴陣列，液滴體積為0.5 μ I。將該膠帶從平臺(tái)上取下，放入烘干爐內(nèi)烘干，膠帶覆膠面上便形成固態(tài)氯化鋁干燥劑陣列。2、制備糜蛋白酶原A II結(jié)晶溶液將細(xì)胞色素c (美國(guó)Sigma公司，貨號(hào)為C3131)溶于pH為7.00，0.025mol/LHEPES-Na緩沖液中，制得濃度為10mg/ml的細(xì)胞色素c溶液。用自動(dòng)移液系統(tǒng)將Hampton公司貨號(hào)為HR2-144的IndeX 96結(jié)晶試劑盒中的蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑分別轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的相應(yīng)坐滴孔中，其中，添加到坐滴孔內(nèi)的結(jié)晶試劑的體積為I μ I/孔；接著將細(xì)胞色素c溶液轉(zhuǎn)移到96孔坐滴板的每個(gè)坐滴孔中，其中，每個(gè)坐滴孔內(nèi)溶菌酶溶液的體積為I μ 1，與蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑混合后，每個(gè)坐滴孔中細(xì)胞色素c結(jié)晶溶液的體積是2 μ I。3、結(jié)晶處理用粘有干燥劑陣列的膠帶密封96孔坐滴板，每顆干燥劑對(duì)應(yīng)一滴結(jié)晶溶液，將坐滴板放入控溫箱，20° C恒溫靜置，細(xì)胞色素c進(jìn)行第一次結(jié)晶處理，72小時(shí)后，取出坐滴板，在顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)出獲得細(xì)胞色素C晶體的數(shù)目。用新的粘有干燥劑陣列的膠帶替換舊的膠帶，再次將坐滴板放入恒溫箱中，靜置72小時(shí)觀察結(jié)果；重復(fù)上述過程，直至全部細(xì)胞色素c結(jié)晶溶液蒸干，統(tǒng)計(jì)出最終獲得細(xì)胞色素c晶體的數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞色素c最終的結(jié)晶成功率。結(jié)果如下:逐級(jí)干燥促使蛋白質(zhì)結(jié)晶，細(xì)胞色素c結(jié)晶的成功率與已有文獻(xiàn)報(bào)道(A gradual desiccation method for improving the efficiency of proteincrystallization screening, Journal of Applied Crystallography, 2012, Vol.45:758-765)的傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法結(jié)果相比， 成功率提高了 200%。
權(quán)利要求
1.一種快速制備干燥劑陣列用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法，其特征在于包括以下步驟: 1)配制化合物溶液，在光面紙上將該溶液按照與蛋白質(zhì)結(jié)晶板結(jié)晶池匹配的位置移液，制備成液滴陣列，烘干后獲得化合物干燥劑陣列，再用透明膠帶緊密粘貼在有干燥劑陣列的光面紙上，撕開透明膠帶獲得固態(tài)干燥劑陣列； 或者，配制化合物溶液，將該溶液按照與蛋白質(zhì)結(jié)晶板結(jié)晶池匹配的位置直接移液到透明膠帶的覆膠面上，制備出化合物液滴陣列，將該液滴陣列烘干得到固態(tài)干燥劑陣列； 2)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求配制單個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液； 3)將蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液滴到結(jié)晶板的孔中，用粘有固態(tài)化合物干燥劑陣列的透明膠帶密封結(jié)晶板，使每粒干燥劑對(duì)應(yīng)一滴蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液，且相互不接觸，將結(jié)晶板控溫在0-55°C條件下進(jìn)行結(jié)晶，干燥劑陣列開始吸取結(jié)晶溶液中的溶劑，48-96小時(shí)后取出，觀察結(jié)晶結(jié)果; 4)將結(jié)晶板上膠帶撕下，每次替換一片粘有固態(tài)化合物干燥劑陣列的透明膠帶，在密閉條件下重復(fù)進(jìn)行結(jié)晶處理 ，直到蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液全部干燥為止。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種快速制備干燥劑陣列用于蛋白質(zhì)結(jié)晶的方法，首先配制化合物溶液，在透明膠帶上制備固態(tài)干燥劑陣列；然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求配制單個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液；用粘有固態(tài)化合物干燥劑陣列的透明膠帶密封結(jié)晶板，觀察結(jié)晶結(jié)果；替換透明膠帶在密閉條件下重復(fù)進(jìn)行結(jié)晶處理，直到蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液全部干燥為止。本發(fā)明在起到提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的同時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)快速制備干燥劑陣列，提高生產(chǎn)效率；同時(shí)，由于化合物的高一致性的吸濕率，結(jié)晶的可重復(fù)性同時(shí)得到提高。該方法能夠批量化生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N9/22GK103232523SQ20131014078
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2013年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月22日
發(fā)明者尹大川, 鹿芹芹, 解旭卓, 閆二開, 陳達(dá), 陳瑞卿, 劉永明 申請(qǐng)人:西北工業(yè)大學(xué)