專利名稱：制備干擾素α-2晶體的方法
人干擾素α是一類至少包含24個亞種的蛋白(Zoon K.C.，Interferon9∶1-12，1987，Gresser I.編，Academic Press，New York)。它們原來被描述為能夠在細胞內誘導抗病毒狀態的藥劑，但現在被稱為影響免疫系統許多功能的多效性淋巴激活素(Opdenakker等，Experimentia 45∶513-520，1989)。除了其體外生物活性外，人干擾素α目前用于幾種重要的指征，例如毛細胞性白血病、卡波濟肉瘤、尖銳濕疣等，并正在研究將其用于其他幾種指征(Intron A(干擾素α-2b)Clinical Status(1989))。這是從1989年9月在英國倫敦召開的第五屆歐洲臨床腫瘤學大會的一個附屬討論會上得來的進展。對結構的闡明及各種劑型的配制來說，最為重要的是要得到高度純化的結晶態干擾素α，尤其是重組型α-2b。
現已報道了兩種形式的結晶人干擾素α-2(Miller等，Science 215689-690，1982;Kung等，美國專利4，672，108;Weissmann，“干擾素的克隆及其它錯誤”，Interferon 1981，Ion Gresser編，Academic Press，New York，101-134;Weissmann，Phil.Trans.R.Soc.Lond.，B2997-28，1982;Nagabhusban等，“遺傳工程α-2干擾素的定性鑒定”，InterferonResearch，Clinical Application and RegulatoryConsideration，Zoon等編，Elsevier，New York79-88，1982)。這些出版物敘述了在低溫下從聚乙二醇中結晶干擾素α-2的方法，或者通過調節PH或溫度而從磷酸鹽緩沖液中結晶干擾素α-2的方法。通常用這些方法得到的針狀結晶，用X射線衍射技術難以準確鑒定其特性。Miller等人的文章還提到了“棱狀”結晶干擾素α-2。
一般來說，對干擾素這樣的蛋白質進行結晶的方法是無法預言的。例如，Kung等人的美國專利4，672，108(1987)在第1欄第52-64行特別指出“現已建立了多種蛋白質結晶技術，但尚未發現通用的方法，因此許多蛋白質仍未結晶出來。所以，蛋白質的結晶是一門無法預言的技術，需要對許多可供選擇的可能方法作反復試驗。
應用最為廣泛的方法之一，涉及在蛋白質溶液中加入一種結晶劑，通常是一種鹽(例如硫酸銨或檸檬酸銨)或一種有機溶劑(例如乙醇或2-乙基-2，4-戊二醇)。但這些方法并未提供生產人白細胞干擾素結晶的合適手段。”(加了著重號。)我們現已意外地發現了一種即使在室溫下也能有效地產生高質量結晶干擾素α-2的方法，該方法包括使干擾素α-2的溶液與一種硫酸鹽溶液平衡，使干擾素α-2溶液變得更濃，從而形成干擾素α-2結晶。最好利用超濾法或透析法，或采用液滴(如懸滴或夾滴)來實現平衡。
干擾素α-2的溶液最好含有一種硫酸鹽，并且該溶液最好與濃度更高的硫酸鹽溶液平衡。該硫酸鹽優選銨鹽、鈣鹽、鎘鹽、鉀鹽、鋰鹽、鎂鹽或鈉鹽，更為優選的是硫酸銨。開始形成結晶時硫酸鹽在結晶干擾素α-2溶液中的濃度最好為約12%至30%飽和，更為優選的是濃度為約15%至25%飽和的硫酸銨。如下面所指出的，平衡步驟開始時硫酸鹽的濃度較低，即約2%至18%飽和。
優選的干擾素α-2為干擾素α-2b，更為優選的是人的重組結晶干擾素α-2b。在一個實施方案中，結晶物為具有如下所示氨基酸順序的干擾素α-2b
也可采用干擾素α-2a。干擾素α-2a的一級氨基酸順序與上述干擾素α-2b順序的不同之處在于，23位殘基處由賴氨酸置換了精氨酸。
干擾素α-2的硫酸鹽溶液最好含有一種緩沖液，其pH為6.5至8.5，較為優選的是7.3至8.0，例如磷酸鈉緩沖液。
由上述方法制得的結晶干擾素α-2可作為晶種而用于制備另一批結晶干擾素α-2。
如前面所指出的，本發明的方法包括使干擾素α-2的硫酸鹽溶液與一種硫酸鹽溶液平衡，使結晶干擾素α-2溶液變得更濃，從而形成干擾素α-2結晶。可以采用任何適宜的干擾素α-2，例如干擾素α-2a和干擾素α-2b，更為優選的是人的重組干擾素α-2a(r-h-干擾素α-2a)或干擾素α-2b(r-h-干擾素α-2b)。商品α-2干擾素制劑可從Hoffmann-La Roche公司(Roferon )和先靈公司(Intron A)得到。含有各種α-2干擾素的純凈干擾素混合物可從Burroughs-Wellcome公司(Wellferon )得到。鑒于人干擾素α中有高度的順序同源性，本發明的方法應對每一亞種都適用。
人干擾素α-2各亞種可通過重組DNA技術來制取，也可以從天然來源(如人外周血淋巴細胞、人類淋巴母細胞系)純化，例如如Pestka等人所述(Ann.Rev.Biochem.，56∶727-777，1987)。優選的干擾素α-2是具有上述氨基酸順序的r-h-干擾素α-2b。
天然人干擾素α已從若干細胞來源中純化出來，其中包括從全血中分離出的白細胞、新生成纖維細胞、類淋巴母細胞及各種白血病細胞系。首先應用于臨床的人白細胞干擾素制劑是由芬蘭的K.Cantell及其同事研制的，他們的方法是將取自正常供血者的血液離心后注入干擾素，加入仙臺病毒進行誘導并離心。所得上清液用硫氰酸鉀沉淀，用乙醇提取，經pH沉淀后對磷酸鹽緩沖液透析(K.E.Morgensen，L.Cantell，Pharmacol.Ther.1∶369-381，1977)。
重組干擾素α已由幾個研究小組克隆出來并在大腸桿菌中表達(例如C.Weissmann等，Science 209∶1343-1349，1980)。有幾個研究小組描述了純化重組α-2干擾素的方法，該方法配合使用了一些層析步驟，例如硫酸銨沉淀、染料親和層析、離子交換和凝膠過濾，例如如Weissmann，C.所述(Phil.R.Soc.(Lond)，b299∶7-28，1982)。另一種純化重組干擾素α的方法采用了免疫親和層析法和固定化抗體(P.P.Trotta等，Developments in Industrial Microbiology，72∶53-64，Elsevier，Amsterdam)。有關用于重組α干擾素的現有純化方案的綜述，參見T.L.Nagabhushan和P.P.Trotta，《Ullmann工業化學大全》，A14，VCH，Weinheim(聯邦德國)，372-374，1989。所用的干擾素α-2b最好用該綜述所述的常規純化方法純化，然后進行反相高效層析。
適宜的平衡方法包括透析、超濾，例如透濾，或者利用液滴，例如懸滴或夾滴。可以用濃度高于干擾素α-2的硫酸鹽溶液的另一種硫酸鹽溶液實現平衡。一種特別優選的方法是使r-h-干擾素α-2的溶液與使用磷酸鹽緩沖液的硫酸鹽溶液平衡。平衡過程最好緩慢進行，例如長達2-30天。
大規模的結晶可以用相當于蒸氣擴散的方法來進行，即利用透析和超濾。在臨床制備過程中，可以利用大規模結晶作為純化或濃縮步驟。此外，在這種操作中可以用其它常用硫酸鹽代替硫酸銨。
結晶時，即首次出現結晶時，干擾素α-2在硫酸鹽溶液中的終濃度可為約10-80毫克/毫升。更為優選的是，干擾素α-2的濃度為約30-50毫克/毫升。干擾素α-2的起始濃度最好為約20毫克/毫升。
在結晶步驟開始前的起始階段，干擾素α-2溶液中硫酸鹽的濃度可為約2%-18%飽和，即，硫酸鹽的濃度為溶液達100%飽和時濃度的2-18%。更為優選的是，干擾素α-2溶液中硫酸鹽的濃度為約7%-15%飽和。結晶步驟開始時抗衡溶液中硫酸鹽的濃度為約12-30%飽和，更為優選的是約15-25%飽和。
干擾素α-2溶液和抗衡硫酸鹽溶液的pH最好控制在約6.5-8.5的范圍，更優選的是約7.3-8.0。為此可采用任何合適的緩沖劑。例如可以采用磷酸鈉、三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽或N-(2-羥乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)緩沖劑。
結晶過程最好在控溫條件下進行。溫度最好在約15℃-37℃的范圍內，更為優選的是約18℃-25℃。
由于本發明意外地在室溫下產生結晶干擾素α-2，所以與在4℃下用聚乙二醇得到的晶體相比具有突出的優點。現在已經有可能在室溫下貯存和配制人干擾素α-2晶體。用加有0.15M氯化鈉的20mM磷酸鈉(pH7.5)緩沖液透析可以使該晶體溶解。此外，由于硫酸鹽溶液比聚乙二醇更容易用透析等方法除去，可以在重新溶解后用本發明的方法得到更純的干擾素α-2結晶。
用本發明方法制得的結晶干擾素α-2將構成各種藥物制劑的基礎。例如，該結晶干擾素可應用于緩釋制劑。例如能夠以相當于0.1-1.0微克/千克體重的日劑量釋放的貯庫制劑。采用用本發明方法制得的晶體的貯庫制劑，其溶解速度應大大低于含有在4℃下制得的晶體的制劑。特別是，室溫(22℃)晶體的溫度敏感性應低于要求較低結晶溫度的晶體。
此外，可以使人干擾素α-2與金屬形成配合物，然后再用本發明的方法結晶。這樣一種配合物的結晶同樣可以用于緩釋制劑。用于緩釋制劑中的金屬離子-蛋白配合物的例子在先有技術中已有描述。轉讓給Novo Terapeutisk Laboratorium A/S的美國專利2，882，203，描述了將氯化鋅加入無菌胰島素溶液中而制得的鋅和胰島素的配合物。這種配合物的結晶懸浮液的作用時間比非結晶制劑長4-6倍(《Remington藥物學》，Gennaro，A.R.編，Mack Publishing Co.，Easton，Penn.17∶975-976，1985)。許多制造廠家以不同的形式銷售鋅-胰島素配合物，例如長效胰島素(Squibb)、超長效胰島素(Lilly)和超長效胰島素/超緩(Squibb-Novo)(出處同上)。魚精蛋白鋅胰島素是胰島素(鋅-胰島素)和一種堿性蛋白(Salmiridin)的結晶產物。該產物以幾個不同的商品名制造NPN-Iletin(Lilly)、Insulated(Leo)和Novolin N(Squibb-Novo)(《制藥大全》，Sittig，M.編，1∶820-822，1988)。可以用美國專利2，882，203所述的方法形成鋅-干擾素α-2配合物。可用本發明的方法使干擾素α-2-鋅配合物結晶。用適當的添加劑(如對羥基苯甲酸甲酯、氯化鈉和乙酸鈉)配成的結晶懸浮液(含有大小均勻的晶體)可用于皮下注射。
用本發明的方法制備的結晶干擾素α-2，可以按與現有的干擾素α-2材料用于藥物制劑時的方式大體相同的方式使用，例如制成干擾素α-2的貯庫制劑，這種制劑可設計成結晶干擾素α-2的日劑量為約0.1-1.0微克/千克。這種制劑含有生理有效量的結晶干擾素α-2及常規藥用載體。
這里所公開的發明用下列實施例來舉例說明，但不應誤認為是限制發明范圍。本發明范圍內的另一些方法對本領域技術人員來說也將是顯而易見的。
所采用的干擾素α-2為如Weissmann等人所述(Science2091343，1980)在大腸桿菌中表達的重組人干擾素α-2b。按照Leibowitz，P.等人的美國專利4，315，852(1982)以前所報道的方法對細胞進行培養、收集和提取。所得到的提取液用一系列常規純化步驟進行純化乙醇提取、基質凝膠藍色配體親和層析、離子交換和凝膠過濾層析。所得到的純化干擾素α-2b制備物用反相HPLC法用Rainin Auto Prep層析系統進一步純化。純化出的干擾素α-2b(50毫克)在Rainin(4.1×250厘米)C4300埃柱上進行層析，該柱已預先用27%乙腈、0.1%三氟乙酸(TFA)平衡。用27%-72%乙腈、0.1%TFA的線性梯度以40毫升/分洗脫30分鐘，從柱中洗脫出干擾素α-2b。用一臺串聯的Knauer紫外檢測器在280納米處進行檢測，根據所得出的光吸收曲線收集洗脫出的各部分。
采用懸滴、落滴或夾滴技術，用蒸氣擴散法實現結晶。懸滴蒸氣擴散實驗在24孔組織培養皿(Becton Dickinson公司，Lincoln park，NJ)中進行。夾滴實驗在蛋白質結晶皿Crystalplate(Flow Laboratories，McLean，VA)中進行。落滴蒸氣擴散實驗在MVD/24多室蒸氣擴散皿(Crychem公司，Riverside，CA)中進行。
進行懸滴實驗時，取10微升含有20毫克/毫升蛋白質、10%水飽和的硫酸銨、40mM磷酸鈉(pH8.0)的液滴，使其從扣在Linbro組織培養皿上的硅化蓋玻片上懸下。使這些液滴與1毫升20%飽和的硫酸銨、40mM磷酸鈉(pH8.0)平衡。在22℃下保溫4-15天后出現棱狀大單斜晶(0.5×0.5×0.5毫米)。用類似的溶液和實驗條件進行落滴和夾滴實驗。這些晶體在進行X射線衍射分析時很穩定，衍射分辨率為6
。用不同批次的晶體進行X射線分析得到一致的形態學結果。這是首次報道干擾素α-2的X射線衍射圖案。
進行X射線研究時，把晶體裝在玻璃毛細管中，在22℃下用回擺相機利用由Rigaku RU-300旋轉陽極發生器發出的CuKα輻射進行拍照，陽極發生器的操作電壓為40kV，電流為100mA。在Nicolet X-100A特定范圍放射線檢測器上用相同的輻射源讀取原始數據。
定性鑒定1.生物測定用注射器從懸滴中吸出分散的結晶，然后在22℃下重新懸浮于100微升由35%飽和的硫酸銨、40mM磷酸鈉(pH8.0)組成的洗滌液中。將該懸浮液離心，用巴氏吸管吸出洗滌液。將洗滌過的結晶在22℃下重新溶解于100微升20mM磷酸鈉(pH7.5)、0.15M氯化鈉中。
用經過修改的Bradford測定法測定蛋白質，用純凈的人干擾素α-2b作參考標準。用細胞病抑制測定法，利用人包皮二倍體成纖維細胞和腦心肌炎病毒(ATCC-VR-129)測定抗病毒活性。該測定法的詳細敘述見S.Rubinstein、P.C.Familletti和S.Pestka，J.Virol.37∶755-758，1981。重新溶解后得到的溶液的比活為2.0×108國際單位/毫克。此數值在該測定法的誤差范圍內與對結晶前的原始干擾素α-2b制備物所預計的數值相同(一般在1×108-3×108國際單位/毫克范圍內)。
2.HPLC對一個重新溶解的干擾素晶體樣品進行分析高效液相層析(HPLC)(Waters Ass.Milford，MA)。將樣品加到Rainin Dynamax C4300埃柱(4.6×250毫米)上，然后用含0.1%三氟乙酸的27-72%乙腈線性梯度洗脫30分鐘。用靈敏度為0.02吸收單位的Gilson可變波長檢測器在280納米處監測流出液。重新溶解的晶體溶液和結晶前的原始干擾素α-2b制備物的保留時間和層析圖譜都相同。
3.SDS-PAGE分析用Laemmli，U.K.(Nature 227∶680，1970)所述的單向15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)，對結晶前后的干擾素α-2b進行比較。當樣品在同一凝膠上的平行泳道中進行比較時，相對遷移率沒有變化。
由以上的1、2和3可以明顯看出，沒有任何理由認為蛋白質在結晶或再生過程中發生了任何化學變化或任何變性。
雖然已結合上述具體實施方案敘述了本發明，但許多變換、修改和變動對本領域普通技術人員來說都將是顯而易見的。所有這些變換、修改和變動都將落在本發明的要旨和范圍內。
權利要求
1.一種制備結晶干擾素α-2的方法，該方法包括使含有干擾素α-2的硫酸鹽溶液與一種硫酸鹽溶液平衡，使干擾素α-2溶液變得更濃，從而形成干擾素α-2結晶。
2.權利要求1的方法，其特征在于，所述平衡借助超濾或透析或用蒸氣擴散法來實現。
3.權利要求1或2的方法，其特征在于，所述平衡用蒸氣擴散法利用懸滴或夾滴來實現。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其特征在于，使干擾素α-2的硫酸鹽溶液與濃度更高的硫酸鹽溶液平衡。
5.權利要求1-4中任一項的方法，其特征在于，干擾素α-2為人的重組干擾素α-2b。
6.權利要求5的方法，其特征在于，硫酸鹽選自銨鹽、鈣鹽、鎘鹽、鉀鹽、鋰鹽、鎂鹽或鈉鹽。
7.權利要求5的方法，其特征在于，硫酸鹽為硫酸銨。
8.權利要求5的方法，其特征在于，干擾素α-2的硫酸鹽溶液含有緩沖劑。
9.權利要求8的方法，其特征在于，干擾素α-2溶液緩沖至pH為7.3-8.0。
10.權利要求9的方法，其特征在于，緩沖劑為磷酸鈉。
11.權利要求10的方法，其特征在于，形成干擾素α-2結晶時，干擾素α-2溶液中硫酸鹽的濃度為約12%-30%飽和。
12.權利要求10的方法，其特征在于，形成干擾素α-2結晶時，干擾素α-2溶液中硫酸鹽的濃度為約15%-25%飽和。
13.使干擾素α-2結晶的方法，其特征在于，用權利要求1的方法得到的晶體作晶種。
14.一種貯庫制劑，它包含干擾素α-2晶體與一種藥用貯庫劑載體配伍。
15.根據權利要求14的制劑，其特征在于，干擾素α-2晶體為金屬或魚精蛋白配合物的形式。
16.根據權利要求15的制劑，其特征在于，金屬配合物為鋅配合物。
全文摘要
公開了一種制備干擾素α-2晶體的方法及其在貯庫制劑中的應用。
文檔編號C07K1/14GK1058022SQ9110368
公開日1992年1月22日 申請日期1991年6月4日 優先權日1990年6月4日
發明者保羅·賴歇特, 杰拉爾德·S·哈蒙德, 洪·V·李, 塔坦納哈里·L·納加布胡山, 保羅·P·特羅塔 申請人:先靈公司