專利名稱：一種黑海參糖胺聚糖的提取方法
一種黑海參糖胺聚糖的提取方法技術領域
本發明屬于生物技術天然活性物質提取領域，具體涉及一種黑海參糖胺聚糖的提取方法。
背景技術：
隨著人口老齡化程度的提高，心腦血管疾病已經成為人類健康的最大威脅。據報道心腦血管疾病是老年人的三大主要死亡原因之一，目前因心腦血管疾病死亡者占總死亡人數的34%，在存活中約有3/4左右的患者有不同程度的勞動能力和生活自理能力的喪失。 而缺血性中風是心腦血管中最常見的一種疾病，占腦血管病的43飛5%，該疾病發病率高、病死率高、致殘率高、復發率高，嚴重的危害著人類生存和生活質量。中風病世界人口標化發病率為239. 4/10萬，其中缺血性中風占53. 6%。隨著人口老齡化和人類生活方式的變化，其發病率還有逐年增長的趨勢。心腦血管疾病已成為人類死亡的頭等原因，因此積極開展預防該疾病的藥物研制和開發迫在眉睫。
海洋是一個巨大的天然產物寶庫，豐富的海洋生物和海洋活性物質為我們提供一個巨大的海洋藥物資源庫。特殊的海洋生態環境與生物鏈之間的密切相關性使得海洋生物次生代謝產物具有與陸生生物所不同的化學結構和特異高效的生物活性，因此對海洋生物多糖的開發應用具有重大意義。從海洋活性多糖中尋找具有抗凝血作用的有效藥物，已引起國內外醫藥界的密切關注。
糖胺聚糖，舊稱酸性粘多糖或粘多糖。黑海參糖胺聚糖具有抗凝、纖溶、降低血粘度、調節血脂等活性，作用于缺血性中風(腦梗死)的各個環節，從而達到治療缺血性中風的目的。糖胺聚糖是海參中與中風治療有關的主要藥效成分；但是，目前從黑海參中提取的黑海參糖胺聚糖為粗品，不能直接用于制成注射劑。發明內容
為解決上述現有技術中存在的問題，本發明的目的在于提供一種黑海參糖胺聚糖的提取方法，將黑海參糖胺聚糖依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化，得到純度較高的黑海參糖胺聚糖。
本發明的技術方案為一種黑海參糖胺聚糖的提取方法，包括下列步驟步驟一 黑海參預處理；步驟二 堿解黑海參體壁；步驟三雙酶酶解黑海參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質；步驟五用乙醇沉淀黑海參糖胺聚糖；步驟六干燥黑海參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化黑海參糖胺聚糖；步驟八干燥黑海參糖胺聚糖精糖。
優化的，所述步驟七中凝膠柱純化的具體步驟為將40g葡聚糖凝膠用3倍體積的雙蒸水浸泡過夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg糖胺聚糖粗糖用 1OmL緩沖液在40 60°C下溶解上柱，用蒸餾水洗脫，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍比色法檢測各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉蒸發器濃縮。
優化的，所述緩沖液采用O. 5mol/L的NaAC/HAC，其pH為6. O 6. 5。
本發明中所述sephadex g_100為葡聚糖凝膠,本發明對采用的試劑、材料和儀器沒有特殊要求，其均為市售產品，可通過多種商業渠道購得。
本發明的有益效果在于建立了一種有效地制備高純度的黑海參糖胺聚糖的方法，在堿法提取的同時，結合胰蛋白酶和胃蛋白酶的雙酶消化處理，即首先采用堿處理黑海參組織，再用胰蛋白酶和胃蛋白酶水解，以增強黑海參體壁組織匯總糖胺聚糖的釋放。為提高糖胺聚糖的純度，本發明依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化純化黑海參糖胺聚糖粗糖。本發明的方法能夠平衡黑海參糖胺聚糖的得率與純度的關系，提高了黑海參糖胺聚糖的純度。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步說明。
實施例1本實施例的從黑海參中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步驟步驟一黑海參預處理; 步驟二 堿解黑海參體壁；步驟三雙酶酶解黑海參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質；步驟五用乙醇沉淀黑海參糖胺聚糖；步驟六干燥黑海參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化黑海參糖胺聚糖；步驟八干燥黑海參糖胺聚糖精糖。各步驟的具體方法為步驟一黑海參預處理；迅速用蒸餾水沖洗黑海參，去除黑海參體表粘附的異物，用長形小刀自腹部僅肛門向前解剖鮮參，立即剔除內臟，迅速用雙蒸水洗去污物，稱量后將黑海參體壁置于潔凈的大燒杯中，剪碎黑海參體壁；步驟二 堿解黑海參體壁往黑海參體壁中加2倍重量的雙蒸水，然后加入2mol/L的 NaOH,邊加邊攪拌，使NaOH溶液終濃度為O. 5mol/L, 4°C過夜消化；步驟三黑海參體壁的雙酶酶解胰蛋白酶酶解用冰醋酸調解PH值至8. 2，加入黑海參體壁質量O. 45%的胰蛋白酶， 52°C水浴5h，水浴過程中充分攪拌，并滴加5 mmol/L的NaOH溶液，維持pH在8. 2 ;然后將酶解液迅速冷卻至30°C以下，保持30min后終止反應；胃蛋白酶酶解用6mol/L HCl調解pH值至2之間，再添加黑海參體壁質量O. 40%的胃蛋白酶，在50°C的水浴中繼續酶解4h，水浴過程中充分攪拌；酶解終止前取酶解液5mL與玻璃試管中，滴加5%的三氯乙酸溶液進行檢測，當溶液呈微混濁時，將酶解液迅速冷卻至 300C以下，保持30min終止酶解反應；然后以5000r/min離心15min收集上清夜；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸處理雙酶酶解上清夜，三氯乙酸的添加量為酶解液的10%，逐步添加，邊加邊攪拌，使酶解液變混濁為止；將溶液保存在冷藏室中靜置12h，然后以5000r/min離心25min收集上清夜；步驟五乙醇沉淀黑海參糖胺聚糖滴加5mmol/L的NaOH溶液調解上清液的pH值至6.8， 7000r/min離心lOmin，收集上清加入無水乙醇，邊加邊攪拌，使乙醇終濃度為55%，4°C 過夜沉淀；步驟六干燥黑海參糖胺聚糖粗糖7000r/min離心IOmin,收集沉淀,用95%的乙醇洗滌3次，再依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；使沉淀物種的乙醇和丙酮自然揮發，沉淀物半干燥時，用低溫真空干燥機進一步干燥，得到粗制黑海參糖胺聚糖；步驟七首先將50g 二乙氨基乙基纖維素用緩沖液浸泡過夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL緩沖液在40°C下溶解上柱，用緩沖液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脫，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍比色法檢測各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉蒸發器濃縮。
然后將40g sephadex g_100凝膠用3倍體積的雙蒸水浸泡過夜,脫氣后裝柱,用 2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg上述濃縮物用IOmL緩沖液在40°C下溶解上柱，用蒸餾水洗脫，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍比色法檢測各管總糖胺聚糖的含量， 收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉蒸發器濃縮，得到黑海參糖胺聚糖精糖。所述緩沖液采用O. 5mol/L的NaAC/HAC，其pH為6. O。
步驟八干燥黑海參糖胺聚糖精糖將黑海參糖胺聚糖精糖分別用80%、95%、100%乙醇洗滌I次，再依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；然后待的乙醇和丙酮自然揮發，精糖半干燥時，用低溫真空干燥機進一步干燥，得到的白色干燥無定型粉末即為精制多糖。
實施例2本實施例的從黑海參中提取糖胺聚糖的方法，包括下列步驟步驟一黑海參預處理; 步驟二 堿解黑海參體壁；步驟三雙酶酶解黑海參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質；步驟五用乙醇沉淀黑海參糖胺聚糖；步驟六干燥黑海參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化黑海參糖胺聚糖；步驟八干燥黑海參糖胺聚糖精糖。各步驟的具體方法為步驟一黑海參預處理；迅速用蒸餾水沖洗黑海參，去除黑海參體表粘附的異物，用長形小刀自腹部僅肛門向前解剖鮮參，立即剔除內臟，迅速用雙蒸水洗去污物，稱量后將黑海參體壁置于潔凈的大燒杯中，剪碎黑海參體壁；步驟二 堿解黑海參體壁往黑海參體壁中加2倍重量的雙蒸水，然后加入2mol/L的 NaOH,邊加邊攪拌，使NaOH溶液終濃度為O. 5mol/L, 4°C過夜消化；步驟三黑海參體壁的雙酶酶解胰蛋白酶酶解用冰醋酸調解PH值至9. 0，加入黑海參體壁質量O. 45%的胰蛋白酶， 52°C水浴5h，水浴過程中充分攪拌，并滴加5 mmol/L的NaOH溶液，維持pH在9. O ;然后將酶解液迅速冷卻至30°C以下，保持30min后終止反應；胃蛋白酶酶解用6mol/L HCl調解pH值至2. 5之間，再添加黑海參體壁質量O. 40%的胃蛋白酶，在50°C的水浴中繼續酶解4h，水浴過程中充分攪拌；酶解終止前取酶解液5mL與玻璃試管中，滴加5%的三氯乙酸溶液進行檢測，當溶液呈微混濁時，將酶解液迅速冷卻至 300C以下，保持30min終止酶解反應；然后`以5000r/min離心15min收集上清夜；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸處理雙酶酶解上清夜，三氯乙酸的添加量為酶解液的10%，逐步添加，邊加邊攪拌，使酶解液變混濁為止；將溶液保存在冷藏室中靜置12h，然后以5000r/min離心25min收集上清夜；步驟五乙醇沉淀黑海參糖胺聚糖滴加5mmol/L的NaOH溶液調解上清液的pH值至7.2，7000r/min離心lOmin，收集上清加入無水乙醇，邊加邊攪拌，使乙醇終濃度為55%，4°C過夜沉淀；步驟六干燥黑海參糖胺聚糖粗糖7000r/min離心IOmin,收集沉淀,用95%的乙醇洗滌3次，再依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；使沉淀物種的乙醇和丙酮自然揮發，沉淀物半干燥時，用低溫真空干燥機進一步干燥，得到粗制黑海參糖胺聚糖；步驟七首先將50g 二乙氨基乙基纖維素用緩沖液浸泡過夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL緩沖液在60°C下溶解上柱，用緩沖液和1. 5mol/L的NaCl各150mL梯度洗脫，流速采用8mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍比色法檢測各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉蒸發器濃縮。
然后將40g sephadex g_100凝膠用3倍體積的雙蒸水浸泡過夜,脫氣后裝柱,用 2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg上述濃縮物用IOmL緩沖液在60°C下溶解上柱，用蒸餾水洗脫，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍比色法檢測各管總糖胺聚糖的含量， 收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉蒸發器濃縮，得到黑海參糖胺聚糖精糖。所述緩沖液采用O. 5mol/L的NaAC/HAC，其pH為6. 5。
步驟八干燥黑海參糖胺聚糖精糖將黑海參糖胺聚糖精糖分別用80%、95%、100%乙醇洗滌I次，再依次用無水乙醇和丙酮分別洗滌和脫水I次；然后待乙醇和丙酮自然揮發，精糖半干燥時，用低溫真空干燥機進一步干燥，得到的白色干燥無定型粉末即為精制多糖。
本發明實施例中所實施的從黑海參中提取糖胺聚糖的方法，均能夠平衡黑海參糖胺聚糖得率與純度的關系，提高黑海參糖胺聚 糖的純度。
權利要求
1.ー種黑海參糖胺聚糖的提取方法，其特征在干包括下列步驟步驟ー黒海參預處理；步驟ニ 堿解黑海參體壁；步驟三雙酶酶解黑海參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯こ酸去除雙酶酶解液中的蛋白質；步驟五用こ醇沉淀黑海參糖胺聚糖；步驟六干燥黑海參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化黑海參糖胺聚糖；步驟八干燥黑海參糖胺聚糖精糖。
2.根據權利要求1所述的ー種黑海參糖胺聚糖的提取方法，其特征在于所述步驟七中凝膠柱純化的具體步驟為將40g葡聚糖凝膠用3倍體積的雙蒸水浸泡過夜，脫氣后裝柱，用2倍柱床體積的緩沖液平衡；將30mg糖胺聚糖粗糖用IOmL緩沖液在40 60°C下溶解上柱，用蒸餾水洗脫，流速采用10mL/h，以3mL/管收集；用阿利新藍比色法檢測各管總糖胺聚糖的含量，收集有洗脫峰部分的樣液，透析脫鹽后，旋轉蒸發器濃縮。
3.根據權利要求2所述的ー種黑海參糖胺聚糖的提取方法，其特征在于所述緩沖液采用 0. 5mol/L 的 NaAC/HAC,其 pH 為 6. 0 6. 5。
全文摘要
本發明屬于生物技術天然活性物質提取領域，具體涉及一種黑海參糖胺聚糖的提取方法。其包括下列步驟步驟一黑海參欲處理；步驟二堿解黑海參體壁；步驟三雙酶酶解黑海參體壁；步驟四酶解完畢后，用三氯乙酸去除雙酶酶解液中的蛋白質；步驟五用乙醇沉淀黑海參糖胺聚糖；步驟六干燥黑海參糖胺聚糖粗糖；步驟七依次用纖維素離子交換柱層析法和凝膠柱純化黑海參糖胺聚糖；步驟八干燥黑海參糖胺聚糖精糖。本發明能夠平衡黑海參糖胺聚糖得率與純度的關系，提高黑海參糖胺聚糖的純度。
文檔編號C08B37/00GK103030707SQ20121058597
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月30日 優先權日2012年12月30日
發明者辛永寧, 林中華, 宣世英, 姜相君, 姜曼, 李雪潔 申請人:青島市市立醫院