便攜式熒光檢測系統和微測定盒

背景技術：
領域本發明通常涉及用于在微測定盒(microassaycartridge)中執行的診斷測定中使用的緊湊型熒光檢測儀器，該緊湊型熒光檢測儀器具有光學系統、熱系統、機械系統和氣動液壓系統。相關技術的描述盡管使用熒光團作為探針用于體外診斷測定的好處是公知的，但是用于這種測定的最常用的設備形式是很大的、使用復雜的、相對較慢的并且依賴昂貴的共焦光學器件。這些屬性使得很多設備不適用于在遠程場所和在護理點現場進行的全集成“采樣-應答”測試，其中要求這種設備是堅固的、快速的、緊湊的、便宜的并且易于使用的。盡管許多年前首次提出了在微流體盒中的自動化核酸擴增(參見Wilding：美國專利5304487和5635358)，但是在受控實驗室條件外部的熒光測定目標的檢測仍然由于缺乏便攜式和穩定的設備而受到阻礙。自它們的開始二十年以來，由于這些問題以及其它未解決的問題，在缺乏先進實驗室設施的情況下分子診斷仍然相對罕見。需要設計為在專門的實驗室設施外部操作的獨立測定系統，以促進對分子診斷更寬闊的通路。由于核酸測定提供較高靈敏度和特異性兩者，因此核酸測定正迅速地成為用于檢測許多不同疾病類型(包括傳染性疾病)的“黃金標準”。這種測定已經證明對于大量病理狀況有高度特異性并且對于跟蹤如對流行病學很重要的特定疾病的遺傳品系很有用，例如在將H5N1禽流行性感冒與其它類型的流行性感冒A或者B區別開時、在確定特定病原體目標是否具有耐藥菌株時以及在檢測腸隔離的產毒菌株(諸如E.coliO157:H7)時。基于熒光的測定還已經表明對通常監控諸如糖尿病、心臟病、凝血病、免疫測定的狀況有用，以及對檢測例如食物或者藥物產品中的內毒素有用。在健康護理的途徑受限并且許多傳染性疾病是地方病以及健康和壽命預期差的發展中國家中的大量遠程健康診所尤其需要改進的設備。在典型熒光測定系統中，熒光探針或者熒光團吸收具有一種波長或者波長范圍的光并且被激發；并且熒光團隨后發出熒光信號。熒光團的活動性或者不活動性指示測定結果。發射信號具有通常比激發光長(但是如在“上轉換熒光團”中可能較短)的波長或者波長范圍。分色光束分離器或者帶通濾光片或者它們的組合隨后用于將熒光信號與其它光分開，并且信號被傳遞至傳感器。傳感器通常是光電二極管，并且生成可以用于對測定進行評分的電信號。使用實時或者端點熒光測定法的定性和定量測定是可行的。在這種系統中，液體試樣經由微流體通道運送到微流體盒的檢測室或者通道中，在該微流體盒中，與試樣混合的或者試樣本來的熒光探針由激發源激發。控制可以在測定通道中并行運行或者多路復用。對發出的光進行測量以確定目標存在或者不存在。可以將多個檢測通道布置在微流體盒的檢測區域中。測定包括進行一個或者多個熒光測量；熒光團可以用作在擴增步驟中形成的核酸擴增子的標記，或者更一般地用于熒光測定目標的存在或者不存在的標記。用于測定評分和驗證的實時熒光測定法、FRET、qPCR、熱解鏈曲線(thermalmeltcurve)、動力學和速率端點在本領域中也是已知的。已知的熒光檢測器典型地采用相對較貴的光學部件(諸如，共焦光學器件、激光器和非球面透鏡)以拾取并且定位微流體盒或者微陣列內存在的熒光發射。例如，Juncosa的WO98/049543教導了單個光具組中的三個分色光束分離器，一個用于控制激發源電力以及另一個用于控制反射信號；第三分色光束分離器用于辨別探針特異性的熒光發射。一個或者多個透鏡用來將激發束聚焦在試樣上。Juncosa還教導使用共焦顯微鏡的光電倍增管和光學物鏡部件的入口處的孔徑，用于控制具有大約五十微米的“微位置”的分辨率的成像束。“優選地通過使用孔徑，通過將照射的范圍限制至給定微位置的區域或者其部分，結合將檢測器的視場限制至照射區，可以實現信噪比的顯著改善。”[第七頁,第10-15行]。這些教導由Minsky的US3013467、Tsien的美國專利5296703、Dixon的5192980、Stern的5631734、Kambara的5730850預言，并且在Maher的美國專利6614030和Shams的6731781以及其它專利中重述。Maher使用激光器、光纖、石英片和具有微型共焦光學系統的非球面透鏡來優化在微流體室的中心處十微米大小的斑點處的聚焦和發射。類似地，在US6635487中，Lee證實了將激發束的錐形聚焦在試樣的平面上“提供最大強度以強化對測定芯片的分析檢測測量”。因此，該教導概括了現有技術。在較近期提交的Kim的美國專利申請2008/0297792中教導由物鏡將充當用于微流體芯片中的熒光檢測的光源的LED的圖像投射到試樣上作為“光斑”。光斑聚焦在微流體芯片中的室中的流體深度的中間處。由試樣發出的熒光被物鏡盡可能接近地準直為平行射線并且聚焦在雪崩光電二極管上。眾所周知，由于阻帶將針對沒有以45°角進入鏡的光射線移位，因此高精度對準的要求與分色鏡有關。因此，Kim的教導反映了一般公認的現有技術。在Gruler的PCT公開WO2008/101732中，描述了用于在單個光路中多路復用多個激發和檢測波長的熒光檢測器頭，陳述了“共焦測量意味著照射光學器件或者源的聚焦分別在本質上與檢測光學器件或者傳感器的聚焦分別相同”。Gruler接著陳述，“[本發明的]共焦光學器件...保證共焦設計的最高信號和最低背景本征特征”，即，根據Gruler所說，用共焦光學器件獲得最高可能信號和最低噪聲。盡管現有技術的一致教導起于用于表面熒光顯微術的共焦光學器件的專門使用，但是教導已經廣泛地并且不加鑒別地應用于微流體、橫向流動、毛細管電泳和微陣列應用。然而，我們已經發現該方法不太適合于需要在充滿流體的通道中檢測一個或者多個分子探針的液相微流體診斷測定。由于諸如光淬滅、熱對流和充滿流體的通道中偶爾存在的氣泡或者梯度的效應，在試樣室的平面中共定位激發束和發射錐體的焦點會導致結果中的不可接受的不穩定性、信號丟失、淬滅、噪聲、非再現性和總靈敏度損失。由于PCR的較高溫度，例如，試劑和試樣的釋氣(outgassing)不是罕見問題，并且來自液體試樣中夾帶的氣泡的干擾是常見問題。常規方法還需要更昂貴的光學部件并且因此不利于先進的臨床實驗室以外的廣泛應用。第二個問題是測定驗證。例如，用于驗證通過PCR的傳染性疾病測定的現行標準已經開始依賴加入標準的核酸模板的使用，或者更優選地內源性正常菌叢(例如，懷疑有諸如傷寒沙門氏菌或者大腸桿菌O157的大便中普遍存在的非病原大腸桿菌)的共同檢測。另一個普遍存在的內源性模板是與較高質量的呼吸和血液樣本相關聯的人18SrRNA。內源性模板的共擴增和檢測確保測定結果的信任度，但是由于用作標記的熒光團之間的可能的串擾而在實踐中難以實現。在使用高增益擴增時，通常選擇用于多路復用PCR的激發和發射熒光團的光譜中一定程度的交叉是典型并且期望的。因此，將通過在具有用于下游處理的共享低噪聲電子設備的掃描檢測器頭內使用分開的光學通道隔離具有光譜重疊的肩峰的熒光信號的解決方案將是本領域中技術進步的益處。第三個問題是便攜性。由于避免了因共享的試劑儲存器和共享的流體接觸表面的交叉污染，因此一次性盒的使用證明是有益的。然而，配置用于容納一次性盒的精密光學儀器平臺是有問題的。問題包括影響盒對準和檢測器頭定位的機械公差的不精確性和疊加、對在儀器中的加熱源與塑料的一次性盒之間形成高傳導熱界面的需要、對裝置上的控制伺服器與盒上的微型閥之間的氣動接口進行密封的需要，以及微流體盒中可用的必定較短的光路(典型地大約或者小于1毫米)，該較短光路在不優化的情況下會導致靈敏度的損失。這些連鎖問題的同步解決方案僅由廣泛的實驗和開發實現，最常由以該高度不可預測的技術反復試驗引導。因此，在本領域中需要很多改進，這些改進的元素是此處本公開的主題。

技術實現要素：
本發明在本發明的第一方面中，通過提供在加熱塊上形成的反光鏡面，該反光鏡面與包括液體試樣的檢測通道或者室的下側上的熱光學窗口接觸地接口，解決了在液體試樣中存在氣泡以及其它干擾不均勻性的情況下可靠和靈敏檢測微流體盒中的熒光探針、標簽、熒光團和分析物的問題。反射鏡面在加熱塊的頂表面上形成并且在使用期間接觸檢測室的下部光學窗口，避免在每個一次性盒底部上制造完整反射鏡的復雜度和花費，以及允許我們使用具有較低熱傳遞阻抗力和對于盒的熱光學窗口的透明光學特征的更薄、更順應性的薄膜。反射鏡面是光學上平坦的并且被拋光以提高熱傳遞和熒光發射捕獲。掃描物鏡定位在微流體盒頂部上的上部光學窗口之上。激發光在打到反射鏡并且反射回來之前透射通過上部光學窗口和下部熱光學窗口兩者。直接和反射的發射由物鏡收集并且集中在檢測傳感器(諸如光電二極管、光電池、光伏器件、CMOS或者CCD芯片)上。此外，并且與現有技術的教導完全相反地，熒光檢測的問題示出為通過配置光學器件使得激發光學器件與共同光路上的發射光學器件去耦來解決。在優選實施例中，通過反復試驗，當使用后反射鏡時，我們已經發現可以有利地在反光鏡的平面附近或者后面放置激發錐體的焦點并且獨立地定位發射錐體以使得發射優選地聚焦在檢測傳感器上。可選地，可以通過將會聚源束引導到物鏡上將激發錐體重新聚焦在近場中。令人驚訝地，去耦增大靈敏度，提高檢測極限，并且減小噪聲或者氣泡以及試樣中其它不均勻性的干擾。與現有技術的教導相反，我們發現激發和發射信號的常規共焦定位對于在試樣和工作條件的寬闊范圍內生成健壯信號不太有效。因此，在本發明的一個方面中，人們發現信號可以通過將激發光的焦點從試樣的平面位移至試樣后面的點來提高檢測的優化，這是供微流體熒光測定使用的低成本光學器件領域中的技術進步。激發和發射光學器件的去耦(即，對于激發光和發射信號的不同焦點)逆著專門用于形成共焦顯微術、熒光顯微鏡檢測和微流體熒光測定中的常規實踐基礎的原理(首先由Minsky在美國專利No.3013467中擁護)的幾十年的現有技術而發展。現有技術教導已經引導使用非球面透鏡、激光二極管和檢測光學器件與激發光學器件的精確齊焦對準。相反，如這里描述的激發錐體的去定位聚焦需要的光學器件意外地非常低成本并且不要求精密裝配或者維護，如對于制造低成本的便攜式儀器所期望的。檢測室下的加熱塊的頂表面上的反射鏡面用于通過提高物鏡的光收集能力來增大靈敏度。隨著將物鏡更靠近檢測室放置，限定角孔徑和數值孔徑的透鏡在收集發射中變得更高效。在沒有后反射鏡的情況下，現有技術的典型系統的收集效率小于2.5％(假定例如5mm的平凸透鏡)。添加后反射鏡可以使收集效率提高200％那么多，并且理論上可以提高400％那么多。并且將激發束聚焦在試樣室后面可以通過使用反射鏡增大激發路徑長度協作地添加至靈敏度的任何增益。我們已經發現這對低縱橫比的微流體盒尤其有利，其中盒的z軸上的光學路徑長度典型地為亞毫米長度，相對于標準光學試管顯著減小。愉快地，還發現該組合減少由于試樣室中的不規則(諸如小氣泡的存在)而產生的干擾。在一個實施例中，反射鏡是鋁加熱塊或者銅加熱塊上的鍍鉻的或者拋光的金屬表面，并且還用于針對溫度控制的測定來傳輸熱量或者冷氣，從而實現設計的另一個協同作用。在優選實施例中，反射鏡是光學平坦的鋁塊上的電拋光的鉻表面，選擇鋁是由于其優秀的熱傳遞特征和可縮放的熱慣性。塊由與塊的底座接觸的電阻加熱元件而被加熱。反射鏡面的平滑度和平坦度有助于最優熱傳遞。在本發明的該方面中，反射鏡面是例如用于對于PCR擴增子的熒光探針的FRET檢測或者熱解鏈分析的加熱元件的上表面。在一個實施例中，由構造通過在斜升測定流體的溫度時監控熒光而獲得的FRET解鏈曲線，來說明面向反射鏡的加熱塊的光學性質和熱性質的組合應用。在另一個實施例中，面向反射鏡的加熱塊用于在針對熒光發射掃描盒時調節或者控制微流體卡的檢測室中的反應溫度。供實時并且調制溫度的熒光測定中的微流體盒使用的面向反射鏡的加熱塊展示了本領域中的技術進步。根據本發明的另一方面，我們已經采用了通過使用緊密安裝在掃描頭中的下游信號處理固件加強的噪聲消除的高增益的多級放大器。人們發現激發光錐的非常高增益的放大和平面外去定位在優化測定辨別和靈敏度中是協作的(即使在存在打斷來自液體試樣后面的反射鏡面的鏡面反射的氣泡的情況下)，并且恰當地在不增加成本的情況下實現。整個光學路徑使用三個透鏡，第一透鏡用于準直來自光源的激發，第二透鏡用于將激發源投射到反射鏡上以及用于收集來自試樣中的任何熒光團的熒光發射作為準直的發射，以及第三透鏡用于將發射聚焦在檢測器上。每個熒光團由單獨的光學通道光學地隔離以用于測量。分色鏡、屏障濾光片和光譜特定的LED的組合用于實現每個光學通道中的近單色激發光。透鏡和相關光學部件(包括針對單獨激發和發射波長與光路交叉的分色鏡和濾光片)設置在安裝導軌的掃描頭中，該掃描頭跨越檢測室橫向地移動。為了最小化噪聲，頭還包括用于放大信號的所有電子部件和用于模擬和數字信號處理的板載嵌入式微處理器。即使在存在破壞數據獲取的信號平均和基線減法方法的氣泡泡沫干擾的情況下，可以通過轉換至單個比特輸出(即，1或者0)精確地評估和報告來自每個光學通道的測定掃描數據。已經發現這是用于當在一個或者多個檢測室上和跨越反射鏡面掃描檢測器頭時，對存在或者不存在來自液體試樣混合物中的特定熒光團的定性評分的簡單并且非常有效的手段。掃描頭和軌道配置有耦合至步進電機的驅動鏈以用于在掃描期間精確的空間分辨率。我們已經發現整個微流體盒對接艙和光具座以傾斜角安裝在儀器殼體中對在微流體盒上進行裝載、潤濕和混合操作期間減小氣泡夾帶和改善排氣是有利的。在優選實施例中，以大約15度的角度安裝整個光具座使得氣泡從微流體回路位移，使用于浮動光具座和對接艙整個懸架安裝和彈簧偏置的夾緊機構成為必需，以確保當盒裝載到儀器中時光具座組件底部上的對接艙中安裝的板載加熱元件與可插入盒之間的熱傳導界面的有效形成。還必須在對接期間建立成角度的盒與裝墊片的氣動接口端口之間的密封界面。可以跨越檢測室掃描檢測器頭，或者相反地，可以跨越檢測器掃描微流體盒。如這里實現的，檢測器安裝有在成雙的、成對導軌上的步進電機控制下的蝸輪或者齒條和小齒輪驅動臺階。可以通過使數據獲取與電機控制同步來根據需要掃描試樣；這可以使用與檢測器頭中的嵌入式微處理器通信的板載或者外部主機控制器來執行。令人驚訝地，盡管有許多潛在干擾，但是這種將集成的共同處理器安裝在線性運動臺階上以用于在運行中采樣、過濾和平均測量值的檢測器頭提高了系統確認和報告測定結果的能力。人們期望跨越試樣井(samplewell)、檢測室、檢測通道或者區域(其可以是一毫米到若干毫米的寬度)的熒光強度將有變化。例如，由于來自井厚度的差、來自光學窗口的不完美、來自小的溫度變化(例如，其可以引起當前檢測的擴增子的雜化相關的熒光的伴隨變化)和來自可能起因于除氣和混合的氣泡或者泡沫的混合中的不均勻性而出現這些變化。人們發現，可以通過在跨越檢測室的采樣橫斷面上進行信號數字化以使這些變化最小化。如將在下面進一步描述的，閾值可以用于辨別正測試結果和負測試結果。為了進一步地提供噪聲消除，通過以已知防止由AC線波動的干擾以及其它周圍電干擾或者RF干擾的頻率選通激發束，以去除外來噪聲，產生較干凈的信號調制，產生還可以進行過濾以去除泄露到儀器殼體中的任何周圍光的作用的調制信號。我們已經通過配置具有專用共同處理器的光學印刷電路板以及使用高效地最小化連接至主機儀器的數據總線上的流量的獨立時鐘頻率和固件實現了該結果。板載光學信號處理器具有存儲在駐留在光學卡上的EEPROM中的專用指令，并且在選擇為限制電磁干擾的頻率下使發送至源LED的脈沖與傳感器光電二極管的詢問同步。固件設計成評估激發光的選通照明猝發之間的信號與選通猝發之間的背景的差，并且通過該方法容易地減去由于周圍光或者外部光的任何背景。產生的光學模塊封裝在密封的檢測器殼體中并且可以擴展為具有多個光學通道一系列光學模塊，用于同時掃描多個試樣或者串聯或者并聯的熒光團。信號處理路由至嵌入在檢測器頭中的自主的共同處理器，并且從那兒路由至主機儀器控制器。因此，本發明包括單頭/單通道實施例、雙頭/雙通道實施例以及多頭/多通道實施例，并且可以在單個試樣或者多個并聯試樣上執行單個和多路復用的測定。通常，測定系統包括能夠用于跨越試樣掃描檢測器頭的機械系統，檢測器頭容納至少一個檢測通道，以及更優選地多個檢測通道，每個檢測通道包括物鏡和配置為捕獲和放大由物鏡接收的光學信號的光電子電路元件，其中機械系統由檢測器頭外部的電路和控制器操作，以及光電子元件在駐留在與嵌入在所述檢測器頭內的微處理器相關聯的固件中的自主守護進程的控制下。有利地，分離所有部件都緊密鄰近的屏蔽的檢測器頭內的光學信號獲取和處理，實現了用于具有可忽略信號噪聲的多級放大的系統，該信號噪聲將以其它方式與檢測器頭外部的主機儀器中發生的模擬功能相關聯。在主機儀器中，光電子電路元件與任何外部電路電子隔離地操作；包括配置用于在自主守護進程控制下進行信號處理和/或信號數字化的光電子元件。我們相信這是本領域的進步。人們發現當檢測器容納為雙頭和多頭檢測器時運行地很好，其中單個殼體中的兩個或更多個通道配置有完全獨立的光學器件、特定于熒光團的濾波器、分色鏡和源LED，減小多個熒光團之間的串擾。因此，頭將可選地將包括安裝在第一電路板上的多個光源和安裝在第二電路板上的多個物鏡以及關聯檢測器，并且將獨立地使用共享的信號處理能力和檢測器頭中嵌入的固件針對多個熒光團中的每一個收集信號。為了減少噪聲，不從檢測器頭向主機儀器傳輸模擬信號。以這種方法，用于每個通道中的激發的光源可以與個體熒光團匹配。不再需要提供白光和激發濾光片以確保打到試樣的窄帶通激發光束。該簡化證明對要求成對采集“biplex”或者多路復用的目標信號和對照信號的測定協議有用。其中，關于FDACLIA棄權要求，將目標模板和對照模板兩者放大，在可以報告或者宣布關于測試試樣的測定結果之前必須存在正對照信號。在沒有可檢測對照信號的情況下，檢測的任何目標信號都不是有效結果。為了滿足CLIA棄權要求，需要熒光檢測器不僅能夠檢測例如由PCR擴增的目標傳染性有機體的存在，而且還能夠檢測與目標共存并且由例如相同PCR反應或者儀器中并行進行的PCR反應擴增的內源性人為對照有機體的存在。這種方法優選地要求熒光檢測器具有將目標和對照熒光團的存在確定為共同檢測室中的“biplex”(“雙鏈體”)擴增反應混合物的能力。典型地使用具有熒光激發和發射光譜的正擴增對照熒光團，該熒光激發和發射光譜被移位為由選擇性帶通濾波器從針對目標熒光團的熒光激發和發射光譜很好地分辨(按照波長)(例如參見圖25)。然而，根據本發明，證明可以通過使用雙頭檢測器以及通過連續地掃描每個檢測室兩次(每個光學通道一次)實現優秀的分辨率，首先檢測對照熒光特征，然后檢測測試試樣熒光特征-每個掃描途徑利用如上所述單獨的激發和發射光學器件。通過用完全分隔的并且獨立的光路配置這些檢測器發現了好處。在本發明的該方面中，使用雙鏈體頭設計確保試樣中擴增對照熒光團的存在不會由于“串擾”而在目標通道中無意中地產生信號。這種情況將產生分類為“假陽性”的試樣。相反地，從目標通道到對照信道沒有串擾也很重要，這在多個信號共享共同的光路時是可能的。這種情況可以導致正擴增對照被無意中地認為存在(當這可能不是該情況時)，以及將導致報告無效測定，不可接受的結果。通過利用熒光素或者等效的熒光團作為用于目標的分子探針，以及利用得克薩斯紅或者等效的熒光團作為用于對照的分子探針來例示這些原理。人們發現，一個檢測通道優化用于檢測熒光素以及另一個檢測通道優化用于得克薩斯紅的雙頭檢測器驚人地靈敏、精確和健壯，兩個檢測通道各自具有單獨的激發和檢測光學器件。移動檢測器頭以將每個光學通道依次定位在試樣上并且進行單獨的熒光讀取。令人驚訝地，這提高了分辨率和最小化了串擾，但由于移動檢測器頭的機械學而沒有促進更高的噪聲或者靈敏度損失。由于沒有用白光進行激發，而是以對個體熒光團特定的波長作為替代進行激發，因此第二熒光團的淬滅不是問題。在本發明的另一個方面中，我們已經發現，可以通過跨越多個試樣井順序橫越多頭檢測器以掃描多個微流體通道，每個頭配置有用于單個熒光團激發和發射的獨立光學器件。盡管針對每個光學通道將激發和檢測光學器件分開，但是在檢測器頭內共享的電路中執行信號處理。檢測器頭在外部控制器的控制下執行掃描，同時檢測器頭中的守護進程自主地構造掃描期間遇到的試樣井的圖，該圖具有根據相對于至少一個參考點的位置表示信號強度的數據對。在一個實例中，參考點是由檢測器頭獲得的限定掃描路徑上的空間坐標，其中參考點與所述盒主體的對齊特性相關聯，并且可以與觸發例如機械、電氣或者光學開關的特性相關聯。通過與井壁或者邊緣或者標識井邊緣的其它基準點相關聯的光學信號強度的變化檢測試樣井。在一些實例中，參考點作為第一井的第一邊緣，以及圖包括關于從井中的每一個的第一邊緣到第二邊緣的寬度的信息，使得當引入液體時，針對每個圖點的背景掃描可以從與試樣相關聯的任何光學信號減去。因此，在又另一個實施例中，本發明對于即時檢測的分子診斷測定提供健壯的多頭獨立通道熒光檢測系統，該檢測系統具有向共同存在于共同或者并行檢測室中的目標和核酸擴增對照兩者的存在引導的高度特異性。較干凈的信號允許較高增益電子擴增而沒有信噪比的對應降低。本發明中的第一實施例實現了具有超過兩個通道的熒光檢測系統，例如用以檢測單個檢測室中混合的目標和對照，以及具有多個測定通道以用于檢測多個目標。可選地，可以并排、在陣列中或者徑向地(如以圓柱形)定位該頭。使用獨立光學路徑意外地導致對透鏡、分色光束分離器以及關聯濾光片元件的組裝精度需要的減小，提高裝置的可制造性。本發明實施例包括便宜的非精密光學器件、塑料透鏡、試樣窗口后面的加熱塊上的反射鏡、可移動臺階元件、選通的激發和發射、噪聲抑制、可移動檢測區域上的板載連續信號處理以及超過一個光學通道用于通過利用成對目標和對照熒光團進行biplex測定驗證。盡管儀器有高放大增益，但是儀器已經證明有利地抵抗諸如檢測室中的電噪聲和氣泡的干擾。附圖說明圖1是本發明的儀器和對接艙中的微流體盒的透視圖。圖2是示出了在對接艙中插入微流體盒的動畫視圖。圖3是提供裝置的功能單元、軟件和固件的概述的框圖。圖4A是具有對接艙、光具座和夾緊機構的浮動平臺的簡化表示，該浮動平臺用于使微流體盒與加熱器模塊熱接觸并且掃描微流體盒。圖4B在概念上展示了浮動平臺、對接艙、光具座和微流體盒以相對于地平面的限定角“theta”安裝在儀器底架中，其中地平面是水平的。圖5A和5B是從上面和下面示出了具有對接艙、光具座和掃描檢測器頭的懸浮安裝的平臺的前內部透視圖和后內部透視圖。圖6A是從對接艙下面示出了下側加熱器模塊和冷卻扇的前內部透視圖。圖6B是具有加熱塊元件和鏡面的加熱器模塊的細節圖。圖7A和7B是在對接艙適當位置中具有可插入盒的浮動平臺的透視圖。為了清楚起見，已經去除了對接鞍和附屬安裝元件。圖8是對接艙和從對接鞍的下側懸浮的浮動平臺的細節圖。浮動平臺安裝有四點彈簧懸掛。圖9A和9B是夾緊機構的前部子組件的視圖。圖9B圖示了夾緊齒條上的蝸桿驅動操作。圖10A和10B是夾緊機構的后部子組件的視圖。圖10B圖示了夾緊齒條和壓盤臂的蝸桿驅動操作。圖11A和11B是供本發明的檢測系統使用的可插入微測定盒的透視圖。圖12是示出了微測定盒的內部部件的分解圖。圖13A和13B是供本發明的檢測系統使用的可插入微測定盒的平面圖和立面圖。圖14A隔離具有內部氣動歧管、氣動接口多端口和加熱器模塊的安裝板；以及圖14B描繪了在使用時由微測定盒占據的位置。圖15是具有中央氣動入口端口陣列的微測定盒鼻端的分解圖。圖16是具有微測定盒的安裝板的平面圖，示出了通過氣動接口多端口的截面圖的位置。圖17是通過氣動接口多端口的橫截面視圖。圖18是具有微測定盒的安裝板的平面圖，示出了通過盒和加熱器模塊的截面圖的位置。圖19是通過加熱歧管和微測定盒的橫截面視圖。圖20以分解圖示出了加熱器模塊組件。圖21是施加在對接艙中的盒上的彈簧力的示意圖。圖22是裝置的部分組件，示出了具有在盒和加熱器模塊的鼻端引導的風扇出口的箱裝式鼓風機。圖23是具有用于激發和發射檢測的電子隔離電路板和雙光學通道的檢測器頭的透視圖。去除殼體的一半以觀察內部部件。圖24A和24B是具有雙光學通道、安裝加熱塊的鏡和微流體盒的熒光檢測器的內部光學部件的示意圖。激發光學器件安裝在一個電路板上以及檢測光學器件安裝在另一個電路板上以減少噪聲干擾。圖25A和25B示出了液體試樣中兩個熒光團的發射和激發波長，并且圖示了用于去除串擾的雙頭光學隔離。圖26A至圖26D是來自在具有對照和目標信號的測定條件下的檢測器頭的放大器的電子跡線的視圖。圖27是用于控制熒光激發以及接收、處理熒光發射信號和向主機儀器傳遞熒光發射信號的檢測器頭電子設備的框圖。圖28A和28B是示出了數字去除氣泡干擾的原始輸入和數字化輸出的表示。圖29A是激發錐和平凸物鏡相對于盒檢測室和面向鏡的加熱塊的表示。圖29B是在短工作距離處用平凸物鏡進行的發射采集相對于盒檢測室和面向鏡的加熱塊的表示。示出了原熒光發射和反射的熒光發射。圖30是具有去耦的激發和發射光學器件的光學路徑的示意性表示，其中L1’＜L1以及源束是發散的。圖31是具有去耦的激發和發射光學器件的光學路徑的示意性表示，其中L1’＞L1以及源束是會聚的。圖32A繪制了表明通過改變鏡上方的物鏡高度來增強信號輸出的實驗結果的曲線。圖32B用圖表表示有和沒有后鏡的綜合輸出信號強度。人們發現如圖29A所示通過在鏡的后面的焦點處聚焦激發束以及如圖29B所示在較短的工作距離處采集發射以優化輸出信號。圖33A表明正測定結果和控制的嵌套熱解鏈曲線數據，示出了根據溫度由雜化到擴增子的分子信標產生的熒光。圖33B和33C分析熱解鏈輪廓，計算指示Tm的一階導數。具體實施方式盡管為了圖示的目的下列詳細說明包括具體細節，但是本領域技術人員將理解下列細節的許多變型和更改在所要求的發明范圍內。闡述下列定義以幫助解釋如所要求的本發明。定義此處“守護進程(Daemon)”指的是用于光學數據獲取和處理(ODAP)的可編程指令集，該可編程指令集存儲在由嵌入式微處理器執行的固件中作為自主后臺進程而不是在交互性用戶或者由主機控制器的直接控制下。守護進程可以被看作虛擬機，該虛擬機操作和控制與噪聲電子隔離并且定位在檢測器頭中的電子電路。在三級放大器中對來自與檢測光學器件相關聯的多個放大器的經調節的輸出進行調節和放大，并且選擇三個放大器輸出中的一個用于數字化，隨后進行信號處理和用定位數據制表。守護進程隨后將光學數據與后臺掃描進行比較并且在向主機系統報告數據以用于顯示給用戶之前，關于熒光是否是正測定結果做出復雜的確定。在操作期間，主機系統進行多任務處理以執行各種測定功能，諸如溫度和氣動控制、檢測器頭掃描、用戶界面可操作性以及故障監控，并且將與發射信號獲取和處理相關的任務委托給守護進程(此處稱為“ODAP守護進程”)。“孔徑角”-是能夠進入物鏡并且參與圖像形成的來自單個點的大多數發散射線之間的角。“后焦距”-對于具有進入透鏡的準直光的入射束的透鏡，定義為從透鏡的后表面到聚焦的光的錐體的焦點的距離L。“后焦點位置”指示可以通過使光學器件與透鏡的天然焦距去耦而將非準直射線聚焦在離開透鏡后面替代距離處。目標分析物：或者“感興趣的分析物”或者“目標分子”可以包括核酸、蛋白質、抗原、抗體、碳水化合物、細胞組分、脂質、受體配體、小分子(諸如藥物)等等。目標核酸包括基因、基因的部分、基因的調控序列、mRNA、rRNA、tRNA、siRNA、cDNA并且可以是單鏈的、雙鏈的或者三鏈的。一些核酸目標具有多態性、缺失和替代剪接序列。在單分子中可以存在多個目標域，例如免疫原可以包括多個抗原決定簇。抗體包括可變區、恒定區和Fc區，該Fc區具有固定抗體中的值。通常在制造時不為目標分析物提供盒，而是包括在要測定的液體試樣中。相反，典型地為“對照分析物”提供盒并且對其進行測定以確保測定的適當性能。如在本領域中公知的，包括目標測定的加入標準的試樣可以用于某個質量對照測試以及用于校準。用于擴增的裝置：原始技術是聚合酶鏈反應(稱為PCR)，在Ausubel等人的美國專利No.4,683,195、No.4,683,202和No.4,800,159中，JohnWiley和Sons，Baltimore，Md.(1989)的CurrentProtocolsinMolecularBiology以及Innis等人(“PCRProtocols”，AcademicPress,Inc.SanDiegoCalif，1990)，對該聚合酶鏈反應進行了詳細描述。聚合酶鏈反應方法需要熱循環并且在本領域中是公知的。簡單地說，在PCR中，制備兩個引物序列，該引物序列與目標序列的相對互補鏈上的區域互補。過量的脫氧核苷三磷酸與DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)一起添加至反應混合物。如果試樣中存在目標序列，則引物將粘合至目標并且聚合酶將通過添加在核苷酸上使引物沿著標記序列延伸。通過提高和降低反應混合物的溫度，延伸的引物將與模板分離以形成反應產物，過量的引物將粘合至模板和反應產物并且重復該過程。通過添加熒光嵌入劑，能夠實時地檢測PCR產物。其它擴增協議包括LAMP(DNA的環介導等溫擴增)逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、連接酶鏈反應(“LCR”)、基于轉錄的擴增系統(TAS)，包括基于核酸序列的擴增(NASBA)，還可以使用“滾環”、“RACE”和“單側PCR”(還稱為“不對稱PCR”)，具有過量合成與可檢測探針互補的鏈的優點。這些各種非PCR擴增協議在診斷測定中具有各種優點，但是PCR仍然是分子生物學實驗室和臨床診斷中的主力。這里公開的微流體PCR的實施例應當認為是能夠執行一種或者各種擴增協議的普通級微流體裝置的代表和示例。典型地，核酸擴增或者延伸包括使可以具有不同序列一個或者多個目標核酸與包括反應組分的“主混合物”混合，用于進行擴增反應和使該反應混合物處于允許目標核酸擴增的溫度條件下。主混合物中的反應組分可以包括調節反應混合物的pH的緩沖劑、提供合成核酸需要的能量和核苷酸的天然核苷酸中的一個或者多個(與A、C、G和T或者U相對應-通常以相等濃度存在)、粘合至模板以便于發起核酸合成的引物或者引物對，以及將核苷酸添加至正在合成的互補核酸鏈的聚合酶。然而，用于擴增的方式還包括使用修改的或者“非標準的”或者“非天然的”堿基(諸如在Prudent的美國專利7514212以及Marshall的美國專利7517651和7541147中描述的)以幫助檢測核酸目標。“用于檢測的裝置”：如此處使用的，指的是用于顯示端點(即，測定結果)的裝置，并且可以包括配備有分光光度計、熒光計、照度計、光電倍增管、光電二極管、濁度計、光子計數器、伏特計、安培計、pH計、電容傳感器、射頻發射器、磁阻計或者霍爾效應器件的儀器。蓋板中的放大透鏡、光學濾光片、有色流體和標記的探針可以用于改進測定結果的檢測和解釋。“標簽”或者“標志”包括但不限于，諸如發色團和熒光團的染料；以及如現有技術中已知的化學發光物。磁珠上裝飾的QDot(諸如涂敷有ZnS的CdSe)或者QDot和順磁性Fe3O4微粒的混合物是提高本發明的測定靈敏度的便利方法。還預期熒光淬滅檢測端點。與酶鏈免疫測定相關聯的各種基質和產物發色團也是本領域所公知，并且提供用于放大檢測信號的裝置以提高測定的靈敏度(例如“上轉換”熒光團)。熒光和光學檢測器可以包括光電二極管、光伏器件、光電晶體管、雪崩光電二極管、光敏電阻器、CMOS、CCD、CID(電荷注入器件)、光電倍增管和反向偏置的LED。檢測系統可選地是定性的、定量的或者半定量的。“分子信標(Molecularbeacon)”-是單鏈發夾形寡核苷酸探針，設計為報告溶液中特定核酸的存在。分子信標由四個組分組成；莖、發夾環、端部標記的熒光團和相對端部標記的淬滅劑。當發夾狀信標沒有粘合至目標時，熒光團和淬滅劑緊密地布置在一起并且抑制熒光。在互補目標核苷酸序列存在的情況下，信標的莖打開以與目標雜化。這使熒光團與淬滅劑分離，允許熒光團發熒光。替換地，分子信標還包括在端部標記的供體附近發光的熒光團。‘波長偏移的分子信標’包括使熒光團能夠更強烈地發光的另外的收獲熒光團。分子信標的當前評論包括WangK等人，2009，MolecularengineeringofDNA:molecularbeacons。AngewChemIntEdEngl，48(5):856-870；CissellKAetal，2009，ResonanceenergytransfermethodsofRNAdetection，AnalBioanalChem393(1):125-35和LiY等人，2008，MolecularBeacons：anoptimalmultifunctionalbiologicalprobe,BiochemBiophysResComm373(4):457-61。最新進步包括CadyNC，2009，QuantumdotmolecularbeaconsforDNAdetection。MethodsMolBiol554:367-79。熒光核酸測定包括通過標記的引物和基于探針的檢測化學物質的擴增。可以在測定結束時或者通過實時地測量擴增產物量來測定熒光產物。盡管并不是限制性的，但是TaqMan探針(AppliedBiosystems)(其依賴于具有3'淬滅劑構造的5'報告染料的位移和聚合酶介導的水解)、FRET雜交探針、基于低聚FRET的雙探針(Roche)、小溝粘合劑共軛雜化探針(MGB探針，AppliedBiosystems)、Eclipse探針、LockedNA探針(Exiqon/Roche)、Amplifluor引物化學物質、Scorpions引物化學物質、LUX引物、Qzyme引物、RT-PCR等等都適合于本發明。還可以使用嵌入染料。反轉錄酶用于分析RNA目標并且需要單獨的步驟以形成cDNA。最新進步包括KrasnoperovLN等人，2010，Luminescentprobesforultrasensitivedetectionofnucleicacids.BioconjugChem2010Jan19epub。除化學染料以外，探針包括綠色熒光蛋白質、量子點和納米點，它們都是發熒光的。可以用熒光團來標記諸如核酸和抗體的分子以及對測定目標具有親合性的其它分子，以形成對本發明的熒光測定有用的探針。“FRET”(熒光共振能量傳遞)-是使得能夠研究分子相互作用的熒光技術。它取決于當兩個分子在雜化時緊密鄰近時從一個熒光團到另一個熒光團(即，供體和淬滅劑)的能量轉移。最新進步包括CarmonaAK等人，[2009，Theuseoffluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)peptidesformeasurementofclinicallyimportantproteolyticenzymes，AnAcadBrasCienc81(3):381-92]。除非上下文另外要求，否則在整個說明書和隨后的權利要求中，單詞“包括”以及其變型應解釋為開放的、包括在內的含義，即，作為“包括但不限于”。在整個本說明書中，提及“一個實施例”、“實施例”、“一個方面”或者“方面”的意思是結合實施例或者方面描述的特定特征、結構或者特征可以包括在一個實施例中，但不必包括在本發明的所有實施例中。此外，這里公開的本發明的特征、結構或者特征可以在一個或者多個實施例中以任何合適的方式組合。“常規的”是指示本發明所涉及的在現有技術中已知的內容的術語。“大約”和“一般地”是不精密的擴展表達，說明意義上“差不多”的“或多或少”、“近似地”或者“幾乎”的情況，其中變化將是無意義的、明顯的或者等效的效用或者功能，并且還指示標準、規則或者限制以外明顯較小的存在。“串擾”-當試樣井中兩個或更多個熒光團的激發和/或發射光譜(和/或基質的自發熒光)重疊時，在熒光成像中出現串擾，使其難以單獨分離一個熒光團的活性。現在轉至附圖，圖1是在對接艙中具有微流體盒200的儀器100的透視圖。示出了薄膜面板104和觸摸屏顯示器表面108以及緊湊型底架或者殼體106。由于在微流體盒中提供所有試劑，因此儀器具有完全獨立的可操作性。圖2通過繪制微流體盒前部鼻端105插入到對接艙103中的動畫來補充該外視圖。如將在下面更詳細討論的，對接艙是懸浮安裝的并且相對于儀器底座成一定角度傾斜。圖3是提供測定裝置的功能單元、軟件和固件的概述的框圖。機械系統、氣動液壓系統、溫度控制系統、光學系統以及輸入/輸出(I/O)系統由兩個數字處理器協調，第一數字處理器稱為“主機控制器”，其接收用戶命令并輸出測定結果，并且還引導測定的機械、熱和氣動液壓過程步驟，以及第二數字處理器稱為“嵌入式微處理器”，其對光學系統施加局部控制，包括檢測器頭內的信號獲取和處理，并且向主機控制器傳遞數字數據。由嵌入式處理器控制的光學系統在檢測器頭內與裝置殼體內的有噪聲的模擬電路屏蔽開，允許在相對無聲的環境中進行高增益放大。每個處理器設置有單獨的時鐘、易失性存儲器和非易失性存儲器，并且相互自主地執行。作為概述，儀器內的浮動平臺(1000，虛線)支撐用于接收和可逆地夾緊微流體盒的對接艙(這里，1001)并且設置有掃描檢測器頭311。在主機控制器控制下跨越微流體盒的光學窗口掃描檢測器頭。檢測器頭包括用于提供激發光的子組件和用于在守護進程的控制下檢測、放大和處理熒光發射信號的傳感器，守護進程駐留在與嵌入式微處理器1841相關聯的固件中。浮動平臺跨置在安裝至固定基板和儀器架的彈簧懸架上。固定至固定基板并且定位用于與浮動平臺接口的有：具有在主機控制器1003控制下單獨可控制的加熱塊的加熱器模塊、連接至安裝在基板330上的氣動伺服器的氣動接口(還充當氣動分配岐管)、連接步進電機和主機控制器的線束以及用于夾具電機和相關傳感器的線束，包括用于測量夾具和微流體盒的位置的壓力開關、條形碼讀取器和溫度監控器。電力從安裝在儀器架中的可再充電電池或者通過到AC轉換器或者DC電源(諸如汽車)的直接連接分配至所有系統。主機控制器1003安裝在母板上，該母板還包括用于操作儀器的觸摸板面板和LCD顯示器面板。儀器可以經由各種數字串行I/O鏈路(包括無線網卡或者其它遠程通信器件)向外部網絡或者器件傳輸數據。為RAM寄存器的服務接入和編程提供專用數字中繼，其是在固態ROM中編碼的軟件。用于操作儀器的一般指令(諸如操作具有從液體試樣診斷特定疾病或者病理的能力的特定微測定卡需要的氣動脈沖和閥邏輯的序列)由與主機控制器相關聯的可編程軟件提供，該主機控制器配有易失性和非易失性存儲器以用于執行測定。如果例如，條形碼讀取器檢測特定微測定盒，則器件被編程為執行從該條形碼辨識的特定測定并且以指定格式解釋和顯示結果。然而，信號獲取光學器件的操作(包括源強度的調制、信號放大和濾波)在駐留在檢測器頭311內的傳感器PCB上的嵌入式微處理器1841中的守護進程的控制下。因此，對噪聲有高靈敏度的電信號在檢測器頭中與主機儀器的較嘈雜的環境屏蔽開，并且完全避免了從檢測器頭到主機A/D轉換器的模擬信號的傳輸。該非常規的功能分離已經很好地證明在減小儀器對噪聲的敏感性中非常有利，如完全的便攜性和室外操作所需要的，并且出乎意料地允許使用高增益三級放大器，在該高增益三級放大器中將預期為有嘈雜的電子環境。機械系統具有板載光具座和對接艙的浮動平臺是儀器的區別性特征。在圖4中對該特征從概念上進行了介紹。圖4A是儀器的主要光熱機械子系統的概念性表示。浮動平臺300由托盤狀的底架301(虛線框)組成，該底架301由安裝四點彈簧的懸架懸在傾斜平面上(由302、303指示)并且支撐對接艙103用于容納微流體盒200。在浮動平臺300上還支撐有安裝在成對導軌(308、309)上的掃描檢測器頭311。盒不是儀器100的部分，而是在插入到浮動對接艙103中之后與儀器進行接口。在操作期間，浮動平臺夾緊(由320指示)抵靠在安裝板(330)上并且接合加熱器模塊340的區域加熱塊(341、342、343、344)以及關聯電阻加熱元件和電路的接觸表面。在冷卻期間提供風扇345以消散過多的熱量。傾斜的安裝板還設置有氣動接口端口350，用于密封地對接至微流體盒的底座。通過氣動接口端口從嵌入傾斜安裝板330中的整體氣動分配“歧管”或者系統向盒傳送氣動壓力。氣動歧管供應來自安裝在傾斜安裝板上的源的負壓力和正壓力。安裝母板的、可編程主機控制器通過基板330中的內部歧管和氣動接口端口350將氣動驅動壓力、真空和控制脈沖引導至盒上的泵和閥。檢測器頭311是機動化的并且在主機控制器的控制下執行盒的掃描。為了沿著成對導軌(308、309)掃描檢測器頭，主機控制器接合由步進電機307驅動的蝸輪。檢測器頭安裝有具有物鏡315的外窗，該物鏡315掃描微流體盒的前部鼻端中的光學窗口并且采集原始光學信號。檢測器頭311具有它自己的嵌入式微處理器1841，該嵌入式微處理器1841具有駐留的守護進程，其獨立于用于光學信號獲取的主機控制器起作用。主機控制器還調節加熱器模塊340的加熱元件(341、342、343、344)的溫度，并且控制一組螺線管閥和正壓力以及鏈接到氣動接口的真空泵儲存器。儀器配有用于用戶交互的顯示器面板和觸摸面板。電力輸入是靈活的，并且可選地由AC適配器、汽車適配器或者從安裝在儀器下方的可再充電電池供應。還包括可選的無線IO和數字IO端口。圖4B在概念上示出浮動平臺301、對接艙103、檢測器頭311和微流體盒200可以以相對于地平面的限定角安裝在儀器底架106中。使盒與地平面成一定角度傾斜改善流體裝載期間的排氣并且最小化潤濕和混合操作期間的空氣夾帶。由這里公開的該創新和其它創新避免了干擾測定結果的光學詢問(interrogation)和熱傳遞的氣泡累積。傾斜的安裝板330建立浮動平臺301、盒200以及夾緊機械部件800和光學掃描310子組件的角。我們發現氣泡累積干擾核酸擴增，并且氣泡累積受平臺的角度量限制。已經發現該角“theta”在與地平面10-45度范圍內有利，更優選地10-20度，以及最優選地大約15度。如圖4B所示，檢測器頭311包括具有匹配的半殼(312、313)的蛤殼狀(clamshell)殼體。檢測器頭在橫向導軌308和309上滑動并且在具有蝸桿驅動器的步進電機307的主控制下。浮動平臺底架301彈性地安裝在四點懸架中，并且直到夾緊才與傾斜安裝板330有直接連接。夾緊機構在這里由箭頭320象征性地指示并且將在下面更詳細地討論。兩個掃描導軌308中的一個在該視圖中容易看到，并且由浮動平臺底架或者托盤301支撐在任一端部處。對接艙由虛線框(103)指示，并且標記用于將微流體盒的鼻端插入檢測器頭311下方的開口，該檢測器頭使得能夠如圖所示(雙箭頭)從一側到另一側進行掃描。這里作為對接艙下方的升高平臺示出的氣動接口端口350阻擋了緊靠對接艙下方并且與對接艙對齊設置的加熱器模塊340和加熱塊341-344的視圖。電力調節、AC適配器和電池存儲功能安裝在儀器架329下側上方的傾斜安裝板330下面，該儀器架329被設計成依靠在平坦表面上。圖5A和5B是從上方示出了懸掛安裝的平臺的前內部CAD視圖和后內部CAD視圖，該懸掛安裝的平臺具有有光具座和檢測器頭311的浮動底架301以及由微流體盒200占據的對接艙。浮動平臺從鞍型支撐、對接鞍400懸掛，該對接鞍400剛性地螺栓連接到傾斜安裝板330。如將在下面更詳細描述的，還示出了提供夾緊壓力的齒條401。在圖5B中，容易辨識光具座的步進電機307和導軌(308、309)。傾斜安裝板330組裝有泵、真空和壓力儲存罐、螺線管和氣動控制電路(為了清楚地呈現盒對接機構和掃描檢測器頭而沒有示出)。圖6A是從對接艙下面示出了下側加熱器模塊340和冷卻風扇345的前內部透視圖。如圖6B所示，能夠看出，在將微流體盒200插入到對接艙中時，加熱器模塊340被引入為與在對準銷510上并且停靠在臺階511上的盒的下側對準。加熱系統圖6B是具有加熱塊元件(“熱元件”341、342、343、344)和鏡面(500)的加熱器組件340的詳細圖。加熱器模塊的上面由一個或者多個加熱塊組成，它們中的每一個形成與微流體盒的下側上的限定區域的熱界面，用于適當操作在測定期間發生在盒的封閉通道和腔室中的生物化學反應或者分子生物反應。這些反應可以像免疫結合或者雜化一樣簡單，或者像耦合至煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和三磷酸腺苷或者級聯凝血因子的形成或者消耗的核酸擴增或酶脫氫作用一樣復雜，并且對于最優反應性和特異性通常要求相對嚴格的溫度控制。加熱塊(341、342、343、344，盡管本發明不限于該配置)可以是彈簧安裝的并且與夾緊機構的向下壓力相對地向上推動，以建立用于熱傳遞的高熱擴散率接觸區。每個加熱塊與電阻(Coulombic)加熱元件熱接觸，通常為了良好的導熱性借助于順應性熱襯墊。每個加熱塊接觸微流體盒中的熱窗口。每個窗口通常是一薄層柔性塑料膜，可以是小于3密耳厚，并且最常見的是順應性透明材料(諸如聚對苯二甲酸乙二醇酯)，盡管可選地為具有良好光學透明度的環狀聚烯烴或者聚酰亞胺，然而并不限定于此(參見共同轉讓的美國專利No.7416892)，并且還具有良好的導熱性。因此，在一個實施例中，本發明是用于在控制或者調制檢測室中的液體試樣的溫度時，反射透照微流體卡中的檢測室的熱光學界面。該特征對于在監控與分析物相關聯的光學信號的同時進行與分析物相關聯的一個或者多個反應有益。在一個示例性應用中，熱解鏈曲線用于驗證FRET雜化結果。還示出了風扇殼體345，該風扇殼體345用于消散來自加熱塊下面的散熱器的熱量，并且用作用于PID控制與電阻加熱電路(圖20)組合的塊中的溫度的附件。如將在下面描述的，第二風扇(圖22)用于冷卻測定盒的反應室。在這種情況下，通過用拋光的鉻鏡面500制造在上面上來修改加熱塊341，該鏡面500在測定期間與微流體卡200中的熱光學窗口接觸并且對準。在這種情況下，熱光學窗口與封裝在盒主體中的檢測室相對應。如將在下面更詳細討論的，鏡面將來自檢測器頭311的光(其掃描地對盒進行透照)反射回物鏡315中，并且將來自盒檢測室的任何熒光發射反射回檢測器頭中并且從檢測器頭到檢測傳感器(典型地為光電二極管)。在該示例中，加熱塊341不同于其它加熱塊，并且通常由鋁機械加工而成，然后拋光并且在施加鉻鏡面之前在鎳下面涂敷銅底層。電拋光和/或打磨可以用于在鉻表面上形成高反射光學光潔度。塊的光學平坦的上表面有助于熱傳遞并且提高熒光測定的靈敏度。恰巧地，如例如對光學測定解鏈曲線有用的，使用反射鏡允許對檢測室的流體內容物同時進行加熱和光學詢問。可以對其它加熱區類似地修改以允許同時進行溫度控制或者調制的光學監控。可以針對特定測定/盒要求修改或者改變加熱區和反射鏡的配置，并且不限于這里示出的配置。圖6B還示出了在這里具有十個出口的氣動接口端口350，每個出口獨立地端口連接至來自主儀器的氣動分配岐管的正壓力或者負壓力的源并且獨立地在可編程主控制器的控制下。這些出口與微流體卡的下側中的匹配入口接口并且密封，并且互通的氣動壓力的定時模式、真空和壓力脈沖通過氣動接口路由以驅動和控制盒中的測定。圖7A和7B是在對接艙103適當位置中具有可插入盒的浮動平臺子組件300的透視圖。為了清楚起見，已經去除了對接鞍400和附屬安裝元件。在圖7A中可以看出微流體盒200的下表面如何成形為與圖6B的加熱器模塊340的匹配上表面接觸。由兩個附接的橫向法蘭609和610將盒固定和支撐在浮動平臺301下，該兩個橫向法蘭螺栓連接在適當位置并且引導插入。夾緊機構在圖7B中，在浮動平臺300的前部部分上明顯可見形成四點懸架600的插入式元件的四個垂直柱(601、602、603、604)。這些柱配有螺旋彈簧(603a，在圖8中)并且插入到形成為對接鞍構件400的部分的圓柱形懸架殼體(605、606、607、608)中。懸架600用來懸掛浮動平臺300和如將在下一個附圖(圖8)中更詳細描述的光學掃描組件。整個光具座和對接艙子組件(圖7A和7B所示)浮在懸架上，并且僅在如將在圖9和圖10中描述的夾緊機構的向下動作時被剛性地引導為與儀器的剩余部分接觸。圖8是從對接鞍400的下側懸掛的具有檢測器頭311和對接艙103的浮動平臺300的分解圖。浮動平臺安裝有在四個支撐柱(601、602、603、604)中的每一個上具有螺旋彈簧(603a的復制)的四點彈簧懸架。每個柱容納在對接鞍的匹配的懸架殼體(605、606、607、608)中。盡管沒有示出微流體盒200，但是可以在該視圖中看出，對接艙配置用于在對接艙的突出緣515處容納盒的鼻端，使得盒停靠在較低的橫向法蘭(609、610)上。對準銷(616、617)確保對接艙在向下壓在加熱器模塊340上時準確地就坐。包括導軌(308、309)和用于熒光掃描的檢測器頭311的浮動平臺的后部部分除了在對接鞍處以外沒有任何支撐，并且在操作期間由對接鞍進行懸臂式支撐。導軌在支撐掃描檢測器頭311的運動中的作用在該視圖中是明顯可見的。對接鞍設置有支架712和713，用于附接如將在下面討論的夾緊機構800和如對自動化操作有用的條形碼讀取器。具有槽711的連接器臂710由如下面討論的夾緊齒輪機構和作為單個組件升高或者降低的浮動平臺300接合。連接器臂710操作地將盒壓在加熱塊上。圖9A是夾緊機構的正面視圖。可以看出對接鞍400的橋接形狀停靠在浮動對接艙103的前部鼻端515上。緊靠對接艙口下方的是在形成用于容納微流體盒200的通道的橫向法蘭609與610之間可見的氣動接口端口350。如上所述，在對接裝載的盒期間，夾緊機構的功能是將具有插入盒的浮動平臺和彈簧安裝的底架301向下推動到氣動接口端口和加熱器模塊上。對接鞍400螺栓連接在安裝板330，以及浮動平臺底架301懸掛在四點懸架600上。懸架彈簧對浮動平臺施加向下壓力，當該懸架彈簧在上升位置中時，該向下壓力受到夾緊組件800的懸掛動作的抵抗。然后，當夾緊盒時，夾緊齒輪件804由蝸輪801和蝸輪電機802驅動，以向下弧度驅動行進輪軸803。輪軸銷803a附接至凸輪塊(901，在圖9B中可見)。連接器臂(710，在圖8和10A中可見)在四點懸架上跟隨夾緊齒輪401和滑動器塊901的凸輪動作向上或者向下。當脫離盒時，動作是相反的。蝸輪電機802順時針方向運行，提高銷803a和凸輪塊901，從而舉起連接器臂710(其是平臺底架組件301的一部分)，然后反向(雙箭頭)。當平臺底架在最高靜止位置中時，可以從儀器移除微流體盒。機械基準或者對準銷用于在測定期間使盒在儀器對接艙中對齊。圖9B是具有齒輪梳804a和蝸桿驅動齒輪801的夾緊齒輪件804的前側的細節圖，還示出了齒輪構件的前邊緣上的凸輪跟隨器表面805和806，該凸輪跟隨器表面由壓力開關使用以監控齒輪的位置并且通過主機控制器致動協調的機械功能。為簡單起見，沒有示出壓力開關。輪軸810是夾緊齒輪件的旋轉中心并且繞銷810a旋轉。輪軸803在齒輪件旋轉期間行進，如下列附圖所示驅動與平臺底架接合的滑動器塊。圖10A和10B是示出了夾緊機構組件800的動作的機械附圖。夾緊齒輪驅動的凸輪的目的是提高和降低浮動平臺301。夾緊齒輪件804以固定輪軸810為軸心轉動，使得行進輪軸803向上或者向下劃出弧形，驅使連接器臂710垂直地向上或者向下(雙箭頭)。系留在銷803a上的滑動器塊901在連接器臂(710，參見圖8)中的槽711中從左到右滑動，以在提高或者降低浮動平臺300時調節夾緊齒輪的運動的橫向矢量。浮動平臺的向上移動受到如前述附圖所示的彈簧603a的抵抗。圖10B是夾緊齒輪件804和蝸桿驅動齒輪801的后側的細節圖，示出了中央輪軸810a和偏心凸輪塊輪軸803a和凸輪滑動器塊(901)。這里圖示的機構不是限制性的，在本發明的范圍內可以以替代方式實現，例如通過從底部向上夾緊而不是從頂部向下夾緊，或者通過磁性地夾緊而不是機械地夾緊。可以從螺旋彈簧、葉片彈簧、扭力彈簧、螺旋形彈簧和諸如氣動罐(例如氣壓彈簧)和彈性體材料的替代物或者在本領域中已知的其它等效工具中選擇其它彈簧工具。圖11A和11B是供本發明的裝置使用的可插入微測定盒1100的透視圖。這里示出的盒由具有內部工件的殼體1102和蓋板1103組成。端口1104用于容納液體試樣，以及前部鼻端1105用于插入到主機儀器的對接艙中。如圖13所示，盒殼體中的窗口1101是在試樣井1201上形成的光學窗口。墊片1106用于與主機儀器的氣動接口多端口350密封地接口。從下面示出了艙內回路卡(inboardcircuitcard)1200和艙外回路卡1204。氣動液壓系統圖12是示出了微測定盒1100的內部部件的分解圖。該特定盒1100設計用于具有FRET的PCR或者分子信標檢測。優選地，由本領域技術人員根據要滿足的特定要求和診斷應用來確定要采用的分析反應和盒設計的細節，并且僅為了圖示而提供下列詳細說明。通過入口端口1104添加試樣。殼體鼻端1105的鼻端上的光學窗口1101插入到主機儀器中并且對準，使得微測定艙內回路卡1200的FRET或者分子信標檢測室1201的窗口由檢測器頭掃描，該檢測器頭跟隨縱長地橫切光學窗口的線性路徑。在艙外卡1204上提供與試樣制備相關的額外的處理。所有液體試劑封裝在密封的可破裂小袋1206中并且必要時在氣動控制下進行分配。其它試劑以干燥形式提供在卡上。流體廢物隔離在吸附棉絮1207中，該吸附棉絮1207密封在塑料蓋板1103下方適當位置。盡管任何特定生物化學微測定或者分子微測定的細節都超出當前范圍，但是用于使核酸目標熱循環和擴增的具有內部微測定通道和井的微測定回路1200包括用于任何合成的擴增子的FRET檢測的檢測室1201。通過墊片1106中的10個端口引導的氣動供應流體地連接至卡1200和1204兩者中的回路。在卡1204中的初始試樣處理期間，對卡1200中的氣動元件進行致動，但由于卡是空的，因此沒有效果。然后，當處理的試樣轉移至卡1200用于分析時，對卡1204中的氣動元件進行致動，但由于不再需要該卡，因此沒有效果。意外的是，這實現了多路復用閥邏輯，而不需要額外的氣動端口來單獨地控制兩個卡1200、1204。發現十個端口對于大部分測定來說足夠并且與用于泵、閥和排氣口的單獨壓力(包括正壓力和負壓力兩者)各自地相關聯，而不需要在基板330中包括的外部氣動供應歧管中額外的復雜度和冗余度。圖13A和13B是供本發明的裝置使用的可插入微測定盒1100的平面圖和立面圖。示出了盒的前部鼻端1105上的光學窗口1101(鼻端插入到主機儀器中以及光學窗口由檢測器光學器件掃描)。還示出了用于將盒壓緊到加熱器組件340和裝有墊片的氣動控制接口端口350的壓盤表面1107。如圖所示的盒是在使用時插入主機儀器中的對接艙103中的一次性盒1100。盒殼體的橫向肋1110用于結構增強和幫助對接過程。圖14A是具有封閉的內部氣動歧管、加熱器模塊340和氣動接口多端口350的傾斜安裝板330的透視圖；圖14B描繪了當對接在主機儀器中時的微測定盒。在該視圖中，盒流體地接合到氣動控制接口多端口上并且與加熱器模塊340的四個區域加熱器熱接觸。壓盤表面1107上的壓力朝向熱界面和氣動接口推動盒。安裝板包括內部氣動控制歧管，該內部氣動控制歧管通過氣動接口多端口350向盒提供調節的氣動壓力。在完整的儀器中，安裝板330組裝有壓力調節器、蓄電池和用于控制卡氣動的螺線管。圖15是微測定盒1100的鼻端1105的分解圖，該鼻端包括光學窗口1101和艙內卡構件1200。嵌套的艙內回路卡1200和艙外回路卡1204共享共同的氣動控制接口(1111a、1111b)(這里與密封墊片1106對準)，并且通過經由通孔將輸入流體地連接至艙內流體回路和艙外流體回路兩者來共享端口。在這種情況下，艙外流體回路負責對試樣預處理；艙內回路容納預處理的試樣并且針對目標分析物對其進行分析。通過多路復用艙內卡與艙外卡之間的氣動接口中的氣動供應端口來實現減小的接口復雜度。氣動首先可以用于艙外電路中的流體操作，然后用于艙內電路中的流體操作，令人驚奇地解決了經濟地管理復雜電路的問題。更一般地，氣動接口陣列包括由通孔流體連接的多個氣動端口，該通孔將第一回路卡中的氣動回路流體地連接至第二回路卡中的氣動回路，使得多個氣動端口能夠接收根據可編程指令施加的多個氣動脈沖并且將那些氣動脈沖多路復用至第一回路卡和第二回路卡的流體回路元件，從而減少操作所述第一液壓回路和所述第二液壓回路需要的端口數量。例如，施加至第一通孔處的氣動接口的氣動脈沖通過流體連接迫使處理的液體試樣從艙外回路卡到艙內回路卡，諸如將在下面更詳細描述的，當第一卡設計為從試樣提取核酸以及第二卡設計為擴增和檢測分子目標時，這是有用的。凸臺(boss)1108具有狹窄的橫截面以限制艙內卡中不必要的熱傳遞，并且還用來向圍繞較大氣動隔膜構件的限定圓周傳遞壓縮載荷。銷接收孔1109a、1109b用于在將新盒裝載到主機儀器中時將對接艙103中的盒對準到銷510a、510b上。圖示的特定盒設計用于具有熱循環和FRET檢測的PCR。艙外卡1204旨在用于使核酸部分與試樣隔離。具有用于熱循環和擴增核酸目標的內部通道和室(1115、1116)的流體回路卡1200包括用于對任何合成的擴增子進行FRET檢測的試樣井1201。還描繪了用于cDNA合成的室1114。示出了三個平行測定通道。其它回路配置可以與本發明的微測定檢測系統一起使用，并且測定不限于三個通道或者通過PCR的核酸檢測。圖16是沒有微測定盒的安裝板330的平面圖，示出了通過氣動接口多端口350的截面圖的位置。還示出了用于接收盒和加熱器組件340的對準銷510。其它孔是打算用于安裝與延伸穿過安裝板的氣動歧管流體連通的氣動系統部件的端口，其可以由例如已經通過溶劑熔接熔合或者通過三維打印過程制成的層狀丙烯酸脂制成。圖17是通過在圖16中部分切口處的氣動控制接口350的截面圖，示出了用于接合通向艙內卡1200中的氣動通道的通孔(cf1120a，1120b)的端口。十個端口351通過通孔連接至氣動通道1121表示的封裝在安裝板330中的氣動歧管。還示出了用于使卡的氣動接口端口靠著卡氣動控制接口350就坐的盒對齊銷510a、510b。這里在塊輪廓中示出的卡1200具有內部氣動工件，該內部氣動工件響應于從氣動分配岐管330通過氣動接口多端口350施加的加壓氣體脈沖而工作。卡中的內部氣動工件包括在由主機控制器提供的閥邏輯的控制下可操作的閥樹、用于使流體移動通過回路的隔膜泵和用于在氣動控制下分配流體的流體儲存器。對多端口的需要涉及在卡上布局閥邏輯的方式和對多個壓力的需要。通常需要處于正壓力和負壓力兩者的氣動供應，并且已經發現若干中間壓力水平是有利的。盡管不限于此，已經發現有用的壓力包括用于操作泵的+10psig、用于打開閥的-5psig(諸如WOPubl.No.2002/081934中描述的隔膜閥)以及零壓力排氣口。如此處所示，可以與盒接合多至十個氣動互連。根據盒的復雜度，如果需要，可以通過對氣動接口進行調整大小或者重新配置使用更少或者更多的端口。分離微測定盒1100的氣動通道和氣動歧管350的對應端口的是硅橡膠墊片1106，或者是一般順應性的彈性體墊片，其在當盒裝載到儀器中并且施加彈簧壓力時在壓縮下密封氣動互連。墊片1106充當單次使用密封墊片并且有利地配有一次性盒，而不是按照傳統認知作為儀器的部分。通過包括具有一次性盒1100的墊片，獲得氣動接口處的較好和較干凈的密封，并且消除周期性替換墊片的需要。墊片通常由硅橡膠或者其它順應性材料制成。使用本發明的氣動回路，還可以通過在主機儀器中提供多個氣動源來多路復用回路，其中連接歧管350中的氣動供應回路可以從一個氣動壓力切換到另一個氣動壓力(諸如從正壓力切換到負壓力)而不需要額外的氣動回路。因此，可以在多個壓力狀態下操作基板350中的每個歧管子回路。以這種方法，可以通過共同的氣動接口端口陣列多路復用向可用較強的氣動壓力操作的回路元件進行的較強氣動“狀態”的分配和向可用較弱氣動壓力操作的回路元件進行的較弱氣動狀態的分配。類似地，可以通過共同的氣動接口端口陣列多路復用向可用較強的氣動壓力操作的回路元件進行的較強氣動“狀態”的分配和向可用真空壓力卡操作的回路元件進行的真空氣動狀態的分配。通過用共同氣動接口連接第一回路卡片和第二回路卡，實現氣動回路的雙重功能性。通常從一系列正壓力和負壓力中選擇壓力狀態，包括但不限于，-5psi、+10psi、+12psi、+15psi、+20psi、+7psi和0psi，例如，其中較高壓力用于破裂試劑包，以及負壓力用于打開閥等等。這些壓力可以由緩沖的壓力儲存器提供。還可以使用撥號可變壓力供應。在微處理器控制下通過歧管子回路向盒提供氣動狀態。每個測定由要根據使流體移動通過液壓回路所需要的氣動閥和泵邏輯來執行的一系列步驟組成。排氣口也是回路的必要部分以及根據每個單獨測定類型的要求，加壓、反向壓力和排氣都在儀器和關聯的微測定回路的能力內。圖18是在使用位置中具有疊加盒1100的安裝板330的平面圖(接觸微測定盒1100下側的氣動接口350和加熱器模塊340在盒下方)；示出了穿透盒和加熱器模塊的截面圖的位置。溫度控制系統圖19是截面中的加熱器模塊和盒1100的鼻端1105的視圖，引用圖18上標記的橫截面位置。為了標記，將盒提高到加熱塊341-344之上。氣動互連模塊350(指示了兩排端口)接合盒的一次性墊片1106，參照圖17和15對其進行了功能性描述。還示出了配置為接觸核酸擴增回路的單獨的室的四個電阻區域加熱塊(341、342、343、344)。成對的對齊銷510對準盒殼體，使得塊的熱表面適當地接合流體器件。臺階511支撐盒的鼻端1105。區域加熱塊341是熱光學界面，并且包括接觸流體回路構件的鏡面500。盒殼體中的光學窗口1101與鏡面對準，并且檢測器頭沿著軌道308、309(圖4)滑動，使得檢測器頭311的物鏡組件315沿著加熱塊341的長軸中間下行。回路中的檢測井定位為在熱塊和光學窗口下的鏡面上排列起來。對塊341進行溫度控制以用于FRET確定。在啟動測定之前將電阻加熱塊342調節至雙鏈核酸變性溫度，并且將塊343設定為退火溫度。退火塊343設置有冷卻片343a和鼓風機345，使得從變性室輸送的熱流體可以迅速地冷卻，從而加快熱循環時間的速度。如果需要，塊344用于cDNA合成。流體回路可以包括覆蓋加熱塊342和343的一對流體容室。成對的室包括如在美國專利No.7955836和No.7763453(其是共同轉讓的)中描述的可協作操作的氣動致動的隔膜，用于使如對通過熱循環進行的核酸擴增有用的變性溫度與退火溫度之間的流體流動往復。每個加熱塊是彈簧加載的并且壓靠在流體回路的下側。這里示出的彈簧是由于它們的緊湊性而選擇的金屬絲彈簧。圖20是加熱器模塊的分解圖。示出了四個加熱塊，每個塊與具有電阻加熱元件(347a)和居中定位的熱敏電阻器(347b)的印刷電路帶347相關聯，電阻加熱器在PID型反饋環路控制下。示意性地繪制了印刷電路上的支持電路并且該支持電路由主機控制器控制。每個塊浮動在彈簧支撐348上并且設置有順應性電連接，以在限制的垂直范圍中自由地移動。塊通過具有斷流凹槽的絕緣體護套346彼此隔熱。加熱塊夾到支撐安裝板349中形成的槽中。金屬絲彈簧348配置為用輕度的力向著卡1200的順應性塑料下表面推動塊，以減小用以熱傳遞的電阻。圖21是描繪負責盒與加熱塊之間的熱接觸的夾緊力和彈簧力的平衡的示意圖。如參照圖5至10所示，浮動平臺301的對接艙103安裝有4點懸架600，使得四個角柱(601、602、603、604)中的每一個上安裝的彈簧偏置為一旦盒已經就座則在盒上向下按壓。夾緊機構800是蝸輪驅動的并且相對于加熱器模塊中的臺階511和對齊銷510擠壓盒。每個加熱塊是通過每個塊下方的獨立彈簧構件相對于艙內回路卡的下表面向上推動的浮動構件。安裝在加熱器模塊中的金屬絲彈簧相對于墊片1106和艙內流體構件1200的下側向上按壓塊，以相對于氣動分配岐管330上安裝的多端口350密封卡氣動接口。以這種方法，盒由夾緊組件的較強懸架彈簧鎖定在適當位置，并且加熱塊通過加熱器模塊組件的較弱彈簧與艙內卡熱接觸，從而要求較小的制造精度。盒由兩個相反的彈簧力夾在對接艙中。橫向加強肋1110加固盒；確保艙內回路卡與加熱構件更順從地熱接觸。跨越加熱構件表面的向下彈簧懸架力是大約5psi以及向上彈簧力是大約1psi，彈簧協作地作用以夾緊盒和相對于打算加熱的艙內卡的下表面按壓加熱塊。為了圖示還示出了卡1200部件，包括cDNA井1114、退火井1115、變性井1116以及在光學窗口1101下對準的檢測井1201。同樣如圖21所示，在鄰接流體室的盒殼體的內部表面上形成凸臺1108。凸臺將彈簧加載力集中在流體隔膜元件周圍，其中需要壓縮以確保下層加熱塊與回路的流體內容物之間的低熱電阻。這些凸臺1108配置為低熱橫截面并且通過從殼體去除質量形成，其將以其它方式增大cDNA合成和熱循環室周圍的寄生熱消耗和熱電容。由于艙內流體構件懸浮在擴增回路上具有空氣間隙的盒殼體下方，因此還橫向地呈現低熱橫截面，從而減少區域加熱器之間的熱串擾和傳導熱損耗。加熱塊之間插入的絕緣護套346還用于將每個熱區域隔離和維持在正確溫度下，并且避免電阻加熱元件之間的對流熱串擾。包括試樣井的微測定盒的鼻端1105還形成為較薄以避免過多的熱質量。圖22所示的鼓風機360通過帶擋板的管道361引導到盒的鼻端上并且對FRET確定有用。在FRET中，分子信標在高于目標分析物種類的解鏈溫度的溫度下與檢測室中的單鏈擴增子混合。隨后在采集熒光發射時，使用強制的冷空氣降低溫度。鼓風機安裝在儀器底架的外墻359上。在一個說明性實施例中，隨著混合物冷卻，分子信標退火至目標序列，淬滅探針中的熒光。熒光的實時監控產生可以用于確認目標擴增子的身份的解鏈曲線。為了進行測試，使區域加熱器341達到高于目標種類的解鏈點的溫度，關斷加熱器以及接通鼓風機360并且將鼓風機360引導至光學窗口1101周圍和下面的盒的鼻端1105處。監控反應混合物和熒光中的溫度。當光學地監控熒光變化時，溫度響應于循環空氣而非常迅速地下降，允許重復要在每個試樣井上迅速進行的FRET確定。因此，在一個實施例中，本發明是用于進行FRET解鏈曲線確定的方法，包括a)將包括FRET探針和目標核酸序列的試樣室加熱至高于二重探針的解鏈溫度的溫度；b)關斷所述加熱；以及，c)使用具有自主ODAP守護進程的屏蔽的檢測器頭，當響應于通過打開風扇和將周圍空氣流引導到試樣室上(從而在監控熒光時迅速地冷卻所述試樣室)引起的試樣室的溫度變化，監控FRET探針的熒光變化時，跨越試樣室掃描檢測器頭。對根據溫度的熒光強度的導數的分析產生感興趣的擴增子的解鏈點特征。已經證明，可以使用本發明的盒的低熱質量在小于一分鐘內做出這些確定。如果需要，加熱塊341可以設置有冷卻片以及獨立地空氣冷卻，以加速測量，但通常這是不需要的。光學系統圖23是具有分別地用于對激發和發射進行檢測的電子隔離電路板(1301、1302)和兩個光學通道的雙通道檢測器頭1300的透視圖。在該視圖中，去除殼體1303的上半部以示出檢測器頭的內部部件。雙通道由物鏡(1310、1330)和光路A和B(標記為A和B的空心箭頭)標記。SMDLED激發光源(1311、1331)安裝在源LED印刷電路板(1301)上，該源LED印刷電路板通過邊緣型電阻銷連接器(1304)成直角連接至傳感器PCB(1302)。光電檢測部件安裝在傳感器PCB(1302)上。法拉第籠元件(1306)用于屏蔽光電二極管(1317)和(1337)以及周圍高增益放大電路。由表面安裝的LED(1331)在目標通道(箭頭A)中提供熒光激發，該LED被選擇為匹配目標熒光團的激發光譜。源LED(1331)發出發散光束，以及輻射的光束隨后由源激發透鏡(1332)準直。源透鏡(1332)是其平坦表面面向LED的平凸透鏡。準直的光束可以隨后穿過激發帶通濾光片(1333)，在與圖20相關聯的描述中對其目的進一步進行了解釋。準直的濾波的激發光束隨后從安裝在與入射束成四十五度角處的分色鏡元件或者分束器(1334)反射，并且穿過平凸物鏡(1330)以及通過檢測器殼體中的外窗(箭頭A)。在通過透鏡1330之后，激發光通過嵌入微測定盒中的檢測室(未示出，參見圖14-17)聚焦，該檢測室包括具有任何目標熒光團的試樣液體。通過在微測定盒后面使用后反射鏡使激發光通過試樣液體的路徑長度加倍。目標熒光團由入射光束激勵。通常以比激發波長長的波長發射熒光團，并且該熒光團的發射移位等于目標熒光團的斯托克斯(Stokes)位移的量。從檢測室中的目標熒光團返回的發射的一部分由平凸采樣透鏡1330采集并且在打到分色鏡1334之前準直。可選地，菲涅耳(Fresnel)透鏡可以用于進一步減小透鏡與試樣之間的工作距離，以優化發射光的采集，該發射光還由安裝在檢測室后面的加熱塊上的后反射鏡強化。由于二向色分光鏡1334具有激發波長與發射波長之間的波長截止，因此分色鏡1334現在充當用于發出的熒光光束的通帶光束分離器和用于激發光的阻帶濾光片。它在反射所反射的激發光和通過物鏡窗口進入光路的任何周圍光時透射發出的熒光。穿過二向色分光鏡1334的發射光隨后穿過發射濾光片1335，在與圖20相關聯的描述中對其目的進一步進行了解釋。離開發射濾光片1335的光隨后穿過平凸傳感器透鏡1336，其中該光聚焦到表面安裝至PCB1302并且由法拉第籠1306保護免受電噪聲的光電傳感器1337的表面上。在具有對照激發LED1311、平凸激發透鏡1312、激發濾光片1313、二向色分光鏡1314、物鏡1310、對照發射濾光片1315、平凸傳感器透鏡1316和對照光電二極管1317的第二(對照)通道中重復上面描述的光學路徑。來自兩個光電二極管的輸出由三級跨阻抗放大器放大，該三級跨阻抗放大器內置到緊挨著光電二極管的板中并且通過與放大器小心屏蔽的銷接地到傳感器PCB上的嵌入式微處理器。在一個實施例中，如通過利用熒光素和得克薩斯紅作為熒光團例示的，激發LED1331是具有用于傳送485±12nm的基本上單色的光的帶通激發濾光片1333的470nmLED，該470nmLED用于目標通道，以及具有帶通濾光片1313的590nmLED1311用于對照通道。對激發LED進行調制或者使用130Hz的選通速率選通為打開和關閉，以過濾50或者60Hz處和與熒光頂部照明相關聯的諧波頻率處的AC電力相關的噪聲，同時濾波與雜散周圍光相關的幻象(phantom)信號和可能存在于30或者60Hz處的電噪聲。局部反饋傳感器用于監控和穩定源LED輸出強度。熒光團發射的檢測監控與在由主機控制器控制的步進電機的供電下的檢測器頭軌道上的移動相協調。嵌入式微處理器和檢測器頭中的關聯電路設置有RAM存儲器、ROM存儲器、A-D轉換器、三級跨阻抗放大器以及用以處理這些功能的信號處理和命令序列固件。光電傳感器1317和1337中的每一個安裝在共同的PCB1302上。來自這些光電傳感器中的每一個的輸出信號分支直接連接到相應三級跨阻抗放大器(未示出)的前置放大器或者第一級。PCB1302廣泛利用硬件噪聲減小部件，尤其是嵌入式地平面和法拉第籠1306以最小化任何RF或者電磁干擾對輸入信號不必要的效應。通過法拉第籠、旁路電容器、信號調節前置放大器、單獨的接地層、金屬化的檢測器頭殼體或者它們的組合將放大器與電子噪聲屏蔽開，并且放大器與傳感器緊密地電氣鄰近。光學信號獲取、預調節、放大和數字化由屏蔽環境中操作的自主守護進程控制。這些硬件噪聲減小元件與在檢測頭中的局部控制下的光學數據獲取、數字化和處理方法的組合導致對不必要的噪聲的效應基本上免疫的檢測器設計。三級放大器可以配置為高達1014的增益，并且根據需要可選擇地配置為102、103、106、1010、或者1012的增益。我們已驚訝地發現將信號處理封裝在掃描頭中，通過最小化信號路徑長度并且允許在必要處(諸如圍繞傳感器二極管引線和在激發電路板與傳感器電路板之間的連接處)有效使用法拉第屏蔽實現了具有提高的信噪比和靈敏度的隔離的低噪聲環境。可選地，檢測器殼體可以由鋁制造或者涂敷導電聚合物并且接地以進一步使內部電子設備與不必要的干擾屏蔽開。有利地，在該環境中實現了較高的信號放大。圖24A和24B是熒光檢測器頭1300的內部光學部件的示意圖，示出了在微測定盒1402中具有光學窗口的外部光學界面以及在加熱塊1410的表面上的盒后面安裝的后反射鏡1400，該加熱塊1410用于控制或者斜升封裝在盒中的檢測室中的溫度。不依慣例地，盡管多個獨立光路或者“通道”在單個檢測頭中形成并且共享電子PCB和下游信號處理電路，但是激發光學器件安裝在一個電路板上以及檢測光學器件安裝在另一個電路板上以減少噪聲干擾。兩個板由銷連接1304安裝的轉角電耦合并且使用單獨接地層上安裝的旁路電容器電子地隔離。圖24A中示出了用于激發微測定盒1402內的檢測井或者試樣井(1403a或者1403b)中嵌入的熒光團的光躍遷(transition)。頭是掃描頭并且跨越微測定盒1402移動(雙箭頭)。來自PCB1301上的激發LED的光由透鏡1332準直并且由帶通濾光片1333使其基本上單色。通過由物鏡1330聚焦在試樣上的入射光1420激勵檢測井1403a中的任何一個或者多個熒光團(無論是對照熒光團還是目標熒光團)。在圖24B中，一個或者多個熒光團的發射由物鏡1330采集，并且在穿過二向色分光鏡1334、發射濾光片1335和傳感器透鏡1336之后透射到傳感器1337。傳感器1337與高增益晶體管的底座直接電接觸，該高增益晶體管放大輸出信號并且屏蔽在法拉第籠1306中。通常根據熒光團的斯托克斯位移以較長的波長發出熒光，使發射光能夠在沒有損耗的情況下穿過分色帶通反射鏡1334和發射帶通濾光片1335。鏡面1400用于增大目標上的發射光量、使激發路徑長度加倍以及提高發射采集效率。因此，從試樣室1403a返回到物鏡1330的光是發出和反射的熒光1421以及反射的激發光1420的混合物。提供光阱以捕獲雜散反射。反射光1420不通過分色鏡1334并且返回至源，并且不干擾傳感器1337處的發射強度的測量。單個通道的光學元件(包括激發源、源準直透鏡、激發濾光片、分色鏡、物鏡、激發濾光片、傳感器透鏡和具有放大器的檢測器)構成光學模塊，該光學模塊具有基本上單色源波長和用于按照目標(或者對照)熒光團的特定波長特征檢測熒光的高特異性傳感器。一個光學模塊或者通道可以用于測定目標，另一個模塊用于對照通道。串聯安裝的光學通道可以用于收集關于多個熒光團的數據，其中在傳輸至主機儀器之前通過在駐留守護進程的控制下的嵌入式微處理器對電氣處理進行多路復用。如圖所示，兩個通道中的每一個共享兩個電路板中的每一個上的電路，但是具有單獨的光學器件。可選地，可以通過復制所示光學元件的過程將額外的通道并入檢測器頭。微測定盒1402能夠相對于檢測器頭1300移動(雙箭頭)，并且檢測器頭或者盒托盤或者安裝底架的機動化允許掃描：例如，跨越盒1402的橫斷面允許在試樣室1403a和1403b上進行測量。通過使用并排安裝在檢測器頭中的多個檢測光學模塊，可以掃描試樣室以用于串聯的多個熒光團。根據一個實施例，激發電子設備安裝在印刷電路板(1301)上，以及檢測電子設備安裝在第二PCB(1302)上。邊緣連接器1304電連接電路板。法拉第籠1306保護傳感器和關聯的高增益放大器免受雜散電磁噪聲的影響。在加熱塊1410的上表面上制造反射鏡1400，其也起熱傳遞的作用并且在測定期間控制試樣流體的溫度。加熱塊1410的溫度可以在掃描期間斜升，例如如當在自主過程中由檢測頭中的嵌入式處理器獲取光學數據時，在主機控制器的控制下進行具有溫度和運動功能的FRET解鏈確定中。圖25A和25B示出了用于目標和對照的混合熒光團(在這里由熒光素和得克薩斯紅圖示)的典型系統的激發和發射光譜。如圖25A所示，曲線2001是針對熒光素的激發光譜(虛線)；曲線2002是發射光譜(實線)。如圖25B所示，曲線2003是針對得克薩斯紅的激發光譜(虛線)；曲線2004是對應的發射光譜(實線)。在這里，對照是通道B(圖25B)以及目標是通道A(圖25A)，但是分配是任意的。加框區域ExA指示允許穿過目標激發帶通濾光片1333的波長帶。框EmA指示允許穿過目標發射帶通濾光片1335的發射通帶。框ExB指示允許穿過對照激發帶通濾光片1313的波長帶。框EmB指示允許穿過對照發射帶通濾光片1315的發射通帶。框指示在最大值的任一側上存在阻帶。可以從圖25A和25B看出，考慮到針對這兩個熒光團和具有如圖所示配置的通帶特征的光學濾光片的光譜，校正下列誤差條件：a)來自目標LED1331的長波長激發光(大于LED峰值激發的波長)不會被錯誤地混淆為目標熒光發射，這是由于這些較長波長由LED激發濾光片1333截止；b)來自對照LED1311的長波長激發光(大于LED峰值激發的波長)不會被錯誤地混淆為對照熒光發射，這是由于這些較長波長由LED激發濾光片1313截止；C)目標熒光發射不會被(激發過濾的)對照LED1311無意中觸發。否則，該誤差條件將導致對照光電傳感器1317從目標和對照熒光團兩者接收不必要的同期信號。以及d)控制熒光發射不會被(激發過濾的)目標LED1331無意中觸發。否則，該誤差條件將導致目標光電傳感器1337從目標和對照熒光團兩者接收不必要的同期信號。測定驗證意外發現地，可以在雙頭和多頭檢測器中對自主檢測器頭功能進行多路復用，所述雙頭和多頭檢測器包括用于檢測個體熒光團的單獨光學通道，使得每個通道包括用于照射激發光的LED，具有激發濾光片、發射濾光片、調諧為使能檢測來自限定通帶中的熒光團的發射的分色鏡的至少一個光路，用于聚集所述激發光和用于采集所述發射的物鏡、用于接收任何通帶發射的傳感器以及用于放大來自傳感器的輸出的高增益放大器，其中每個LED配置為照射使得通道的照射頻率不重疊的頻率范圍中的光，每個光學通道被配置為使得通道的發射通帶不重疊；以及在由嵌入在檢測器頭內的微處理器執行的固件中駐留的自主守護進程的控制下，將所述多個通道的所述放大器的輸出多路復用地數字化并且制表在易失性存儲器中。對于測定驗證，提供兩個傳感器通道(或者更多個)用于監控兩個或者更多個熒光團，兩個傳感器通道被配置為使得來自每個熒光團的發射通帶不重疊。在優選實施例中，第一檢測通道用于檢測目標信號的目的以及第二檢測通道用于檢測對照信號的目的，以及當且僅當報告了有效對照信號時才報告測定結果。該系統已經證明對要求成對采集“biplex”或者多路復用的目標信號和對照信號的測定協議的驗證有用。其中，關于FDACLIA棄權要求，將目標模板和對照模板兩者并行放大，在可以報告或者宣布關于測試試樣的測定結果之前必須存在正對照信號。在沒有可檢測對照信號的情況下，檢測的任何目標信號都不是有效結果。如果滿足該條件，則根據1988的臨床實驗室改進修正案(CLIA)，可以放棄管理簡單的低風險測試的規則，并且在醫生辦公室和各種其它位置中在沒有監督的情況下進行測試。為了滿足這些CLIA棄權要求，需要熒光檢測器不僅能夠檢測例如由PCR放大擴增的目標傳染性有機體的存在，而且還能夠檢測與目標共存并且由相同PCR反應或者儀器中并行進行的PCR反應擴增的內源性人為控制有機體的存在。這種方法要求用于這種分子診斷測定的熒光檢測器可以具有將目標熒光團和對照熒光團的存在確定為共同檢測室中的“biplex”擴增反應混合物的能力。在一個方面中，使用具有熒光激發和發射光譜的正擴增對照熒光團，該熒光激發和發射光譜被定位為由選擇性帶通濾光片從針對目標熒光團的熒光激發和發射光譜(按照波長)很好地分辨(例如參見圖25A-25B)。然而，根據本發明，證明可以通過使用雙頭檢測器以及通過掃描每個檢測室兩次實現優秀的分辨率，每個頭一次，首先檢測對照熒光特征，然后檢測目標試樣熒光特征-每個掃描途徑要求單獨的激發和發射光學器件。通過用完全分隔的并且獨立的光路配置這些檢測器發現了好處。在本發明的該方面中，使用雙重頭設計確保試樣中擴增對照熒光團的存在不會由于“串擾”而在目標通道中無意中地產生信號。這種情況將產生分類為“假陽性”的試樣。相反地，從目標通道到對照信道沒有串擾也很重要，這在多個信號共享共同的光路時是可能的。這種情況會導致正擴增對照在其可能不存在時被無意中地認為存在。通過利用熒光素或者等效的熒光團作為用于目標分子探針以及利用得克薩斯紅或者等效的熒光團作為用于對照的分子探針來例示這些原理。一個檢測通道優化用于檢測熒光素以及另一個檢測通道優化用于得克薩斯紅的雙頭檢測器被發現對于測定biplex擴增混合物驚人地靈敏、精確和健壯，兩個檢測通道各自具有單獨的激發和檢測光學器件。由駐留的守護進程對每個光學通道進行單獨的熒光讀取。令人驚訝地，該程序提高了分辨率并且最小化了串擾，但沒有貢獻于由于移動檢測器頭的機械器件較高的噪聲或者靈敏度損失。圖26A是在熒光目標(在該實例中根據分子診斷測定指示瘧疾核酸的存在)存在于嵌入在微流體盒內的檢測室中的情況下，由檢測器的目標通道接收的信號水平的曲線。在該情況下，可以從軌跡看出，目標通道在900mV范圍中從檢測室接收熒光信號。在這種情況下，來自目標通道的“瘧疾正”信號等于空檢測室的“背景”信號水平的大約14倍。軌跡是平滑的并且指示屏蔽的檢測器頭內擴增回路中的低電子噪聲水平。圖26B是在熒光目標(在該實例中根據分子診斷測定指示瘧疾的存在)存在于檢測室中的情況下，由檢測器的對照通道接收的信號水平的曲線。在這種情況下，可以從軌跡看出，對照通道具有40-50mV范圍中的輸出(基本上等于預掃描基線)，如當掃描僅具有目標信號而沒有對照熒光團的檢測井時，指示目標光學通道與對照光學通道之間串擾的可忽略水平。圖26C是在熒光目標(瘧疾、得克薩斯紅熒光團)和熒光對照(內源性人的對照、熒光素熒光團)在嵌入微流體盒內的單個檢測室中一起擴增為混合物的情況下由檢測器的目標光學通道接收的信號水平的曲線。在這種情況下，上部軌跡顯示在第一光學通道中接收了大約680mV的目標信號水平，其中目標信號與得克薩斯紅標記的瘧疾擴增子相關聯。這相當于來自空檢測室(下部軌跡)的信號的大約10.5倍的水平。這指示正確識別biplex試樣的“瘧疾正”組分的存在的檢測器功能。圖26D是在熒光目標(瘧疾)和熒光對照(內源性人為對照)在嵌入微流體盒內的檢測室中一起存在的情況下由檢測器的第二光學通道接收的信號水平的曲線。biplex試樣混合物與圖26C的biplex試樣混合物相同，并且信號與熒光素標記的內源性對照擴增子相關聯，表明沒有來自目標擴增子的串擾以及良好的信號穩定性和免于電噪聲干擾。在這種情況下，軌跡顯示由對照光學通道接收大約160mV的信號水平。這相當于來自空檢測室的信號的大約3.6倍的水平。這指示關于在單獨的光學通道中正確識別biplex試樣的“對照正”組分的存在的檢測器功能。因此，在單個井中檢測到目標擴增子和對照擴增子，如按照CLIA棄權要求指示成功的“biplex”測定。由于沒有用白光進行激發，而是以對個體熒光團特定的波長作為替代進行激發，因此第二熒光團的淬滅不是問題。這里描述的系統使用物理方法和信號處理方法的組合實現健壯的測定性能，諸如在臨床實驗室的受控環境外部進行可靠操作所需要的。圖27是用于控制熒光激發以及接收、處理熒光發射信號和向主機儀器傳遞熒光發射信號的檢測器頭1300電子設備和光學器件的框圖。光學通道再次由空箭頭A和B標識并且終止于傳感器1817和1837。通道A作為對照通道以及通道B為目標分析物通道，但角色是可互換的。每個通道中的電子功能塊、源(1811、1831和關聯電路塊)和傳感器(1817、1837和關聯電路塊)是相同的(除了通道A和B配置為不同波長以外)。檢測系統可以配置為UV、可見區和近紅外光譜的波長。具有近單色輸出的可用光源、濾光片、發色團和熒光團允許在300至900nm范圍內調諧激發和發射通帶。對于以熒光檢測模式(其是本發明的優選操作模式中的一個)的應用，裝置可以配置用于具有UV和可見光譜中的激發光譜的特定熒光染料以及在UV、可見和近紅外光譜中的發射。盡管紅移更典型，但是還可以使用上轉換的熒光團。在檢測器頭1300內，由130Hz頻率的方形波對與源激發電路(1811、1831)關聯的LED中的每一個進行調制。該調制的理由與來自下列潛在噪聲源的噪聲降低措施相關：1)50/60HzAC電源；2)來自熒光的100/120Hz二次電源諧波；3)50/60HzAC的三次以及更高次諧波；4)130Hz以及更高的差分頻率(隆隆聲)；以及5)來自光電二極管傳感器、第一級反饋電阻器和放大器的寬頻帶白噪聲。為了從有噪聲的源取回有用信號，采用下列減輕方法：1)為了避免混疊并且同時限制噪聲帶寬對所取數據進行快速采樣和取平均值；2)為了拒絕所有未校正的組分(選擇130Hz的調制頻率以提供與50/60Hz電源至少10Hz的差以及100、120、150和180Hz以及更高處的諧波)，以130Hz調制LED光以及與130Hz的所檢測的熒光信號的相關；以及3)還對相關數據進行過濾和處理，以從50Hz或者60Hz或者其諧波的主電源消除電磁噪聲。使用由FAN5612LED驅動器驅動的130Hz方形波來接通和關閉激發LED。每個驅動器能夠在要求的頻率下消耗高達120mA的電流(三個輸出中的每一個上40mA)。檢測器頭微處理器的時鐘頻率用于選通激發LED以及使傳感器二極管中的脈沖采集同步。發現這些特征在沒有特定熒光信號的情況下從傳感器產生安靜輸出并且使能更高的放大。用于源LED的電路板1801可以支撐多個LED，以及用于傳感器電路的電路板1802可以支撐多個光電二極管。使用單獨接地層上的單獨PCB板(1801、1802)上的旁路電容器電子地隔離激發和檢測電路，以進一步通過銷連接1804減小任何可能的串擾。每個光電二極管被屏蔽并且與多級高增益放大器(1818、1838)緊密地相關聯，以及兩個電路板與單獨的接地電子地隔離。在檢測器頭中，來自傳感器光學器件的電氣輸出在前置放大器中進行調節并且饋送到三級放大器中。來自放大器的三個輸出中的每一個具有多個對數比例的增益，其中最高放大因數高達1014。三個輸出饋送到集成到嵌入式微處理器中的A/D轉換器中，并且一個數字輸出(由固件選擇的輸出)作為數字化分數總線連接至存儲器。有利地，將模擬和數字信號處理電路隔離在屏蔽的檢測頭內實現了允許非常驚人高的增益因子(高達1014，以及在選擇的實施例中為在三級中1012與1014之間)的低噪聲條件。通過將數字化電子設備定位在緊挨著傳感器的檢測頭內，以驚人的少的噪聲干擾實現具有高增益的放大的信號。還向運算放大器提供緩沖的和過濾的基準電壓以確保放大的信號輸出中的最大穩定性，該放大的信號輸出在與嵌入式微處理器1841相關聯的A/D轉換器中數字化；因此，在掃描檢測器頭內發生數字化。盡管上面是硬件的描述，但是由固件中編碼的“ODAP守護進程”進行檢測器頭中的信號處理算法和放大器電光學器件的實際操作，該“ODAP守護進程”起“虛擬機”的作用。盡管守護進程基本上是指令集合，但駐留在與嵌入式微處理器數字地相關聯的非易失性存儲器中的檢測器頭中，并且一旦調出，則與相對于主機控制器獨立地工作。固件(用于控制掃描檢測器頭的光電子功能和信號獲取的專用板載指令集)典型地駐留在套接的EEPROM芯片1842中。守護進程控制檢測器頭中的嵌入式微處理器1841。在對放大的信號進行數字化之后，守護進程能夠進一步地信號處理，例如將光學數據與背景掃描進行比較和/或在向主機系統報告數據以用于顯示給用戶之前關于熒光是否是正測定結果做出復雜的確定。我們驚訝地發現檢測器頭中的嵌入式微處理器、主機控制器和兩個處理器可以協調為使得ODAP守護進程能夠在檢測器頭在主機控制器的外部控制下移動時構造試樣區域的空間圖。ODAP功能自主地進行采集信號數據，例如，當主機控制器對檢測室中的溫度進行解鏈/退火子例程時，使得在主機控制器例程中重新編程的測定不影響或者沖擊在守護進程的控制下進行數據獲取和報告的操作，顯著的優點在于根據從測定盒讀取的條形碼，可以由主機控制器執行若干測定協議中的任何一個。使用檢測器頭內部的嵌入式微處理器1841的一個優點是可以將“光學數據獲取和處理”(ODAP)的專利方法編程到檢測器頭中的固件中，以在向主機控制器傳遞干凈的數字化信號之前消除噪聲。因此，ODAP守護進程是必要時由主機處理器調用一個或者多個獨立的子例程-但是一旦發起，守護進程和關聯的光電子學設備在嵌入固件的獨立控制下自主地運行。實際上，已經證明可以在檢測器頭內完成整個分析并且僅僅向主機儀器傳遞總分或者測定結果。不同于模擬信號，從檢測器頭到主機儀器的數字傳輸不易受到由儀器殼體內發生的有噪聲的模擬策劃引起的干擾的影響。如當前實現的，當跨越盒線性地掃描檢測頭時，ODAP守護進程連續地并且自主地運行。這里“守護進程”指的是用于光學數據獲取和處理的可編程指令集的操作，該可編程指令集存儲在由嵌入式微處理器執行的固件中，作為自主后臺進程而不是在交互性用戶或者由主機控制器的直接控制下。在某種程度上，守護進程是操作和控制電子電路的虛擬機，該電子電路定位在檢測器頭中使得它可以免受與主機操作相關聯的外部電子噪聲的影響。因此，本發明包括用于使微測定自動化的方法，該方法包括操作地將測定劃分為由主機控制器控制的流體過程、機電過程和熱過程和由掃描檢測頭中駐留的自主守護進程控制的光電子過程，其中掃描檢測頭的運動由主機控制器控制，以及任何光學信號獲取和處理由自主守護進程控制。通過圖示和示例的方式，各自用于分析液體試樣的三個檢測室設置在由檢測頭掃描的光學窗口中。掃描時間為大約30秒以及掃描長度被分成大約500步長。盡管檢測器在130Hz下工作，但是數字化速率更高，使得可以在每個掃描期間進行12000至24000次熒光測量。將傳感器二極管輸出存儲并且取平均值，使得當以130Hz選通LED以消除非特定光電二極管輸出時，可以從亮半周期減去暗半周期。在板載固件的控制下以100ms增量進一步地處理數據集。因此，根據步進電機的特征和掃瞄的長度，在檢測頭中的本地存儲器中制表的數字化分數由在100ms內獲取的處理的信號組成并且與線性掃描中的一個或者僅幾個步驟相對應。因此，與信號相對應的“光斑大小”相當小但沒有高分辨率數字像素那么精細。每個數字分數具有與在LED接通時間間隔期間累加的所有放大的電流減去在LED關閉時間間隔期間任何周圍信號相對應的值。守護進程被同步以跟蹤步進電機致動，并且累加熒光輸出分數對比光學窗口的寬度內的掃描距離(位置)的表格。通過在測定之前進行基線掃描，隨后確定由與測定反應相關聯的染料、色原或者熒光團引起的任何“新”信號(即，基線上的任何改變)的數量。在完成背景減法之后，如果需要，還可以使用閾值進一步地過濾基線上的信號變化。可以通過硬件和固件裝置的組合實現數據采樣、濾波、數字平滑和調節，固件指的是守護進程指令集。在跨越試樣井的掃描期間獲取的數字分數的可編程統計分析可以是參數化的或者非參數化的。根據特定于每個試樣井的每個數據集，掃描橫斷面上的分數分布是比在井上取的平均值、中間值或者眾數值更好的測定真值(對于目標分析物或者對照為“正”或者“負”)的預測因子。基于具有許多點的分步函數的結果還優于通過以低分辨率詢問井獲得的光學平均的信號。平均值會導致假陰性，而我們已經發現高信號尖鋒的模式(即使局限于井的特定部分)非常可能與正測定相對應。固件配置為評估數字分數的強度和信號尖鋒的頻率，以及使數字分數的強度和信號尖鋒的頻率與正測定結果對比負測定結果的期望范圍相關。數據集可以被看作群體統計，其中根據強度排列的30個測量值的群體例如與根據變化的統計分析依據零假設期望的分配相比較。用于非參數化地評估數據的統計工具也是可適用的并且可以編碼在固件中。因此，在優選實施例中，檢測頭的板載能力包括將測定結果輸出為數字“一”或者“零”(與是否已經檢測到分析物(真或者假)相對應)，以及還有對應對照的狀態。令人驚訝地，我們已經發現通常在嵌入式固件內的守護進程的控制下，數據集中的由于氣泡以及其它不規則性的像差可以由向1比特數字分數的轉換來管理。對嵌入式微處理器的輸入進行多路復用使得可以同時測定若干目標分析物和對照物。檢測器頭設置有至少兩個或更多個光學通道，各自具有在離散波長下操作的獨立的激發光學器件和發射光學器件。不使用白色激發光以消除多路復用的測定(諸如當目標熒光團和內部對照熒光團混合在共同液體試樣中時)中不同熒光團之間的可能串擾。對于目標和對照使用“一鍋法”條件起因于證明用于正對照信號的條件存在于每個試樣井中(避免假陰性)的需要。但是通過分離目標和對照通道光學器件，消除了可能導致假陽性測試或者由于無效的對照結果的測試決絕的串擾。為了比較，主機控制器1800負責操作員界面(包括顯示結果)以及負責執行盒上測定和檢測器頭掃描需要的機械和氣動功能的操作。主機控制器中的單獨時鐘用于在掃描期間驅動步進電機。為了使檢測器頭位置與掃描期間獲取的熒光信號相關，步進電機活動由檢測器頭中的固件監控。井位置辨識由在掃描檢測器頭中的嵌入式守護進程的控制下操作的“邊緣檢測”過程實現。在第一實例中，一對機械開關安裝在具有與嵌入式控制器數字通信的引線的檢測器頭的下側上。在空盒的首次掃描中，檢測器頭在步進電機的主機儀器控制下沿著其軌道滑動，以及當第一機械開關被橫靠軌道的儀器底架中形成的止動器跳閘時，隨后向守護進程發送電子信號。守護進程被編程為發起其活動并且將啟動從主機儀器捕獲步進電機數據以及使用該數據繪制跨越盒的光學窗口的X軸橫斷面，其中發動機的每個步長與由步進電機限定的位置和距離增量n相對應，使得對于從基準點x0的任何距離xi，(xi＝x0+(ni))。守護進程還存儲首次掃描期間的光學輸出。因此，守護進程把位置x0和強度I0數據對制成表格，并且隨著步進電機使檢測器頭前進繼續增量xi。由于與試樣井相關聯的盒光學器件中的不連續性，沿著x橫斷面的盒的光學掃描產生對井邊緣檢測有用的信號。這些信號由峰值表征，其中當檢測頭橫穿井的近側邊緣時，由峰值條件dx/dt＝0或者基線光學輸出中的突然階躍變化(下降或者增大)來將正斜率與負斜率分開。如果閾值交叉，則與井的入口相關聯的邊緣效應由守護進程評分為在線性圖或者x橫斷面上具有x坐標(電機步進數量)的井啟動位置。由于檢測器頭安裝在剛性導軌上，因此x橫斷面路徑可以是相反的，并且掃描頭能夠在從相同起始點x0跨越井的后續掃描中精確地回歸其路線。以這種方法，由從機械止動器跳閘的軌道上的位置到井邊緣的繪制過程確立明確的物理距離。類似地，井的遠側邊緣被識別。近側邊緣與遠側邊緣位置之間的空井的背景光學讀數被隨后處理并且存儲為代表性背景信號。對于所有井重復該過程，并且對于檢測器頭中的每個光學通道再次重復。利用合適的偏移，機械開關可以用于超過一個通道，使得x橫斷面在單個掃描期間被收集用于每個光學通道。類似地，隨著掃描頭沿著光學窗口掃描，多個井可以一次掃描一個。檢測器頭隨后返回至其靜止位置，并且根據命令，啟動將檢測與充滿井的試樣相關聯的光學輸出的任何變化的掃描。守護進程根據存儲器中預定義的井邊緣位置從檢測井收集數據，并且執行計算以評估與井的內容物相關聯的熒光(或者其它光學信號)的變化。這些數據還由守護進程操作的信號處理算法處理。在引入試樣之后井中的每一個中的熒光變化或者沒有熒光變化可以根據測定設計指示對照信號的存在和/或目標分析物信號的存在或者不存在。邊緣檢測可以包括諸如本領域中已知的三角形濾波器或者其它信號濾波器的濾波器。如在本領域中已知的，與盒井的邊緣相關聯的基準點可以包括井周圍沉積或者鋪設的有色層、引起光學散射的物理邊緣、具有自發熒光的盒材料等等。因此，繪制例程可以替換地索引至與盒主體或者試樣井相關聯的基準點，使得初始參考點被光學地、電氣地或者機械地確立。為初始位置x0和關聯的強度I0記錄一組數據對。隨著井繪制逐步進行(xi＝x0+(ni))收集后續數據對(xi,Ii)，其中n是步進電機的步長數量以及i是步長距離。算法用于檢測試樣井邊緣的信號變化特征并且為這些特征編索引使得掃描橫斷面中的一個或者多個試樣井被索引。因此可以執行預掃描并且數字化收集的基線光學信號數據；隨后，試樣井充滿包括感興趣的分析物的液體并且執行第二次掃描：兩個掃描之間的差表示感興趣的目標分析物和/或對照分析物。在檢測器頭內的自主守護進程的控制下執行信號處理和數字化以及后續分析。圖28A和28B是原始輸入和數字化輸出的表示，并且展示用于由守護進程數字去除氣泡干擾的方法。在圖28A中，呈現了放大之后的來自光電二極管的輸出(1900)。對于圖示，盡管噪聲水平通常很低，但是由于檢測室(1501，參見圖29)中兩個小氣泡的存在信號在1901和1902處降低。守護進程向輸出信號施加閾值，并且如果信號高于閾值則對信號評分為“高”(即，一)，以及如果信號低于閾值則評分為“低”(即，零)。由于除了在有與發射光學器件和濾光片匹配的熒光團的情況以外沒有信號輸出可以高于閾值，因此任何正信號(1903)是針對熒光團的存在的正測定。可以基于測定中臨床試樣的經驗調節閾值比較器。因此掃描圖像數據的“1比特”數字轉換去除來自氣泡的任何干擾。我們驚訝地發現，當熒光團存在但是多個氣泡充滿室時，圍繞或者通過氣泡折射的光將產生正信號。因此，對于定性測試，系統是非常抗誤差的并且健壯的，諸如在針對傳染性疾病的診斷測定中需要的。信號比較器是嵌入在檢測器頭中的微處理器和固件的數字功能并且獨立于主機控制器功能。主機控制器功能再次參照圖27，主機控制器1800負責致動守護進程，但是不控制其操作。在守護進程的操作期間，主機系統進行多任務以執行各種測定功能，諸如溫度和氣動控制、檢測器頭掃描、用戶界面可操作性和故障監控。除了其它功能以外，主機控制器致動用于控制執行測定需要的氣動邏輯和脈沖串例程的系統硬件(包括微測定盒中的閥和隔膜泵、與試樣熱循環相關聯的任何電阻或者Peltier型加熱元件)，以及可選地可以通過在解鏈期間致動電阻加熱元件以及在冷卻期間致動鼓風機(圖22)在檢測室中執行解鏈曲線。與主機控制器接口的可選部件包括用于感測打印在可插入微測定盒上的信息的條形碼讀取器。主機控制器設置有非易失性存儲器和可編程指令，可編程指令用于協調測定過程的步驟以及用于以將對用戶適用的形式將信號、結果或者來自嵌入式守護進程的其它數據轉換和格式化為機器可讀或者可圖形顯示的報告。用于顯示測試數據的圖形用戶界面1820可以并入如這里所示的檢測系統中或者可以通過作為網絡、內聯網或者因特網的部分的數據線路或者無線接口連接至檢測系統。通常，提供串行異步通信接口用于與儀器母板上或者外部網絡上的主機控制器通信。類似地，可以通過共同的電子接口和數據線路(諸如USB、RS232或者FireWire)以及通過無線傳輸系統(諸如IR傳輸、藍牙、GSM、GPRS和RSID)發送結果、數據、錯誤代碼、狀態更新等等。可以通過共同的電子接口和數據線路(諸如USB、RS232或者FireWire)以及通過無線傳輸系統(諸如IR傳輸、藍牙、GSM、GPRS和RSID等等)進行器件的編程、重新編程、校準和再校準以及系統診斷。去耦的光學器件圖29A是激發模式中平凸物鏡1500的表示。示出了相對于盒檢測室1403和具有鏡面1400的加熱塊1410的激發錐體1501。會聚激發錐體由從源照射物鏡的發散射線形成，借此焦點位置距離L2’大于透鏡的天然焦距L2。按照慣例，使用準直光確定透鏡的天然后焦距L2。移位焦點位置稱為“去耦”，并且在該實例中通過將源移動至更靠近源透鏡實現，但是更一般地去耦可以通過使用非準直光實現。置于透鏡1500與鏡面1400之間的是具有檢測室1403的微測定盒200。檢測室以上部光學窗口1502和下部熱光學窗口1503為邊界。在操作中，由液體試樣(這里顯示為具有兩個夾帶的氣泡1505)占據中間的體積。可以看出，焦點錐體從鏡面反射，在檢測室中形成源的實像(1510，實線射線)以及在鏡面下形成源的虛像(1511，虛線射線)。因此，后焦點位置L2’通常等于或者大于透鏡與反射鏡之間的距離。打到反射鏡的激發光在檢測室的流體體積中反射為聚焦束，從而使通過試樣的激發光的光路長度加倍并且增大激發熒光產額。后焦點位置L2’不等于透鏡1500的后焦距L2；通常通過用來自源1512的發散束照射透鏡來去耦該二者。圖29B是發射收集模式中圖28的物鏡的表示。示出了原始的和反射的熒光發射(來自實像1510和虛像1511的實線和虛線)。再次示出了室1403中的氣泡。打到物鏡1500的平坦后表面的射線將準直(1522)并且透射到檢測器。捕獲的熒光信號的數量取決于透鏡的角度和數值孔徑。透鏡1500的天然后焦距是L2。可以通過如圖30和31所示重新定位源或者通過改變源透鏡的形狀或者折射率，來操縱透鏡的后焦點位置或者使透鏡的后焦點位置相對于透鏡的天然焦距(L2對比L2’)“去耦”。圖30是具有去耦的激發和發射光學器件的光學路徑1700的示意性表示。在該附圖中，激發射線顯示為實線以及發射射線顯示為虛線。在這里，光源1701可以是如圖所示的LED、沒有透鏡殼體和反射器環的SMDLED、SLED、泵浦激光二極管、脊波導(FabryPerot)激光二極管、可調諧激光器等等，這種照明源優選地具有窄帶寬。各種窄帶寬的LED可用，例如具有630nm(紅色)、470nm(藍色)、525nm(綠色)、601nm(橙色)、588nm(黃色)等等的峰值發射。如果需要可以使用白光LED，但是通常LED輸出與測定中的目標的熒光團相匹配并且可選激發屏障濾光片(未示出)可以用于根據需要來銳化帶通。盡管在打到分色鏡元件1704之前，由這里顯示為平凸透鏡的源透鏡1702透射光源1701的光輸出，然而還可以使用模塑的非球面，其中激發束反射到物鏡1705上。用實線示出了打到微測定盒1402中的試樣流體體積1720的激發錐體。不依慣例地，已經通過將源1701移動至更靠近源透鏡1702來將激發錐體的焦點投射經過試樣室和后反射鏡1400(即，為了增大距離L2’以縮短距離L1’，其中距離L1將是透鏡1702的天然后焦距)。隨著距離L1’縮短，打到物鏡的源射線沒有由源透鏡準直并且其被發散，從而增大距離L2’。物鏡1705的天然后焦距是L2，其中L2小于或等于分隔物鏡后面和反射鏡的距離，即，優選地在試樣室的平面內，使得來自試樣室中的熒光團的任何發射和在反射鏡中形成熒光團的虛像的任何反射的發射將進入物鏡。發射錐體具有與激發光(其聚焦在反射鏡后面)的焦點去耦的焦點。焦平面L2內的熒光發射和起源于焦平面的光的任何虛像由物鏡有效地準直、有效地透射通過分色鏡1704、帶通濾光片1706以及隨后由傳感器透鏡1707聚焦到傳感器1708上，該傳感器1708典型地安裝在PCB或者其它固體支撐1709上。透鏡1707具有通常等于物鏡1705的后焦距L2的后焦距L3。然而，較大的透鏡1707可以用于更好地利用傳感器1707(例如光電二極管或者CCD芯片)的表面面積。信號的優化可以根據這里概述的去耦的光學系統的原理要求對每個透鏡的獨立調節，以及與現有技術的教導相反，可以使用非準直激發光。共同光軸上從物鏡1705出現的激發光的錐體和進入物鏡1705的發射光的錐體在不同焦點(分別地由焦點位置L2’對比L2指示)處可操作地去耦。距離分隔激發光的實際焦平面和物鏡的天然焦距。當使用反射鏡和激發錐體1501的延伸焦點位置激勵時，物鏡將捕獲熒光發射的原點的寬闊平面中的光。發現該現象(稱為“去耦”)在使用后反射鏡時增大熒光發射的捕獲，并且駁斥支持現有技術的共焦方法的較早的教導。盡管現有技術的教導強烈地支持進行激發和發射共焦，但是實際上在從發射錐體去耦源的聚焦和使用后反射鏡1400中有先前沒有看到的優勢。發射光由貫穿整個試樣盒的更大區域和深度產生，從而克服由于如由于小氣泡、非混合區域或者淬滅探針將成為的死點或者不均勻性的任何信號缺少。盡管以針對起源于焦點處的激發的一些選擇性為代價實現更大的可靠性，但是針對激發的空間選擇性事實上在測定器件中并不合乎需要。這是本領域中的技術進步。為了總結，在某些實施例中，L2’可以大于L2和L3。L1可以有利地配置為使得激發光的錐體落在試樣室1403的后面以及最優選地接近后反射鏡1400或者在后反射鏡1400后面。在優選實施例中，激發錐體的焦點落在后反射鏡上或者后面。物鏡通常被配置為使得發射光被高效地收集并且準直以用于由來自傳感器透鏡1707的發射光的對稱錐體投射到檢測傳感器上(即，L2＝L3)。相應地，在另一個實施例中，本發明的裝置采用配置為使得激發光學器件和發射光學器件去耦的透鏡。在該裝置的第一實施例中，光源定位在距源透鏡的距離L1’處，其中L1’＜L1，借此通過將激發錐體轉換到鏡面處或者后面的焦點位置L2’，使得L2’＞L2，使激發光學器件和發射光學器件去耦。更一般地，源透鏡配置為形成入射在物鏡上的發散光束，從而將激發錐體定位在焦點位置L2’處，借此L2’＞L2。有利地，L2被配置為與L3對稱(即，L2＝L3)，使得檢測器1708的操作是優化的并且健壯的。傳感器光電二極管優選地配置為關于透鏡1705和1707的聚焦錐體足夠大，以在沒有損耗測定有效性的情況下適應一定程度的不對準。在去耦的光學器件的可選實施例中，物鏡的天然焦點和激發光的實際焦點由距離分開，使得L2>L2’。這在圖31中進行了圖示，其中遠離源透鏡1702移動源1701以超過透鏡的天然后焦距(L1’＞L1)。這種重新定位的效果是如圖所示使從源透鏡發出的射線隨著它們接近物鏡1705而會聚，以及最終效果是縮短L2’。通過將激發錐體焦點位置直接放置在光學窗口1502與1503之間的試樣室1403中間，以及通過使用反射鏡1400，實現試樣液體中的熒光團的激發。但是在該使用去耦的光學器件的實例中，還使物鏡移動至更靠近試樣室并且透鏡L2的天然后焦距現在定位在反射鏡后面。這樣的效果是增大透鏡的表觀角孔徑，即，通過使透鏡移動至更靠近熒光團，更多的光被收集并且重新引導至傳感器。如前所述，來自物鏡的準直輸出聚焦在傳感器1708，并且因此典型地L2可以等于L3。因此，圖30和31所示的去耦的原理包括用于在與反射的熱光學界面一起使用時使用非準直的激發光來優化信號收集效率的兩個互補方法，該反射的熱光學界面也是本發明的方面。去耦不僅對要求區分正測定結果或者負測定結果的測定有用，而且還對要求一定水平的定量的測定有用，如例如在惡性瘧原蟲情況下的裂殖體或者裂殖子拷貝數量。應當回想到，如其發明人Minsky在1957(美國專利3013467)中明確表達的共焦光學器件的原始目的是，通過在監控僅來自在任何給定時間聚焦激發錐體的樣本區域的發射時，恢復跨越和通過樣本的激發的焦點(xyz軸恢復)產生的粗固體樣本的三維圖像。相對比，在通常均勻的流體混合樣本中，對于測量具有最高可能熒光捕獲的樣本的總體熒光，期望相反的效果。在橫越樣本期間進行多次測量的系統中，統計方法可以用于克服諸如由氣泡引起的干擾，以及強烈的正信號(無論其起源于試樣室中的何處)可能指示正測定結果。因此通過再闡述問題，我們已經能夠設計具有后反射鏡的新穎的光學系統，其中去耦激發和發射的焦平面，伴隨愉快的結果--在存在偶然干擾的情況下熒光檢測更靈敏并且更健壯。圖32A繪制了表明通過改變反射鏡上方的物鏡高度增強熒光信號輸出的實驗結果的曲線。簡單地說，熒光珠(ThermoFisherScientific，零件號G0300，PittsburgPA)插入到微測定檢測室中并且檢測室安裝在檢測器的物鏡315下。使用數字測微計，隨后改變高于微測定盒的檢測器頭的高度以構造曲線。在第二次配對試驗中，去除了反射的表面。實線(2100)示出了在加熱塊上存在反射鏡的情況下改變透鏡高度的效應；虛線(2101)示出了在沒有后反射鏡的情況下改變透鏡高度的效應。如可以看到的，反射鏡的存在似乎將最優發射最大值移位在反射鏡平面后面(即，透鏡中捕獲的真實和虛擬熒光發射的合成)。圖32B是示出了具有(2103)以及沒有(2102)后反射鏡的輸出信號強度的柱狀圖。人們發現如圖29A所示通過在反射鏡后面的焦點處聚焦激發束以及如圖29B和30所示在較短的工作距離處采集發射以優化輸出信號。在第二實驗中，檢測室充滿包括可溶解熒光團以及以恒定速率通過室泵出以避免淬滅假象的液體試樣。隨后如之前一樣地改變檢測器頭高度并且確定最優檢測器高度。在相關試驗中，還改變光源距離源透鏡的工作距離以優化靈敏度和檢測極限。我們得知當物鏡以檢測室為中心并且使其它透鏡共焦時沒有實現最優配置。當使用反射鏡時，去耦的光學器件實現有利的結果，在領域中獲得技術進步。圖33A示出了掃描對于雜化至擴增子的分子信標收集的數據。掃描軸橫切分別地表示正測試條件和負測試條件的檢測井(2200、2201)，并且能夠看出信號限于檢測井。隨著檢測或者試樣室中的溫度系統地改變來重復地掃描試樣。將掃描覆蓋在曲線中以圖示數據的空間分辨率。針對35℃、65℃、70℃、75℃和80℃的測試條件標記熒光掃描。如期望的，40℃、45℃、50℃、55℃和60℃處的測試曲線以及85℃和90℃曲線沒有明顯區別，并且沒有單獨地標記。能夠看出，熒光信號是根據溫度的。熒光淬滅被觀察為隨著雙鏈探針目標解鏈而增大，即，信號在35℃處最大并且基本上不存在于80℃處。在圖33B中，針對正(2301，實線)測試條件和負(2302，虛線)測試條件的信號對比溫度而繪制數據。在圖33C中，繪制了一階導數，指示大約70℃的FRET熔融溫度。示例I在該示例中，示出了對通過檢測人試樣(諸如血液)中的病原體的核酸診斷傳染性疾病有用的本發明的裝置。使用板載干燥和液體試劑，處理血液試樣以及在大約30分鐘或者更短的時間內檢測與惡性瘧原蟲相關聯的DNA。如在共同轉讓的美國專利7544506、7763453和7955836中描述的，使用具有雙溫度區域的兩個室使從試樣純化的DNA經受PCR。隨后使用引導在擴增的目標處的FAM熒光標記的分子信標來檢測擴增子。可選地，由California紅色標記的RNAaseP白血球外顯子序列(在多路復用的擴增之后)組成的對照用于確認測定。在圖33B中示出了使用本發明的熱光學界面獲得的代表性熱解鏈曲線。示例II本發明的裝置對凝血病的診斷有用。使用板載干燥和液體試劑，通過培養具有熒光底物的等離子體(D-Phe-Pro-Arg-ANSNH-cyclohexyl-2HCl；F.W.＝777.81，HaematologicTechnologies，EssexJunctionVT)針對凝血因子VIIa缺陷癥測定血液試樣，其中ANSN是熒光團6-amino-1-naphthalene-sulfonamide，其在染料與縮氨酸之間的酰胺鍵裂解時發光。從Calbiochem(LaJollaCA)獲得組織因子(TF)并且在使用之前將其并入磷脂酰膽堿或者磷脂酰絲氨酸泡囊中。TF被過量使用。由20mMHepes緩沖劑，pH7.4，0.15MNaCl連同5nM的TF以及包括20uMEDTA組成的100uL底物反應混合物與等離子體試樣一起培養10分鐘以形成活性酶復合體。然后添加ANSH底物。底物的水解速率在因子VIIa的正常范圍內是線性的，并且可以從標準曲線確定。可以在美國專利申請公開No.2009/0325203和其它實驗性文獻中找到測定發展的描述。盡管上面是本發明某些實施例的描述，但是可以使用各種替換、修改和等效物。因此，不應當參照上面的描述確定本發明的范圍，而是作為替代，應當參照所附權利要求連同它們等效物的全部范圍一起進行確定。除非使用短語“用于...的手段(meansfor)”在給出的權利要求中明確地敘述這種限制，否則所附權利要求將不被解釋為包括手段加功能的限制。在本說明書中提到的和/或在伴隨的申請數據表中陳述的美國專利、美國專利申請公開、美國專利申請、國外專利、國外專利申請和非專利公開中的全部(包括但不限于美國專利申請No.61/745,329)通過引用整體地合并于此。如有必要，可以修改實施例的方面以采用各種專利、申請和公開的概念來提供又另外的實施例。