本發明提供RAS蛋白的至少一種肽，其用于治療癌癥。本發明還涉及用于所述用途的所述至少一種肽的藥物制劑。

發明背景

癌癥發作的遺傳背景是原癌基因、癌基因和腫瘤抑制基因的改變。原癌基因是細胞具有變成癌基因的潛能的正?；颉Ｋ邪┗蚨季幋a蛋白并且通過蛋白來行使功能。在大部分情況中，其被證明是信號轉導通路的組分。在自然中癌基因通過點突變或易位而由原癌基因產生，由此導致載有所述突變的細胞的轉變狀態。癌癥通過涉及癌基因和腫瘤抑制細胞中的若干突變事件的多步過程而發展。

在其最簡單的形式中，原癌基因中的單堿基置換可能導致編碼的蛋白有一個氨基酸不同。

在涉及鼠腫瘤的實驗模型中，已經證明細胞內“自我”-蛋白的點突變可能產生由與正常的肽具有單個氨基酸差異的肽組成的腫瘤排斥抗原。在腫瘤細胞表面上的主要組織相容性(MHC)分子的背景中識別這些肽的T細胞能夠殺死腫瘤細胞并因此將腫瘤排出宿主。(Boon，T.等人，Cell 1989，Vol.58，p.293-303)

在近三十年，專門的努力致力于分析人腫瘤抗原的抗體。已經表明此種抗體可以用于診斷和治療目的兩者，例如連同抗癌劑一起。一個問題是抗體僅能夠結合暴露在腫瘤細胞的表面上的腫瘤抗原。因為這一原因，產生基于身體免疫系統的癌癥治療的努力不如預期的成功。

抗體典型地識別天然構象的游離抗原并且可以有效地識別暴露在抗原表面上幾乎任何位點。相對于由B細胞產生的抗體，T細胞僅識別在MHC分子背景中的抗原，所述抗原在人中被稱為HLA(人白細胞抗原)，并且所述識別僅在適當的抗原加工之后，所述抗原加工通常由蛋白的蛋白水解片段化組成，其產生適配到MHC分子的溝中的肽。這使得T細胞能夠識別來源于胞內蛋白的肽。T細胞可以因此識別來源于腫瘤細胞中的任何地方的異常肽(當其被MHC分子展示在腫瘤細胞表面上時)。隨后T細胞可以被激活以消除帶有異常肽的腫瘤細胞。

T細胞可以通過多種機制控制癌癥的發展和生長。細胞毒性T細胞(HLA I類限制性CD8+和HLA II類限制性CD4+兩種)可以直接殺死帶有適當的腫瘤抗原的腫瘤細胞。需要CD4+輔助T細胞來誘導和保持細胞毒性T細胞反應以及抗體反應，并且誘導巨噬細胞和淋巴因子活化的殺傷細胞(LAK細胞)殺傷。

已經鑒定了很多癌基因及其蛋白產物。此外，已經證明健康人的T細胞庫(repertoire)包括對被遞呈在適當的HLA分子上時的來源于一種p21RAS癌基因產物的合成的肽片段具有特異性的T細胞。此外，預期全部癌癥中有大約20％與RAS癌基因的突變相關。

WO 92/14756公開了引起T細胞免疫性的癌基因蛋白產物的合成的肽和片段，其用于針對與RAS相關的癌癥的疫苗和用于治療癌癥的組合物。所述肽對應于由癌細胞遞呈的癌基因的活性片段，并且在對應于癌基因突變的一個或多個位置處包括突變。該文獻公開了在RAS蛋白的位置12、13和61處的突變，并且具體公開了G12A、G12V、G12C、G12S、G12K、G12D、G12R、Q61R、Q61K、Q61L、Q61H、G13V和G13D突變。雖然該文獻提及疫苗可以包含具有在癌基因蛋白中發現的最常見的突變的肽的選擇，但是其沒有提示肽的任何具體組合。

WO 00/66153討論了用于癌癥疫苗的引起T細胞免疫性的合成的肽混合物。所述肽混合物由RAS p21突變體肽組成，并且該文獻具體公開了G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V、Q61H、Q61K、Q61L、Q61R和G13D突變。該文獻還公開了由肽混合物引起的免疫應答顯著高于由單個肽引起的免疫應答。然而，其未提示將肽疫苗與任何其他形式的治療一起用于癌癥的聯合治療。

Gjertsen等人(Int.J.Cancer 2001，92，p.441-450)公開了涉及用合成的突變體RAS肽與粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子聯合給患有胰腺的腺癌的患者進行疫苗接種的I/II期試驗。該試驗使用單肽疫苗或四種突變體肽的混合物。組合疫苗由四種在胰腺癌中發現的最常見的K-RAS突變組成，即具有G12V、G12D、G12C或G12R突變的肽。該文獻未提示與抗代謝物化療劑聯合治療可能有效。

Wedén等人(Int.J.Cancer 2010，128(5)，p.1120-1128)報道了用合成的突變體RAS肽進行疫苗接種的患有胰腺癌的患者的長期隨訪。所述疫苗由單個的RAS肽或七種RAS肽的混合物組成。具體地，用于該試驗的七種RAS肽具有G12A、G12C、G12D、G12R、G12S、G12V或G13D突變。沒有提到與抗代謝物化療劑的聯合治療。

Prior等人(Cancer Res.2012，72(10)，p.2457-2467)公開了不同類型的癌癥與特定RAS同種型的突變相關，并且各同種型具有與眾不同的密碼子突變特征。此外，Prior等人公開了在RAS蛋白的位置12、13和61中出現總計18種突變，每個位置出現六種突變。該綜述還討論了這些突變對RAS功能的影響以及導致RAS同種型突變的差異模式的潛在機制。

之前的不相關的癌癥患者治療是系統性施用化療劑吉西他濱(gemcitabine)。吉西他濱是目前常見的用于患有各種癌癥的患者的化療療法，所述癌癥如非小細胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌和乳腺癌。尤其是，吉西他濱常用于治療晚期胰腺癌。

吉西他濱是抗代謝物化療劑，特別是嘧啶類似物。吉西他濱的三磷酸鹽類似物在DNA復制過程中替代胞苷，并且插入延長的DNA鏈，在加入再一個核苷酸后中止進一步的DNA合成，原因在于DNA聚合酶不能前進。作用的進一步機制被認為是包括抑制核糖核苷還原酶，導致DNA合成所需的脫氧核糖核苷酸池消耗，并且與三磷酸脫氧胞苷競爭作為DNA聚合酶的抑制劑。這些作用造成壞死，導致腫瘤生長停滯。該作用還意為，抗代謝物化療劑對其他活躍分裂的細胞如T細胞有毒性。優選的方案包括首先使用化療，接著疫苗接種以增強之后對來自殺傷的癌細胞的免疫應答的誘導。

盡管一些藥物組合，如FOLFIRINOX，已經顯示比吉西他濱在患有轉移性胰腺癌的患者中更有效，但是利用該組合的治療與高的副作用發生率相關(Conroy等人，N Engl J Med 2011，vol.364(19)，P.1817-1825)。因此，希望找到用于治療癌癥的新策略。

Oettle等人(JAMA 2007，297(3)，p.267-277)報道了在可切除胰腺癌中使用吉西他濱作為輔助化療的研究，并且公開了吉西他濱對不患病存活的作用在具有R0或R1切除的患者中顯著。尤其是，該研究公開了，與在切除后未施用吉西他濱的患者相比，在完全切除胰腺癌后，手術后的吉西他濱顯著延遲復發疾病的發展。然而，該研究未提示吉西他濱能夠與其他癌癥藥物療法聯合使用。

Bauer等人(Cancer Immunol.Immunother.2014，63，p.321-333)公開了吉西他濱對樹突細胞(DC)疫苗誘導的T-細胞增殖具有消極影響。尤其是，該研究表明，與DC疫苗相比，延遲施用吉西他濱不改善患者的免疫應答，而共同施用吉西他濱和DC疫苗顯著損害疫苗誘導的免疫應答。

因此，需要提供進一步的并且更有效的癌癥療法。

發明概述

本發明產生是因為現在已經出人意料地發現，與單獨施用RAS肽疫苗相比，與抗代謝物化療劑(吉西他濱)聯合施用RAS肽疫苗顯著改善患者的免疫應答。這是預料之外的，因為之前據信，向患者施用抗代謝物化療劑，如吉西他濱，引起增殖的免疫細胞(包括增殖的T細胞)的細胞死亡，由此將會降低患者的免疫系統的活性，并且由此降低患者對同時或順序施用的肽疫苗的免疫應答。不希望受理論限制，據信，事實上，抗代謝物化療劑造成的細胞死亡可以導致產生系統性免疫原性環境的信號傳導分子的釋放，由此促進已經誘導的免疫應答和促進進一步誘導的免疫應答。因此，抗代謝物化療劑實際上增強，而不是降低針對肽疫苗的免疫應答。

在本發明的第一方面，提供至少一種適于誘導免疫應答的肽，其中所述肽或每種肽對應于RAS蛋白的片段但具有RAS蛋白的一至三個點突變，其用于通過與抗代謝物化療劑同時或順序施用來治療癌癥。

有利地，所述肽或每種肽包含包括RAS蛋白的位置12或13的至少8個氨基酸的區域，其中所述區域除了位置12或13外分別具有與RAS蛋白的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基，并且其中所述肽或每種肽分別在對應于所述位置12或13的氨基酸殘基處具有點突變。

方便地，所述點突變中的一個選自G13A，G13C，G13D，G13R，G13S，G13V，G12A，G12C，G12D，G12R，G12S或G12V突變。

優選，所述至少一種肽包括兩種以上的肽，每個肽具有不同的點突變。

有利地，所述至少一種肽包括：

具有G13D突變的肽

具有G12A突變的肽

具有G12C突變的肽

具有G12D突變的肽

具有G12R突變的肽

具有G12S突變的肽，和

具有G12V突變的肽，

優選其中所述至少一種肽包括由SEQ ID NO：13表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：14表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：15表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：16表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：17表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：18表示的序列組成的肽和由SEQ ID NO：19表示的序列組成的肽。

方便地，所述至少一種肽包括：

具有G13D突變的肽

具有G13C突變的肽

具有G12A突變的肽

具有G12C突變的肽

具有G12D突變的肽

具有G12R突變的肽

具有G12S突變的肽，和

具有G12V突變的肽，

優選其中所述至少一種肽包括由SEQ ID NO：13表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：14表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：15表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：16表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：17表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：18表示的序列組成的肽，由SEQ ID NO：19表示的序列組成的肽和由SEQ ID NO：20表示的序列組成的肽。

優選地，所述抗代謝物化療劑是嘧啶類似物，或其藥用鹽。

有利地，所述嘧啶類似物是吉西他濱，或其藥用鹽。

方便地，所述癌癥包含表達突變的RAS蛋白的細胞。

優選地，所述癌癥是胰腺癌。

方便地，所述胰腺癌是切除的胰腺癌。

有利地，所述抗代謝物化療劑在首次劑量的至少一種肽之后至少三周首次施用。

方便地，所述抗代謝物化療劑在手術切除胰腺癌之后12周以內首次施用。

優選地，所述抗代謝物化療劑在至少一種肽的24小時內施用。

有利地，所述抗代謝物化療劑在已經施用至少一種肽之后施用。

方便地，所述至少一種肽以每劑量0.01-10mg，優選0.1-2mg，并且更優選0.7mg的劑量施用。

優選地，所述抗代謝物化療劑以100-10,000mg/m²，優選500-2000mg/m²，并且更優選1000mg/m²的劑量施用。

有利地，所述至少一種肽和抗代謝物化療劑以至少兩個階段(instance)，并且更優選以至少三個階段同時或順序施用，其中每個施用階段間隔至少一周，并且更優選至少2周。

在本發明的第二方面，提供至少一種對根據上述第一方面的至少一種肽特異的T-細胞，或包含對呈遞到MHC分子上時的根據上述第一方面的至少一種肽特異的T-細胞的T-細胞制劑，其用于通過與抗代謝物化療劑同時或順序施用來治療癌癥。

在本發明的第三方面，提供藥物組合物，其包含根據上述第一方面的至少一種肽，或根據上述第二方面的至少一種T-細胞或T-細胞制劑，其用于通過與抗代謝物化療劑組合或順序施用治療癌癥。

在本發明的第四方面，提供試劑盒，其包含分別含有根據上述第一、第二或第三方面的所述的至少一種肽、T細胞或藥物組合物的第一產品，和包含上述方面中所述的抗代謝物化療劑的供給的第二產品。

在本發明的第五方面，提供治療癌癥的方法，其包括向有此需要的患者施用分別如上述第一、第二或第三方面的所述的至少一種肽、T細胞或藥物組合物，和如上述方面中所述的抗代謝物化療劑。

術語“肽”，當在本文中使用時，是指作為較長的蛋白的片段(或具有對應于較長的蛋白的片段的序列)的氨基酸殘基的聚合物。該術語還適用于這樣的氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸殘基是修飾的殘基，或非天然存在的殘基，如相應的天然存在的氨基酸的人工化學擬似物，以及天然存在的氨基酸聚合物。

兩個序列之間的百分比“同一性”可以使用BLASTP算法版本2.2.2(Altschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Jinghui Zhang，Zheng Zhang，Webb Miller和David J.Lipman(1997)，″Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs″，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)使用默認參數來確定。特別地，可以在互聯網上使用URL http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/來訪問BLAST算法。

術語“免疫應答”，當在本文中使用時，在一些實施方案中是指在主要組織相容性(MHC)分子將肽遞呈在細胞表面上后T細胞介導的免疫應答，并且特別地是指在肽的遞呈后的T細胞的激活。

術語“RAS蛋白”，當在本文中使用時，是指由ras原癌基因編碼的那類小GTP酶蛋白并且包括RAS蛋白的全部三種同種型：HRAS、KRAS和NRAS。在一些實施方案中，術語“RAS蛋白”是指對應于UniProtKB/Swiss-Prot登記號P01112.1并且如SEQ ID NO：23中所示的蛋白。

術語“RAS蛋白的位置13”，當在本文中使用時，是指從N端數起，形成野生型RAS蛋白的一級結構的氨基酸鏈中的第十三個氨基酸。

術語“RAS蛋白的位置12”，當在本文中使用時，是指從N端數起，形成野生型RAS蛋白的一級結構的氨基酸鏈中的第十二個氨基酸。

術語“對應于位置13的氨基酸”，當在本文中使用時，表示RAS蛋白的肽中的位于所述肽的氨基酸鏈中在對應于RAS蛋白的氨基酸序列的第十三個氨基酸(從N端數起)的位置處的氨基酸。術語“對應于位置12的氨基酸”具有相應的意義。

術語“RAS蛋白突變”，當在本文中使用時，是指在存在于取自受試者的樣品中的RAS蛋白中存在的一個或多個點突變。

術語“點突變”，當在本文中使用時，是指蛋白產物的多肽鏈中的單個氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基代替。

術語“一至三個點突變”，當在本文中使用時，意為一個點突變或兩個點突變或三個點突變。

術語，例如，“G12V突變”，當在本文中使用時，是指使得野生型RAS蛋白的位置12處的甘氨酸(G)被纈氨酸(V)代替的點突變。類似的定義適用于類似的術語，如G13C、G13R等。

術語“藥物組合物”，當在本文中使用時，表示適用于出于治療目的而向目標人或動物受試者施用的藥物制劑。

術語“抗代謝物化療劑”，當在本文中使用時，意為具有抑制患者的細胞生長或細胞分裂的效果并且用作癌癥的治療型治療的產品。

術語“吉西他濱”，當在本文中使用時，意為IUPAC名稱為4-氨基-1-(2-脫氧-2，2-二氟-β-D-紅-五呋喃糖基)嘧啶-2(1H)-酮的化合物，其具有以下結構式：

術語“其藥用鹽”，當在本文中使用時，意為通過允許游離形式化合物與酸或堿反應形成的鹽。藥用鹽的實例包括氫鹵酸鹽，如氫氟酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽和氫碘酸鹽；無機酸鹽，如鹽酸鹽、硝酸鹽、高氯酸鹽、硫酸鹽和磷酸鹽；低級烷磺酸鹽，如甲磺酸鹽、三氟甲磺酸鹽和乙磺酸鹽；芳基磺酸鹽，如苯磺酸鹽和對甲苯磺酸鹽；有機酸鹽，如乙酸鹽、蘋果酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、抗壞血酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽和馬來酸鹽；堿金屬鹽，如鈉鹽、鉀鹽和鋰鹽；堿土金屬鹽，如鈣鹽和鎂鹽；金屬鹽，如鋁鹽和鐵鹽；無機鹽，如銨鹽；胺鹽，包括有機鹽，如叔-辛基胺鹽、二苯甲基胺鹽、嗎啉鹽、葡糖胺鹽、苯基甘氨酸烷基酯鹽、乙二胺鹽、N-甲基葡糖胺鹽、胍鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽、二環己基胺鹽、N，N′-二苯甲基乙二胺鹽、氯普魯卡因鹽、普魯卡因鹽、二乙醇胺鹽、N-芐基苯乙胺鹽、哌嗪鹽、四甲基銨鹽、和三(羥甲基)氨基甲烷鹽；和氨基酸鹽，如甘氨酸鹽、賴氨酸鹽、精氨酸鹽、鳥氨酸鹽、谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽。

術語“順序施用”，當在本文中使用時，意為向患者施用兩種產品，其中所述兩種產品不同時施用。在一些實施方案中，順序施用的每個階段意為所述兩種產品間隔少于5天、4天、3天、2天或1分別施用。

附圖簡述

圖1是顯示在每名患者中記錄陽性DTH反應的時間點的表。¹DTH未評估；²NT：未治療。

圖2是顯示在誘導免疫應答的過程中，吉西他濱對DTH反應起作用后的協同輔助效果的圖表。

序列表簡述

SEQ ID NO：1顯示具有G13C突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：2顯示具有G13R突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3顯示具有G13D突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：4顯示具有G13V突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5顯示具有G13A突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6顯示具有G13S突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：7顯示具有G12A突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8顯示具有G12C突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：9顯示具有G12D突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10顯示具有G12R突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11顯示具有G12S突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：12顯示具有G12V突變的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：13顯示具有G13D突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：14顯示具有G12A突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：15顯示具有G12C突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：16顯示具有G12D突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：17顯示具有G12R突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：18顯示具有G12S突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：19顯示具有G12V突變的TG01和TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：20顯示具有G13C突變的TG02的RAS肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：21顯示具有G13R突變的RAS肽的備選氨基酸序列。

SEQ ID NO：22顯示具有G13V突變的RAS肽的備選氨基酸序列。

SEQ rD NO：23顯示野生型RAS蛋白的全長氨基酸序列。

發明詳述

在通常意義上，本發明涉及RAS蛋白的至少一種肽，其用于通過與抗代謝物化療劑同時或順序施用來治療癌癥。至少一種肽的每種肽具有RAS蛋白的一至三個點突變。

根據本發明使用的所述肽或每種肽可以是對應于HRAS、KRAS或NRAS中任一種的肽。這些RAS同種型中的所有三種共有在負責GDP/GTP結合的所有區域(即在癌癥中進行突變的區域)中的序列同一性。

在優選的實施方案中，所述一至三個點突變中的至少一個是對應于由RAS癌基因編碼的突變的點突變，例如在RAS蛋白的位置12，13或61處的點突變。

在一些實施方案中，所述肽或每種肽包含至少8個、至少9個、至少10個、至少12個、至少16個、至少17個、至少18個、至少20個、至少24個或至少30個氨基酸。在優選的實施方案中，所述至少一種肽或每種肽包含至少8個氨基酸。在其他優選的實施方案中，所述至少一種肽或每種肽包含至少17個氨基酸。

在一些實施方案中，所述肽或每種肽包含包括RAS蛋白的位置12或13的至少8個氨基酸殘基的區域。在優選的實施方案中，所述肽或每種肽的點突變在所述位置12或13的氨基酸殘基處。

在一些實施方案中，所述肽或每種肽在包含位置13的區域之外的位置與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少37％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些實施方案中，所述肽或每種肽在包含位置13的區域之外的位置與SEQ ID NOs 1-6中的一個具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在優選的實施方案中，所述肽或每種肽在包含位置13的區域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6中的一個具有至少95％的序列同一性。在其他實施方案中，所述肽或每種肽在包含位置13的區域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6中的一個具有100％的序列同一性。

在一些實施方案中，所述至少一種肽包含在包含位置13的區域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6中的一個具有百分比序列同一性的第一肽和在包含位置13的區域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6的另一個具有不同百分比序列同一性的第二肽。在其他實施方案中，第一肽在包含位置13的區域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6中的一個具有百分比序列同一性，并且第二肽在包含位置13的區域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6中的另一個具有相同的百分比序列同一性。在所有實施方案中，所述肽或每種肽能夠引發免疫應答。

上述實施方案中的至少一種肽的第一肽和第二肽中的每一個在RAS蛋白的位置13具有點突變，其中第一肽中的點突變不同于第二肽中的點突變。野生型RAS蛋白在位置13包含甘氨酸(G)。因此，位置13的突變可以是從甘氨酸到任何其他氨基酸的點突變。然而，已經發現G13A、G13C、G13D、G13R、G13S和G13V突變與癌癥特別相關。因此，在優選的實施方案中，所述肽或每種肽的點突變獨立地是G13A、G13C、G13D、G13R、G13S或G13V突變之一。在更優選的實施方案中，第一肽和第二肽之一在位置13處的點突變獨立地是G13C或G13D突變。在特別優選的實施方案中，第一肽或第二肽之一在位置13處的點突變是G13C突變。在其他特別優選的實施方案中，第一肽或第二肽之一在位置13處的點突變是G13D突變。

在一些實施方案中，第一肽或第二肽在位置13處的點突變是G13C突變，并且另一種肽在位置13處的點突變是G13D突變。

在其他實施方案中，第一肽或第二肽在位置13處的點突變是G13R突變，并且另一種肽在位置13處的點突變是G13V突變。

在一些實施方案中，存在兩種以上RAS蛋白的肽，其具有RAS蛋白的一至三個點突變，其用在通過與抗代謝物化療劑同時或順序施用治療癌癥的方法中。第二肽或更多的肽中的每個獨立地包含至少8個、至少9個、至少10個、至少12個、至少16個、至少17個、至少18個、至少20個、至少24個或至少30個氨基酸。在優選的實施方案中，每種肽包含至少8個氨基酸。在其他優選的實施方案中，每種肽包含至少17個氨基酸。在進一步的實施方案中，每種肽包含至少18個氨基酸。通常，肽混合物中的每種肽可以包含與一種或多種其他肽不同數量的氨基酸。每種肽具有至少一個不同于其他一種或多種肽的點突變。

在本發明的備選實施方案中，所述至少一種肽可以包括RAS蛋白的至少第三肽，其包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域。所述至少第三肽可以在對應于RAS蛋白的位置13的氨基酸處具有點突變，該點突變不于第一和第二肽的位置13的突變。所述點突變可以是G13A、G13C、G13D、G13R、G13S或G13V突變中的一個，獨立于第一和第二肽的點突變。

本發明的至少一種肽可以另外包括RAS蛋白的至少一種其他肽，其包含至少8個氨基酸的區域。在一些實施方案中，所述至少一種其他肽的所述區域包括RAS蛋白的位置12。

在至少一種肽包括至少第三肽的實施方案中，每種肽獨立地包含至少8個、至少9個、至少10個、至少12個、至少16個、至少17個、至少18個、至少20個、至少24個或至少30個氨基酸。在優選的實施方案中，每種肽包含至少8個氨基酸。在其他優選的實施方案中，每種肽包含至少17個氨基酸。在進一步的實施方案中，每種肽包含至少18個氨基酸。通常，所述至少一種肽中的每種肽可以包含與所述至少肽中的一種以上其他肽不同數量的氨基酸。

在至少一種肽包括至少一種包含包括RAS蛋白的位置12的區域的肽的實施方案中，對應于RAS蛋白的位置12的氨基酸具有點突變。在野生型RAS蛋白中，位置12的氨基酸是甘氨酸(G)。因此，在一些實施方案中，位置12處的點突變可以是除甘氨酸之外的氨基酸。在一些實施方案中，每個突變獨立地是G12A、G12C、G12D、G12R、G12S或G12V突變。在其他實施方案中，所述至少一種其他肽在包含位置12的區域之外的位置處與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些實施方案中，所述至少一種肽在包含位置12的區域之外的位置處與SEQ ID NO：7-12之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些實施方案中，存在多于一種RAS蛋白的肽，其包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個氨基酸的區域，并且在對應于RAS蛋白的位置12的氨基酸處具有點突變。在所述實施方案中，每種具有位置12非突變的肽具有不同的點突變。

在一些實施方案中，所述至少一種肽包括至少兩種RAS蛋白的肽，每種包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個氨基酸的區域。位置12處的點突變可以是G12A、G12C、G12D、G12R、G12S或G12V突變之一。包括RAS蛋白的位置12的至少兩種肽可以在包含位置12的區域之外的位置與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些實施方案中，包含包括位置12的至少8個氨基酸的區域的至少兩種肽在包含位置12的區域之外的位置處與SEQ ID NOs：7-12和14-19之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在所述至少一種肽中設想上述突變和SEQ ID Nos的任意組合，用于本發明所述的應用。

在一些實施方案中，所述至少一種肽由下述組成：具有G13D突變的肽，具有G12A突變的肽，具有G12C突變的肽，具有G12D突變的肽，具有G12R突變的肽，具有G12S突變的肽，和具有G12V突變的肽。在所述實施方案中，所述至少一種肽獨立地在包含位置12或13的區域之外的位置分別與SEQ ID NOs：3，7，8，9，10，11和12具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些實施方案中，所述肽混合物由獨立地在包含位置12或13的區域之外的位置分別與SEQ ID NOs：13-19具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性的肽組成。在與SEQ ID NOs：13-19具有100％的序列同一性時，本發明的該實施方案在本文中稱為TG01。表3顯示優選存在于TG01中的肽。

在一些實施方案中，所述至少一種肽由下述組成：具有G13C突變的肽，具有G13D突變的肽，具有G12A突變的肽，具有G12C突變的肽，具有G12D突變的肽，具有G12R突變的肽，具有G12S突變的肽，和具有G12V突變的肽。在所述實施方案中，所述至少一種肽獨立地在包含位置12或13的區域之外的位置分別與SEQ ID NOs：1，3，7，8，9，10，11和12具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。在一些實施方案中，所述肽混合物由獨立地在包含位置12或13的區域之外的位置分別與SEQ ID NOs：13-20具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性的肽組成。在與SEQ ID NOs：13-20具有100％的序列同一性時，本發明的該實施方案在本文中稱為TG02。表4顯示優選存在于TG02中的肽。

通常，根據本發明使用的所述至少一種肽或每種肽，在包括位置12或13的8個氨基酸的區域內，分別在位置12或13的殘基之外具有與RAS蛋白的相應區域相同的至少6個氨基酸殘基。此外，通常，根據本發明使用的所述至少一種肽或每種肽，在包括RAS蛋白的位置12或13的區域之外的位置分別與SEQ ID NOs：1-20之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。

在一些實施方案中，所述至少一種肽由第一、第二、第三和第四肽組成。第一和第二肽各自在RAS蛋白的位置13處具有點突變，其中第一肽中的點突變不同于第二肽中的點突變。第一和第二肽中的每種的點突變獨立地是G13A、G13C、G13D、G13R、G13S或G13V突變之一。第三和第四肽中的每種包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域，并且第三和第四肽中的每一個獨立地在包括位置13的區域之外的位置與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。第三和第四肽中的每種可以獨立地在包括位置13的區域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6，20，13，21或22中的一個具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。第三和第四肽中的每種在對應于RAS肽的位置13的氨基酸處具有點突變，并且第一、第二、第三和第四肽中的每種具有與其他肽的點突變不同的點突變。在一個實施方案中，第一肽是具有G13R突變的肽，第二肽是具有G13A突變的肽，第三肽是具有G13S突變的肽，并且第四肽是具有G13V突變的肽。

在一些實施方案中，所述至少一種肽由最多8種不同肽組成。在其他實施方案中，存在最多10、12、14或16種不同的肽。在包含多于一種肽的實施方案中，所述至少一種肽可以包含1、2、3、4、5或6種包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個氨基酸殘基的區域的肽。在包含多于一種肽的其他實施方案中，所述至少一種肽可以包含1、2、3、4、5或6種包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸殘基的區域的肽。在進一步的實施方案中，所述至少一種肽包括1、2、3、4、5或6種獨立地包含包括RAS蛋白的位置12或13的至少8個氨基酸殘基的區域的肽。

在一些實施方案中，所述包含包括RAS肽的位置13的至少8個氨基酸的區域的肽或每種包含包括RAS肽的位置13的至少8個氨基酸的區域的肽包含RAS蛋白的位置1至30。在備選實施方案中，所述包含包括RAS肽的位置13的至少8個氨基酸的區域的肽或每個包含包括RAS肽的位置13的至少8個氨基酸的區域的肽包含RAS蛋白的位置5至21。在進一步的實施方案中，對應于RAS蛋白的位置13的氨基酸在每個肽的C-末端。在進一步的實施方案中，對應于RAS蛋白的位置13的氨基酸在所述肽或每種肽的N-末端。通常，具有包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域可以由RAS蛋白的包括位置13的任意8個位置組成。例如，具有包括位置13的至少8個氨基酸的區域可以由RAS蛋白的位置6至位置13、位置7至位置14、位置8至位置15、位置9至位置16、位置10至位置17、位置11至位置18、位置12至位置19或位置13至位置20的氨基酸組成。

在一些實施方案中，包含包括RAS肽的位置12的至少8個氨基酸的區域的肽包含RAS蛋白的位置1至30。在其他實施方案中，包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個氨基酸的區域的肽包含RAS蛋白的位置5至21。在備選實施方案中，對應于RAS蛋白的位置12的氨基酸在肽的C-末端。在進一步的實施方案中，對應于RAS蛋白的位置12的氨基酸在肽的N-末端。通常，具有包括RAS蛋白的位置12的至少8個氨基酸的區域可以由RAS蛋白的包括位置12的任意8個位置組成。例如，具有包括位置12的至少8個氨基酸的區域可以由RAS蛋白的位置5至位置12、位置6至位置13、位置7至位置14、位置8至位置15、位置9至位置16、位置10至位置17、位置11至位置18或位置12至位置19的氨基酸組成。

在包括多于一種肽的實施方案中，所述多于一種肽可以包括相同或不同比例的不同肽。例如，在由第一和第二肽組成的實施方案中，第一和第二肽以相同比例使用，即每種肽占使用的肽的50％。在其他實施方案中，第一肽的比例大于第二肽的比例。例如，第一肽可以占使用的肽的至少55％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％。在備選實施方案中，使用比第一肽大的第二肽的比例。例如，第二肽可以占使用的肽的至少55％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％。在其中使用多于兩種肽的實施方案中，肽可以以彼此相同或不同的比例使用。例如，每種肽可以獨立地占使用的肽的至少1％，至少5％，至少10％，至少20％至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少60％，至少70％，至少80％或至少90％。

備選實施方案包括包含至少五種RAS蛋白的肽的至少一種肽，其中五種肽中的每種包含包括RAS肽的位置13的至少8個氨基酸的區域。至少五種肽中的每種獨立地在包括位置13的區域之外的位置與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性，和/或獨立地在包括位置13的區域之外的位置與SEQ ID NOs：1-6，13，20，21和22中的一個具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。所述至少五種肽中的每種在對應于RAS蛋白的位置13的氨基酸處具有點突變，所述點突變獨立地選自G13A，G13C，G13D，G13R，G13S或G13V突變，并且每種肽的點突變不同于其他肽的點突變。

在另一實施方案中，適于誘導免疫應答的至少一種肽由六種RAS蛋白的肽組成，其中每種肽包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個氨基酸的區域。每種肽獨立地在包括位置12的區域之外的位置與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性，和/或獨立地在包括位置12的區域之外的位置與SEQ ID NOs：7-12和14-19之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。每種肽在對應于RAS蛋白的位置12的氨基酸處具有點突變，所述點突變選自G12A，G12C，G12D，G12R，G12S或G12V突變，并且每種肽的點突變不同于其他肽的點突變。

在進一步的實施方案中，適于引發免疫應答的所述至少一種肽由RAS蛋白的第一、第二、第三和第四肽組成，其中第一、第二和第三肽中的每種包含包括RAS蛋白的位置12的至少8個氨基酸的區域，并且RAS蛋白的第四肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域。第一、第二、第三和第四肽的每種獨立地在包括位置12或13的區域之外的位置分別與RAS蛋白具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性，和/或獨立地在包括位置12或13的區域之外的位置處分別與SEQ ID NOs：7-12，14-19，1-6，13，20，21和22之一具有至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少66％、至少75％、至少85％、至少95％、至少99％或100％的序列同一性。第一、第二、第三和第四肽中的每種在對應于RAS蛋白的所述位置12或13的氨基酸處分別具有點突變。在一些實施方案中，第一肽是具有G12A突變的肽，第二肽是具有G12R突變的肽，第三肽是具有G12S突變的肽，并且第四肽是具有G13C突的肽變。

根據本發明使用的至少一種肽是對應于由MHC II分子展示在細胞表面上的RAS蛋白片段的肽。因此，根據本發明使用的至少一種肽是這樣的肽：其對應于由細胞內蛋白水解RAS蛋白得到的蛋白片段，其隨后可以展示在HLA分子上，并且個體通常在其T細胞庫中具有對其有反應性的T細胞。

在本發明的進一步的方面，提供至少一種T-細胞，或包含所述T-細胞的T-細胞制劑，所述T-細胞對當呈遞在MHC分子上時的上文所述的至少一種肽特異，其用于通過與抗代謝物化療劑同時或順序施用來治療癌癥。所述至少一種T-細胞可以通過用RAS蛋白的至少一種肽刺激至少一種反應性T-細胞產生。例如，在一個實施方案中，所述至少一種T-細胞包含多種T-細胞，其中第一和第二T-細胞分別對對應于RAS蛋白的片段的第一和第二肽特異，其中每種肽包含包括RAS蛋白的位置13的至少8個氨基酸的區域，其中第一和第二T-細胞中的每種對肽的對應于所述位置13的氨基酸的點突變特異，并且第一T-細胞特異針對的點突變不同于第二T-細胞特異針對的點突變。在另一個實施方案中，例如，所述至少一種T-細胞包含多種對對應于RAS蛋白的片段的肽特異的T-細胞，其中所述肽包含包括RAS肽的位置13的至少8個氨基酸的區域，其中每種T-細胞對肽的對應于所述位置13的氨基酸處的點突變特異。

上文所述至少一種肽、至少一種T-細胞和T-細胞制劑用于治療癌癥，并且與抗代謝物化療劑同時或順序施用。在一些實施方案中，所述抗代謝物化療劑是嘧啶類似物，或其藥用鹽。在優選的實施方案中，所述抗代謝物化療劑是吉西他濱或其藥用鹽。在一些實施方案中，吉西他濱的藥用鹽是吉西他濱鹽酸鹽。

根據本發明使用的至少一種肽、至少一種T-細胞或T-細胞制劑用于治療癌癥。在一些實施方案中，所述癌癥是由于RAS蛋白中的突變，尤其是對應于所施用的一種或多種肽中的點突變的突變引起的癌癥。在一些實施方案中，癌癥是非小細胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、卵巢癌和乳腺癌中的一種或多種。在優選的實施方案中，所述癌癥是胰腺癌。在更優選的實施方案中，所述癌癥是切除的胰腺癌。在一些實施方案中，所述至少一種肽包括具有G13C點突變的肽，所述至少一種T-細胞對具有G13C突變的肽特異，或所述T-細胞制劑包含對具有G13C突變的肽特異的T-細胞，并且用于通過與抗代謝物化療劑同時或順序施用治療癌癥。在所述實施方案中，優選所述癌癥是胰腺癌。在另一實施方案中，所述至少一種肽包括具有G13D突變的肽，所述至少一種T-細胞對具有G13D突變的肽特異，或所述T-細胞制劑包含對具有G13D突變的肽特異的T-細胞，并且用于通過與抗代謝物化療劑同時或順序施用治療癌癥。尤其是，已經發現，與單獨施用肽疫苗相比，通過按照以下劑量方案同時或順序施用至少一種肽治療癌癥顯著改善針對至少一種肽的免疫應答：第1周：僅肽；第2周-僅肽；第3周-僅肽；第4周-肽和抗代謝物化療劑；第5周-僅抗代謝物化療劑；第6周-肽和抗代謝物化療劑；第7周-無治療；和第8周-肽和抗代謝物化療劑。

還提供包含上文所述的至少一種肽、至少一種T-細胞或T-細胞制劑的藥物組合物，其用于本發明所述的應用。所述藥物組合物還可以包含至少一種藥用載體、稀釋劑和/或賦形劑。在一些實施方案中，所述藥物組合物還包含一種以上另外的活性成分和/或佐劑。在某些實施方案中，所述藥物組合物還可以包含一種以上對同一疾病適應癥治療有效的成分。在一些實施方案中，所述藥物組合物還包含粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。

在一些實施方案中，抗代謝物化療劑與所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物一起同時施用。因此，在所述實施方案中，抗代謝物化療劑與所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物同時施用。

在其他實施方案中，抗代謝物化療劑與所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物順序施用。在一些實施方案中，施用所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物，并且接著施用抗代謝物化療劑。在一些實施方案中，在順序施用的每個階段中，抗代謝物化療劑在所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物的6小時內施用。在其他實施方案中，在順序施用的每個階段中，抗代謝物化療劑在所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物的12小時內施用。在進一步的實施方案中，在順序施用的每個階段中，抗代謝物化療劑在所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物的18小時內施用。在進一步的實施方案中，在順序施用的每個階段中，抗代謝物化療劑在所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物的24小時內施用。在優選的實施方案中，在順序施用的每個階段中，抗代謝物化療劑在施用所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物之后24小時立即施用。

在一些實施方案中，所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物和抗代謝物化療劑多于一次同時或順序施用給同一患者。在一些實施方案中，所述至少一種肽和抗代謝物化療劑施用至少兩次(即以至少兩個階段)。在其他實施方案中，所述至少一種肽和抗代謝物化療劑施用至少三次(即以至少三個階段)。在進一步的實施方案中，所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物和抗代謝物化療劑施用多于三次(即以多于三個階段)。在一些實施方案中，施用所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物和抗代謝物化療劑的每個階段間隔至少一周。在其他實施方案中，施用所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物和抗代謝物化療劑的每個階段間隔至少兩周。在一些實施方案中，施用的每個階段間隔多于兩周。

在一些實施方案中，抗代謝物化療劑在與本發明的至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物同時或順序施用之前或之后，單獨施用一次或多次。在其他實施方案中，所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物在與抗代謝物化療劑同時或順序施用之前或之后單獨施用一次或多次。

因此，在一些實施方案中，相對于所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物的第一次施用，抗代謝物化療劑的第一次施用延遲。在一些實施方案中，抗代謝物化療劑的第一次施用是在所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物的第一次施用后至少一周進行。在其他實施方案中，抗代謝物化療劑的第一次施用是在所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物的第一次施用之后至少兩周進行。在進一步的實施方案中，抗代謝物化療劑的第一次施用是在所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物的第一次施用之后至少三周進行。在特別優選的實施方案中，盡管在所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物中的每種和抗代謝物化療劑的第一次施用之間有延遲，抗代謝物化療劑在施用所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物的24小時內施用。尤其是，已經發現，所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物的第一次施用和抗代謝物化療劑的第一次施用之間三周的延遲對記錄的免疫應答有顯著影響。

在一些實施方案中，其中所述癌癥是切除的胰腺癌，抗代謝物化療劑的第一次施用是在手術切除胰腺癌后12周以內。在一些實施方案中，第一次施用是在手術切除胰腺癌后10周以內。在其他實施方案中，抗代謝物化療劑的第一次施用是在手術切除胰腺癌后8周以內。

根據本發明使用的所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物可以通過本領域技術人員已知的任何合適的遞送技術施用給受試者。例如，其他技術中，所述至少一種肽、至少一種T-細胞、T-細胞制劑或藥物組合物可以以溶液的形式、脂質體的形式或干燥形式(例如，以包衣顆粒的形式等)通過注射施用給受試者。在一些實施方案中，所述至少一種肽或藥物組合物以每劑量0.01mg至10mg的至少一種肽的量施用。在其他實施方案中，所述至少一種肽或藥物組合物以每劑量0.1mg至2mg的至少一種肽的量施用。在一些實施方案中，所述至少一種肽或藥物組合物以每劑量0.1mg的至少一種肽的量施用。在另一個實施方案中，所述至少一種肽或藥物組合物以每劑量0.7mg的至少一種肽的量施用。劑量取決于施用給患者的不同肽的數量。例如，當所述至少一種肽僅由一種類型的點突變組成，則所述至少一種肽或藥物組合物優選以每劑量0.1mg的至少一種肽的量施用。在另一個實例中，當至少一種肽包括七種以上類型的點突變時，所述至少一種肽或藥物組合物優選以每劑量0.7mg的至少一種肽的量施用。

在一些實施方案中，所述至少一種T-細胞或T-細胞制劑以靜脈內注射和/或輸注施用，并且以例如10⁶至10¹²個每種對本發明的肽特異的T-細胞的量施用。

抗代謝物化療劑可以以本領域技術人員已知的任何遞送技術施用給受試者。例如，在一些實施方案中，抗代謝物化療劑通過套管、中線(central line)或通過外周插入的中心導管施用。在一些實施方案中，抗代謝物化療劑以100至10,000mg/m²體表面積的量施用。在一些實施方案中，抗代謝物化療劑以500至2000mg/m²體表面積的量施用。在其他實施方案中，抗代謝物化療劑以1000mg/m²體表面積的量施用。

在本發明的進一步實施方案中，提供包含以下各項的試劑盒：包含上文所述的至少一種肽、T細胞或藥物組合物的第一產品，和提供如上文所述的抗代謝物化療劑的供應的第二產品。以分開的小瓶和隔室提供第一和第二產品。在一些實施方案中，所述試劑盒還包含用于施用第一和第二產品的說明書。

表

表1.SEQ ID NOs：1-6的位置13突變的RAS肽

表2.SEQ ID NOs：7-12的位置12突變的RAS肽

表3.TG01中含有的SEQ ID NOs：13-19的肽

表4.TG02中含有的SEQ ID NOs：13-20的肽

實施例

實施例1

進行I/II期試驗以研究對切除的胰腺癌用單獨的RAS肽疫苗接種(TG01)以及隨后與吉西他濱輔助化療聯合的輔助治療的安全性和免疫學反應。

患者在手術后1-8周內接受TG01連同免疫調節劑，GM-CSF。在TG01/GM-CSF治療開始后3-7周，患者也接受吉西他濱。在接受至少一個周期的吉西他濱后第11周對患者評估安全性和免疫應答。

最初，將六名患者用TG01和GM-CSF處理，并且在第11周，如下文列出的，利用安全性和免疫應答評估怎樣繼續研究。

在第11周，如果：

-6名患者中有0名顯示免疫應答，和/或6名患者中有3名顯示劑量限制性毒性(DLT)，將終止研究，

-6名患者中有1-3名顯示免疫應答和/或6名患者中有3名顯示DLT，則將招募另外6名患者進入研究中，

-6名患者中有4名以上顯示免疫應答和/或6名患者中有2名以下顯示DLT，則起始II期研究。

決定的是，如果I期招募擴展到12名患者，則在第11周，如果：

-12名患者中有少于4名顯示免疫應答和/或12名患者中多于4名顯示DLT，則將終止研究，

-12名患者中有4名以上顯示免疫應答和/或12名患者中有4名以下顯示DLT，將起始II期研究。

因此，如果：

a)在第11周，6名患者中有4名以上顯示免疫應答并且6名患者中有2名以下顯示DLT，或

b)在第11周，12名患者中有4名以上顯示免疫應答并且12名患者中有4名以下顯示DLT，

則將起始II期研究。

試驗治療的準備

在2R玻璃小瓶中提供TG01，包含2.1mg的TG01，并且將一個TG01小瓶中的內容物溶解在0.3mL無菌水中用于注射(7mg/mL)。在重構后6小時內使用溶液。

在小瓶中提供GM-CSF，含有0.1mg，并且將一瓶中的內容無溶解在0.33mL無菌水中用于注射(0.30mg/mL)。在重構后6小時內使用溶液。

吉西他濱以1000mg/m²的劑量施用。藥物提供在200mg和1g的小瓶中，用于在要通過靜脈內注射給予的鹽水中重構。

對于DTH，將一個TG01小瓶中的內容物溶解在0.3mL無菌水中用于注射。在重構后6小時內使用溶液。

TG01和GM-CSF劑量和施用

在第1，3，5，8，15，22天和每2周給予TG01和GM-CSF，直到化療結束(第1天定義為TG01治療的第一天，其是在手術后1-8周)?；熃Y束后，在未表現出復發和/或在研究治療期間具有陽性免疫應答的患者中，每4周給予進一步的加強注射，直到第52周，然后每12周給予加強注射，持續至多2年，或直到同意終止或有毒性(取最早的那個)。

TG01劑量是0.70mg(在水中以7mg/mL重構的TG01溶液的0.10mL注射液用于注射)。GM-CSF劑量是0.03mg(-在水中以0.3mg/mL重構的GM-CSF溶液的0.10mL注射液用于注射)。

將兩種研究藥物通過皮內注射施用至上臂的背側，在注射TG01之前10-15分鐘施用GM-CSF。

化療劑量和施用

患者在開始TG01和GM-CSF(起始治療期的第22，36或50天)之后至少3周(但不晚于自手術日起12周)開始接受吉西他濱。將TG01和GM-CSF的首次劑量日視為化療治療期的第1天。在四周周期的第1、8和15天以1000mg/m²靜脈內給予吉西他濱歷時30分鐘，總共六個周期。

DTH劑量和施用

在第1，8，15，22，36，50和64天在對側臂下部區域給予TG01。

在治療日制備DTH-測試劑量，并且是0.10mL的以7mg/mL水的TG01，用于注射溶液，制備用于以無菌注射器皮內注射。

化療劑量標準

吉西他濱：

在施用吉西他濱之前，在每個新的治療周期開始時，評估患者以保證他們滿足產品制造商的吉西他濱的處方信息。

結果和討論

研究從6名患者擴展到9名患者，并且從中獲得的結果在下文討論。

到第11周，在所有9名受試者中都發現TG01-特異性免疫應答，并且未報道DLT。

安全性特性如對于胰腺手術后接受化療的患者所預期的。存在被認為與單獨的TG01/GM-CSF相關的一個副作用事件，其是注射位點反應。一名患者經歷三個與TG01/GM-CSF和吉西他濱相關的事件(惡心、嘔吐和流感樣癥狀)。與吉西他濱相關的不良事件如對于3/4級嗜中性白血球減少癥(neutropenia)(其是主要相關的不良事件)所預期的。在這些情況下需要中斷或減少吉西他濱劑量。

在兩名患者中報道了四種嚴重的不良事件。一名患者經歷肺部感染和兩次發燒，都認為與吉西他濱相關。一名患者經歷惡心，也被認為與利用TG01和吉西他濱的治療無關。

根據在基線處(第1周)無DTH反應，在第3周結束時起始吉西他濱之前，四名患者(44％)產生DTH反應(圖1和2)。在第一周期的吉西他濱(第6周)之后，這增加至七名患者(77％)具有DTH陽性，并且在第二周期(第8周)的首次吉西他濱劑量后，增加至所有九名患者(100％)(圖1和2)。這表明，在第8周在用TG01和吉西他濱共同治療后，在所有患者中誘導了Th1極化的針對TG01的應答。

還發現，對已建立的免疫應答沒有降低或消除，從而誘導的免疫應答持續(圖2)。的確，在第二周期(第8周)中施用TG01和吉西他濱二者之后顯示免疫應答的患者數量顯著大于單獨施用TG01時的患者數量(圖2)。

這些結果表明以下預料不到的研究結果：TG01和吉西他濱的組合在癌癥患者中有效誘導免疫應答，并且誘導的免疫應答是強烈的。尤其是，用于使研究繼續到II期的算法(即在第11周，如果6名患者中有4名以上顯示免疫應答和/或6名患者中有2名以下顯示DLT，則將開始II期研究)表明，預期是可能50％的患者將在第11周顯示免疫應答。因此，所有在第11周顯示具有免疫應答的患者對于研究的設計者是出乎意料的。