本發明涉及檢測人FGFR3基因突變的引物組及其試劑盒，屬于遺傳性骨病基因檢測技術領域。

背景技術：

成纖維細胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3，FGFR3)屬于酪氨酸蛋白激酶型受體，其親和力很高。FGFR3主要是由三部分構成，細胞內的酪氨酸蛋白激酶活性結構域、疏水氨基酸組成的跨膜結構域及細胞外3個免疫球蛋白樣重復序列組組成的結構域，分別稱為Loop I、Loop II與Loop III。LoopII與LoopIII構成了FGF配基的結合位點。在LoopI與LoopII之間含有一段酸性的、富含絲氨酸的區域，是FGFRs統一的保守結構。FGFR3在腦、肺、脊索以及軟骨中表達，主要調控軟骨細胞生長，進而限定長骨的長度。對角質形成細胞、黑素細胞、上皮細胞、淋巴細胞和精母細胞等同樣有作用。FGFR3結合的配基有FGF1、FGF2、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9、FGF17～20等。

FGFR3基因突變會導致皮膚過度生長疾病表皮痣與脂溢性角化病；各種形式的腫瘤，如多發性骨髓瘤、膀胱癌、宮頸癌與精原細胞瘤等。故FGFR3可促進癌細胞增殖與存活，被看做癌基因。FGFR3基因突變是人類軟骨發育不良(Achondroplasia，ACD)、CATSHL綜合征(camptodactyly,tall stature,scoliosis,and hearing loss)、軟骨發育低下(hypochondroplasia,HCD)、軟骨發育低下樣發育不全(Hypochondroplasia-like dysplasias)、嚴重軟骨發育不良伴發育遲緩和黑棘皮癥(Severe achondroplasia with developmental delay and acanthosisnigricans(SADDAN))、I型與II型致死性發育不良(Thanatophoric dysplasia type 1,2,TD1,2)等遺傳性疾病的致病基因。

FGFR3突變根據突變位置的不同，存在不同的機制。軟骨發育不良G380R氨基酸替代導致在兩個精氨酸側鏈間形成氫鍵，以不依賴配基的方式，增強了FGFR3二聚體的穩定性。是最常見侏儒癥的遺傳形式。I型TD Y373C與R248C堿基替代分別位于近膜結構域、或兩Ig結構域連接區域，通過在半胱氨酸殘基間形成二硫鍵，而激活FGFR3。胞內酪氨酸激酶區域突變如，K650M(TDI)或K650E(TDII),能夠模擬酪氨酸激酶結構域的構象變化，誘導配基介導FGFR3二聚體化及其自身磷酸化反應。故對于FGFR3基因突變及其突變位置與突變類型的檢測，對于臨床疾病的輔助確診與產前診斷等意義重大。

技術實現要素：

本發明針對現有技術的不足，提供檢測人FGFR3基因突變的引物組及其試劑盒。

本發明的技術方案如下：

檢測人FGFR3基因突變的引物組，該引物組包括12對特異性擴增FGFR3基因第2至第7外顯子以及第9至第19外顯子的引物；

所述的FGFR3基因外顯子2的PCR擴增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的引物FP1與核苷酸序如SEQ ID NO.2所示的引物RP1；

所述的FGFR3基因外顯子3的PCR擴增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的引物FP2與核苷酸序如SEQ ID NO.4所示的引物RP2；

所述的FGFR3基因外顯子4的PCR擴增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的引物FP3與核苷酸序如SEQ ID NO.6所示的引物RP3；

所述的FGFR3基因外顯子5與外顯子6的PCR擴增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物FP4與核苷酸序如SEQ ID NO.8所示的引物RP4；

所述的FGFR3基因外顯子7的PCR擴增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物FP5與核苷酸序如SEQ ID NO.10所示的引物RP5；

所述的FGFR3基因外顯子9的PCR擴增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的引物FP6與核苷酸序如SEQ ID NO.12所示的引物RP6；

所述的FGFR3基因外顯子10的PCR擴增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的引物FP7與核苷酸序如SEQ ID NO.14所示的引物RP7；

所述的FGFR3基因外顯子11的PCR擴增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示的引物FP8與核苷酸序如SEQ ID NO.16所示的引物RP8；

所述的FGFR3基因外顯子12與外顯子13的PCR擴增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的引物FP9與核苷酸序如SEQ ID NO.18所示的引物RP9；

所述的FGFR3基因外顯子14與外顯子15的PCR擴增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示的引物FP10與核苷酸序如SEQ ID NO.20所示的引物RP10；

所述的FGFR3基因外顯子16與外顯子17的PCR擴增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示的引物FP11與核苷酸序如SEQ ID NO.22所示的引物RP11；

所述的FGFR3基因外顯子18與外顯子19的PCR擴增引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示的引物FP12與核苷酸序如SEQ ID NO.24所示的引物RP12。

一種用于檢測FGFR3基因突變的測序引物組，該引物組包括12條第2至第7外顯子以及第9至第19外顯子的測序引物；包括：

外顯子2的PCR測序引物核苷酸序列為SEQ ID NO.1的引物FP1；

外顯子3的PCR測序引物核苷酸序列為SEQ ID NO.3的引物FP2；

外顯子4的PCR測序引物核苷酸序列為SEQ ID NO.5的引物FP3；

外顯子5與外顯子6的PCR測序引物核苷酸序列為SEQ ID NO.7的引物FP4；

外顯子7的PCR測序引物核苷酸序列為SEQ ID NO.9的引物FP5；

外顯子9的PCR測序引物核苷酸序列為SEQ ID NO.11的引物FP6；

外顯子10的PCR測序引物核苷酸序列為SEQ ID NO.14的引物RP7；

外顯子11的PCR測序引物核苷酸序列為SEQ ID NO.15的引物FP8；

外顯子12與外顯子13的PCR測序引物核苷酸序列為SEQ ID NO.17的引物FP9；

外顯子14與外顯子15的PCR測序引物核苷酸序列為SEQ ID NO.19的引物FP10；

外顯子16與外顯子17的PCR測序引物核苷酸序列為SEQ ID NO.21的引物FP11；

外顯子18與外顯子19的PCR測序引物核苷酸序列為SEQ ID NO.24的引物RP14。

一種用于檢測FGFR3基因突變的試劑盒，包括：

上述用于檢測FGFR3基因突變的由第2至第7外顯子以及第9至第19外顯子的PCR擴增引物組成的引物組；

PCR擴增試劑；

PCR產物純化試劑；

含有上述用于檢測FGFR3基因突變的測序引物組的DNA測序試劑。

根據本發明優選的，所述PCR擴增試劑包括：2.5mM dNTP，含Mg²⁺的10×PCR緩沖液，5U/μl Taq DNA聚合酶，去RNase與DNase水；

所述PCR擴增體系中各組分的工作濃度為：200μM dNTP，1×PCR緩沖液，0.025U/μl Taq DNA聚合酶，上游引物和下游引物均為0.4μM，模板濃度為2.5～5ng/μl。

根據本發明優選的，所述PCR產物純化試劑包括：1U/μl SAP酶、10U/μl ExoI酶、去RNase與DNase水；

PCR產物純化體系中各組分的工作濃度為：0.05U/μl SAP酶、0.5U/μl ExoI酶。

根據本發明優選的，所述DNA測序試劑包括：上述用于檢測FGFR3基因突變的測序引物組、BigDye 3.1混合液、0.125M EDTA溶液、無水乙醇、體積百分比75％乙醇溶液、Hi-Di甲酰胺溶液、去RNase與DNase水。

根據本發明進一步優選的，所述測序引物中的測序引物的工作濃度為0.64pMol/L。

有益效果

1、本發明采用特異性引物組，針對FGFR3基因的第2至第7外顯子以及第9至第19外顯子進行突變檢測，確保了測定結果的準確性與特異性。與傳統的單一突變位點的檢測而言，擴大了檢測突變范圍至FGFR3外顯子區所有位點，覆蓋已報道的突變位點與可能的突變位點。與傳統的通過熒光定量PCR采用探針法檢測相比，降低了檢測成本，同時PCR產物通過DNA序列測定以及后續序列比對完成，其準確性要高于熒光定量PCR。與高通量測序相比較，直接對FGFR3致病基因進行檢測，避免了高通量測序中因原始數據篩選、閾值設定等問題而可能出現的假陽性與假陰性問題；

2、本發明所涉及的每對引物的PCR擴增與DNA測序條件完全一致，可以同時進行擴增測序，極大降低了檢測過程的工作量；

3、本發明提供的FGFR3基因突變組及其檢測試劑盒可用于FGFR3基因突變所導致的遺傳性疾病CATSHL綜合征、軟骨發育低下、軟骨發育不全、SADDAN發育不全、致死性骨發育不全、仙臺類型的短肢致死性骨發育不全等的基因突變檢測，進而輔助臨床確診該類疾病，同時還為研究COMP基因突變與基因功能之間的關系以及基因型與表型之間的相互關系奠定基礎。

附圖說明

圖1為對11例軟骨發育不全患者基因檢測結果；

其中：A、8例患者存在1138G>GA雜合突變，該突變導致氨基酸殘基380位甘氨酸由精氨酸替代的檢測結果圖；

B、1例患者存在1388C>CT雜合突變，該突變導致450位蘇氨酸由甲硫氨酸替代的檢測結果圖；

C、1例患者存在1620C>CG雜合突變，該突變引起540位點天冬氨酸被賴氨酸所替代的檢測結果圖；

D、1例患者存在1620C>CA雜合突變，該突變引起540位點天冬氨酸被賴氨酸所替代的檢測結果圖。

具體實施方式

為詳細說明本發明的技術內容、所實現的目的及效果，具體實施方式說明如下。

試劑來源

全血基因組DNA提取試劑盒購自Omega公司；

2.5mM dNTP混合物、5U/μl Taq DNA聚合酶、10×PCR反應緩沖液均來自TakaRa公司；

1U/μl SAP與10U/μl ExoI購自NEB公司；

BigDye 3.1測序溶液、Na₂EDTA﹒2H₂0、去RNase與DNase水與Hi-Di甲酰胺均購自ThermoFisher Scientific公司；

無水乙醇購自國藥集團；

瓊脂糖為西班牙進口；引物由華大基因合成。

實施例1

根據NCBI GeneBank數據庫分析FGFR3基因mRNA序列，進行第2到第19外顯子擴增引物的設計。擴增區域包括FGFR3全部外顯子及其外顯子與內含子交界處不少于50bp的內含子序列。PCR擴增中所采用引物核苷酸序列如表1所示。

表1

實施例2

一種用于檢測FGFR3基因突變的試劑盒，包括：

上述用于檢測FGFR3基因突變的由第2至第7外顯子以及第9至第19外顯子的PCR擴增引物組成的引物組；

PCR擴增試劑：2.5mM dNTP，含Mg²⁺的10×PCR緩沖液，5U/μl Taq DNA聚合酶，去RNase與DNase水；其中各溶液工作濃度分別為200μM，1×PCR緩沖液，0.025U/μl；

PCR產物純化試劑：1U/μl SAP酶，10U/μl ExoI酶，去RNase與DNase水；其中SAP酶工作濃度為0.05U/μl，ExoI酶工作濃度為0.5U/μl。

DNA測序試劑：上述用于檢測FGFR3基因突變的測序引物組、BigDye 3.1混合液，0.125M EDTA溶液，無水乙醇，體積百分比75％乙醇溶液、Hi-Di去離子甲酰胺溶液、去RNase與DNase水；測序引物組中的測序引物工作濃度為0.64pMol/L。

本試劑盒于-20保存，盡量減少反復凍融。

實施例3

利用上述用于檢測FGFR3基因突變的試劑盒進行人FGFR3基因突變檢測方法，步驟如下：

(1)外周血基因組DNA的提取

采集患者外周血5ml，采用Omega公司DNA提取試劑盒(D3392-01)進行全血基因組DNA的提取，采用NanoDrop 2000/2000c分光光度計進行DNA濃度和純度測定；具體操作步驟條件參見產品說明書；

(2)PCR擴增

PCR反應體系為20μl，其中包括：

10×PCR Buffer 2μl，2.5mM dNTP 1.6μl，Taq DNA聚合酶0.1μl，5μM上游引物1.6μl，5μM下游引物1.6μl，DNA模板50ng-100ng，去RNase與DNase水補足至20μl。

采用BIO-RAD公司PIC-200型PCR儀，進行降落PCR，PCR反應條件如下：

94℃預變性5分鐘；94℃變性20秒，62℃退火30秒，退火溫度每一循環降低0.5℃，72℃延伸40秒，循環次數14；然后，94℃變性20秒，55℃退火30秒，72℃延伸40秒，循環次數21；72℃終延伸5分鐘。

(3)PCR產物純化

PCR純化體系為20μl，其中包括：

PCR產物8μl，1U/μl SAP酶1μl，10U/μl ExoI酶1μl，去RNase與DNase水10μl。

反應條件為37℃消化60分鐘，然后65℃滅活15分鐘。產物純化后經1％瓊脂糖凝膠電泳或是微量核酸定量儀進行濃度測定。

(4)DNA測序反應及純化

DNA測序反應的體系為10μl，包括4μl BigDye，3.2pMol/L測序引物2μl，5～20ng純化的PCR物，用去RNase與DNase水補足至10μl。

反應條件為：

96℃10秒，50℃5秒，60℃4分鐘，共28個循環反應。PCR循環完并冷卻到4℃，取下并馬上進行短時間離心。測序反應結束后將反應產物中加入2.5μl 0.125M的EDTA溶液,然后加入30μl無水乙醇，顛倒混勻后室溫放置15分鐘。在12000g離心10分鐘后，移除上清。加入60μl體積百分比濃度為70％的乙醇溶液，4℃12000g離心15分鐘后，移除上清。重復一次后，待乙醇揮發干凈后將沉淀溶于10μlHi-Di甲酰胺。95℃變性4分鐘后采用ABI3130XL測序儀進行測序分析。

(5)測序結果分析

測序結果采用Mutation Survey軟件進行突變位點的識別。

實驗例

采用實施例1至實施例3所述方法，對來自山東省立醫院的11例臨床診斷為軟骨發育不全的患者進行了FGFR3基因檢測，患者基本信息如表2。患者除具有身材矮小特征外，存在四肢粗短，頭顱大，前額與頂骨圓凸，手指短小且呈“三叉戟”樣，面中部發育不良等典型特征。

表2

對11例軟骨發育不全患者基因檢測結果表明(圖1)，8例患者存在10號外顯子1138G>GA雜合突變，該突變導致氨基酸殘基380位甘氨酸由精氨酸替代(圖1A)，1例患者存在1388C>CT雜合突變，該突變導致450位蘇氨酸由甲硫氨酸替代(圖1B)，1例患者存在1620C>CG雜合突變，該突變引起540位點天冬氨酸被賴氨酸所替代(圖1C)，1例患者存在1620C>CA雜合突變，該突變引起540位點天冬氨酸被賴氨酸所替代(圖1D)。

基因突變檢測結果表明，來自臨床的11例軟骨發育不全患者均檢測到FGFR3基因的突變，其中8例屬于常見的1138G>GA(380G/GR)雜合突變。該結果與患者臨床表型以及臨床診斷結果相一致。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東省醫藥生物技術研究中心

<120> 檢測人FGFR3基因突變的引物組及其試劑盒

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tctaacgagc tgccttcctc 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

cagcccctgg tctggtg 17

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

cagggactca gggagcc 17

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<212> DNA

<213> 人工合成

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ccatctggga ggggcac 17

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tagtccctca gctgcctgtg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

tcctacacag gacgggaaac 20

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<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

aactccacgt cgctgcc 17

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

tggacgtgct gggtgag 17

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

caacccctag acccaaatcc 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

tgaccaagtt ggcggtgg 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

cggccgtaag tcacaggatt 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

tcactggcgt tactgactgc 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

accctaggct ctacatggtg a 21

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<212> DNA

<213> 人工合成

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tcattcaatg ctggtggaag 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

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catacacccg tcccaggag 19

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

ctggaggtgg tggctctg 18

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

ggacacgggc tcctcag 17

<210> 19

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ggtaggtgcg gtagcgg 17

<210> 20

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

acaagaagac gaccaacgtg a 21

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

ccgccttatt cgggaacagc 20

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<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

agcccttcag gctgttcc 18

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

actgagtctc atgccggg 18