發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及親和色譜領(lǐng)域，并且更特別地涉及包含蛋白l的κ輕鏈-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽，其可用于許多類(lèi)型的免疫球蛋白和免疫球蛋白片段的親和色譜。本發(fā)明還涉及含有所述多肽的分離基質(zhì)和使用這樣的分離基質(zhì)的分離方法。

發(fā)明背景

免疫球蛋白和免疫球蛋白片段代表全世界生產(chǎn)或開(kāi)發(fā)的最普遍的生物制藥產(chǎn)品。對(duì)于這種特定治療市場(chǎng)的高商業(yè)需求，以及由此的價(jià)值，已導(dǎo)致重點(diǎn)放在制藥公司上，以使它們各自的生產(chǎn)過(guò)程的生產(chǎn)力最大化，同時(shí)控制相關(guān)的成本。

親和色譜，通常在包含葡萄球菌蛋白a或其變體的基質(zhì)上，通常被用作在完整免疫球蛋白分子的純化中的關(guān)鍵步驟之一。蛋白a對(duì)免疫球蛋白的fc鏈的高選擇性結(jié)合提供一個(gè)對(duì)雜質(zhì)和污染物具有很高的清除作用的通用步驟。

對(duì)于抗體片段，例如fab、單鏈可變片段(scfv)、雙-特異性t-細(xì)胞銜接子(bite)、結(jié)構(gòu)域抗體等，其缺乏fc鏈但具有1、3或4子類(lèi)κ輕鏈，包含源自大消化鏈球菌(peptostreptococcusmagnus)的蛋白l的基質(zhì)(b?kerstr?m,lbj?rck:j.biol.chem.264,19740-19746,1989；wkasternetal:j.biol.chem.267,12820-12825,1992；bhknilsonetal:j.biol.chem.267,2234-2239,1992和美國(guó)專(zhuān)利6,822,075)顯示作為提供所需的高選擇性的純化平臺(tái)的巨大前景。美國(guó)專(zhuān)利6,822,075中公開(kāi)的蛋白l包含氨基酸序列seqidno:1加上在n-末端的另外的aven序列。

seqidno:1(蛋白l)

keetpetpetdseeevtikanlifangstqtaefkgtfekatseayayadtlkkdngeytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadalkkdngeytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfaeataeayryadllakengkytadledggytinirfagkkvdekpee

蛋白l基質(zhì)是可作為capto^tml從gehealthcarebio-sciencesab,sweden(captoldatafile29-0100-08ac,2014)經(jīng)商業(yè)獲得的，并可被用來(lái)分離含κ輕鏈的蛋白例如完整抗體、fab片段、scfv片段、結(jié)構(gòu)域抗體等。由健康人產(chǎn)生的約75%的抗體具有κ輕鏈，并且許多治療性單克隆抗體和抗體片段含有κ輕鏈。

任何生物處理色譜應(yīng)用需要全面注意污染物的明確去除。這樣的污染物可以是例如在色譜程序中吸附于固定相或基質(zhì)的非-洗脫的分子，例如非-期望的生物分子或微生物，包括例如蛋白、碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)菌和病毒。從基質(zhì)除去這樣的污染物通常在首次洗脫期望的產(chǎn)物后執(zhí)行，以在后續(xù)使用之前再生基質(zhì)。這樣的除去通常涉及稱(chēng)為原位清洗(cip)的程序，其中能夠從固定相洗脫污染物的試劑被使用。一類(lèi)常常與色譜介質(zhì)一起使用的這樣的試劑是在基質(zhì)上通過(guò)的堿性溶液。目前最廣泛使用的清潔和消毒劑是naoh，并且理想的是以范圍從0.05至最多例如1m的濃度使用，這取決于污染的程度和性質(zhì)。然而，與例如蛋白a比較，蛋白l是一種對(duì)堿相當(dāng)敏感的蛋白并且在大量的周期后僅耐受至多約15mmnaoh。這意味著另外的、不太理想的清潔溶液，例如尿素或胍鎓鹽，也可能必須使用，以確保足夠的清潔。

一項(xiàng)廣泛的研究較早地專(zhuān)注于基因工程蛋白a配體的開(kāi)發(fā)，所述配體表現(xiàn)出耐堿性ph-值的改進(jìn)能力。例如，wo2003/080655a1公開(kāi)了具有特定的天冬酰胺突變的蛋白a結(jié)構(gòu)域是比天然蛋白顯著更加堿穩(wěn)定的。

因此，本領(lǐng)域仍有獲得含有蛋白l-衍生的配體的分離基質(zhì)的需要，所述配體具有對(duì)堿性清潔程序的改進(jìn)的穩(wěn)定性。

發(fā)明概述

本發(fā)明的一個(gè)方面是提供具有改進(jìn)的堿穩(wěn)定性的多肽。這用如在權(quán)利要求1中定義的多肽實(shí)現(xiàn)。

一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是堿穩(wěn)定性比蛋白l和親本多肽有改善。一個(gè)進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的多肽保持對(duì)蛋白l證實(shí)的對(duì)含κ輕鏈的蛋白的高選擇性結(jié)合。

本發(fā)明的第二個(gè)方面是提供一種編碼具有改進(jìn)的堿穩(wěn)定性的多肽或多聚體的核酸或載體。這用如在權(quán)利要求中定義的核酸或載體實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明的第三個(gè)方面是提供一種能夠表達(dá)具有改進(jìn)的堿穩(wěn)定性的多肽或多聚體的表達(dá)系統(tǒng)。這用如在權(quán)利要求中定義的表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供一種能夠選擇性地結(jié)合含κ輕鏈的蛋白并表現(xiàn)出改進(jìn)的堿穩(wěn)定性的分離基質(zhì)。這用如在權(quán)利要求中定義的分離基質(zhì)實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明的第五個(gè)方面是提供一種分離含κ輕鏈的蛋白的有效和經(jīng)濟(jì)的方法。這用如在權(quán)利要求中定義的方法實(shí)現(xiàn)。

本發(fā)明的更合適的實(shí)施方案在從屬權(quán)利要求中描述。

定義

術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”在此可互換使用，并被理解為還包括抗體的片段、包含抗體或抗體片段的融合蛋白和包含抗體或抗體片段的綴合物。

術(shù)語(yǔ)“κ輕鏈-結(jié)合多肽”和“κ輕鏈-結(jié)合蛋白”在此分別指能夠結(jié)合抗體的1、3或4子類(lèi)κ輕鏈(也稱(chēng)為vκi、vκiii和vκiv，如在bhknilsonetal:j.biol.chem.267,2234-2239,1992中)的多肽或蛋白，并包括例如蛋白l，及其已維持所述結(jié)合特性的任何變體、片段或融合蛋白。

術(shù)語(yǔ)“含κ輕鏈的蛋白”被用作“含免疫球蛋白κ輕鏈的蛋白”的同義詞，并且在此意指包含從抗體衍生的1、3或4子類(lèi)κ輕鏈(也稱(chēng)為vκi、vκiii和vκiv，如在bhknilsonetal:j.biol.chem.267,2234-2239,1992中)的蛋白，并包括含有1、3或4子類(lèi)κ輕鏈的任何完整抗體、抗體片段、融合蛋白、綴合物或重組蛋白。

附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示如在us6,822,075和wkasternetal:jbiol.chem.267,12820-12825,1992中描述的蛋白l的5個(gè)κ輕鏈-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的比對(duì)。

圖2顯示蛋白l的不同κ輕鏈-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的堿穩(wěn)定性。

圖3顯示蛋白l的突變?chǔ)瘦p鏈-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的堿穩(wěn)定性。

圖4顯示包含4個(gè)結(jié)構(gòu)域的蛋白l配體的堿穩(wěn)定性。

圖5顯示與蛋白l比較，蛋白l的突變二聚體、四聚體和六聚體κ輕鏈-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的堿穩(wěn)定性。

實(shí)施方案的詳細(xì)描述

一方面，本發(fā)明公開(kāi)一種κ輕鏈-結(jié)合多肽，其包含大消化鏈球菌蛋白l的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或基本由大消化鏈球菌蛋白l的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，其中這些結(jié)構(gòu)域的每一個(gè)選自結(jié)構(gòu)域2、結(jié)構(gòu)域3和結(jié)構(gòu)域4。結(jié)構(gòu)域2可具有由seqidno:3或seqidno:12定義的氨基酸序列，或它可具有與seqidno:3或12至少90%，例如至少95%的序列同源性。seqidno:12是seqidno:3的變體，具有在第31位的丙氨酸。結(jié)構(gòu)域3可具有由seqidno:4定義的氨基酸序列，或它可具有與seqidno:4至少90%，例如至少95%的序列同源性。結(jié)構(gòu)域4可具有由seqidno:5定義的氨基酸序列，或它可具有與seqidno:5至少90%，例如至少95%的序列同源性。

在多肽的一些實(shí)施方案中，每個(gè)結(jié)構(gòu)域選自結(jié)構(gòu)域3和結(jié)構(gòu)域4，或每個(gè)結(jié)構(gòu)域是結(jié)構(gòu)域3。特別地，多肽可包含結(jié)構(gòu)域3的多聚體或基本由結(jié)構(gòu)域3的多聚體組成。

在一些實(shí)施方案中，至少兩個(gè)結(jié)構(gòu)域選自結(jié)構(gòu)域2、結(jié)構(gòu)域3和結(jié)構(gòu)域4，或選自結(jié)構(gòu)域3和結(jié)構(gòu)域4。

在某些實(shí)施方案中，多肽不含消化鏈球菌蛋白l的任何結(jié)構(gòu)域1。結(jié)構(gòu)域1可具有由seqidno:2定義的氨基酸序列，或它可具有與seqidno:2至少90%，例如至少95%的序列同源性。

在多肽的某些實(shí)施方案中，在一個(gè)或多個(gè)，例如全部的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，至少在對(duì)應(yīng)于seqidno:2-5的第45位的位置的氨基酸(例如在seqidno:2-5或12的第45位的氨基酸)已突變?yōu)椴皇翘於０贰⒏彼峄虬腚装彼岬陌被帷５?5位的氨基酸可以例如被突變?yōu)楸彼帷?/p>

在多肽的一些實(shí)施方案中，在一個(gè)或多個(gè)，例如全部的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，至少在對(duì)應(yīng)于seqidno:2-5的第10位的位置的氨基酸(例如在seqidno:2-5或12的第10位的氨基酸)已突變?yōu)椴皇翘於０贰⒏彼峄虬腚装彼岬陌被帷５?0位的氨基酸可以例如被突變?yōu)楣劝滨０贰?/p>

在多肽的某些實(shí)施方案中，在一個(gè)或多個(gè)，例如全部的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，至少在對(duì)應(yīng)于seqidno:2-5的第60位的位置的氨基酸(例如在seqidno:2-5或12的第60位的氨基酸)已突變?yōu)椴皇翘於０贰⒏彼峄虬腚装彼岬陌被帷５?0位的氨基酸可以例如被突變?yōu)楣劝滨０贰?/p>

特別地，一個(gè)或多個(gè)，例如全部的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可具有選自n10q；n45a；n60q；n10q,n45a；n45a,n60q,n10q,n60q和n10q,n45a,n60q，或者選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q和n10q,n45a,n60q的突變。

在多肽的一些實(shí)施方案中，在一個(gè)或多個(gè)，例如全部的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，至少在對(duì)應(yīng)于seqidno:2-5的第19位的位置的氨基酸(例如在seqidno:2-5或12的第19位的氨基酸)已突變?yōu)椴皇枪劝滨０贰⑻於０贰⒏彼峄虬腚装彼岬陌被帷５?9位的氨基酸可以例如被突變?yōu)楣劝彼峄虮彼帷Ｌ貏e地，一個(gè)或多個(gè)，例如全部的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可具有選自q19e和q19a的突變。

在多肽的某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)，例如全部的所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有選自由seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:13和seqidno:14定義的序列的氨基酸序列。或者，一個(gè)或多個(gè)，例如全部的所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域可具有選自由seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10和seqidno:11定義的序列的氨基酸序列。多肽還可在n-末端包含多個(gè)氨基酸殘基，所述殘基源自克隆過(guò)程或構(gòu)成來(lái)自裂解的信號(hào)傳導(dǎo)序列的殘基。另外的氨基酸殘基的數(shù)目可以例如是15個(gè)或更少，例如10個(gè)或更少，或5個(gè)或更少。作為一個(gè)特定的實(shí)例，多肽可在n-末端包含aqv序列。

seqidno:7(結(jié)構(gòu)域3,n45a突變)

pkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlnikfagkektpee

seqidno:8(結(jié)構(gòu)域3,n10q,n45a突變)

pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlnikfagkektpee

seqidno:9(結(jié)構(gòu)域3,n45a,n60q突變)

pkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpee

seqidno:10(結(jié)構(gòu)域3,n10q,n60q突變)

pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlqikfagkektpee

seqidno:11(結(jié)構(gòu)域3,n10q,n45a,n60q突變)

pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpee

seqidno:12(結(jié)構(gòu)域2的變體)

pkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeaaaeayryadalkkdngeytvdvadkgytlnikfagkektpee

seqidno:13(結(jié)構(gòu)域3,q19a突變)

pkeevtikanliyadgktataefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpee

seqidno:14(結(jié)構(gòu)域3,q19e突變)

pkeevtikanliyadgktetaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpee

在某些實(shí)施方案中，多肽是包含如由上文公開(kāi)的任何實(shí)施方案所定義的多個(gè)突變或非-突變結(jié)構(gòu)域，或基本由如由上文公開(kāi)的任何實(shí)施方案所定義的多個(gè)突變或非-突變結(jié)構(gòu)域組成的多聚體。多聚體可以例如是二聚體、三聚體、四聚體、五聚體或六聚體。它可以是同源多聚體，其中多聚體中的所有單位是相同的，或它可以是異源多聚體，其中至少一個(gè)單位不同于其它的。有利地，多聚體中的所有單位，例如通過(guò)包含以上公開(kāi)的突變，是堿穩(wěn)定的。結(jié)構(gòu)域可通過(guò)結(jié)構(gòu)域的c-和n-末端之間的肽鍵彼此直接連接。或者，多聚體中的兩個(gè)或更多個(gè)單位可通過(guò)包含寡聚或多聚種類(lèi)的元件，例如包含至多15或30個(gè)氨基酸，例如1-5、1-10或5-10個(gè)氨基酸的元件連接。這樣一種連接的性質(zhì)應(yīng)該優(yōu)選不會(huì)破壞結(jié)構(gòu)域的空間構(gòu)象的穩(wěn)定性。這可例如通過(guò)避免在連接中存在半胱氨酸來(lái)實(shí)現(xiàn)。而且，所述連接還應(yīng)該優(yōu)選在堿性環(huán)境中是足夠穩(wěn)定的，不損害結(jié)構(gòu)域的特性。為此目的，如果連接不含天冬酰胺，則是有利的。如果連接不含谷氨酰胺，則可能是額外有利的。多聚體可進(jìn)一步在n-末端包含多個(gè)氨基酸殘基，其源自克隆過(guò)程或構(gòu)成來(lái)自裂解的信號(hào)傳導(dǎo)序列的殘基。另外的氨基酸殘基的數(shù)目可以例如是15或更少，例如10或更少，或5或更少。作為一個(gè)特定的實(shí)例，多聚體可包含在n-末端的aqv序列。

在一些實(shí)施方案中，多聚體可包含選自以下的序列，或基本由選自以下的序列組成：seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17和seqidno:18，例如選自seqidno:16、seqidno:17和seqidno:18的序列。

seqidno:15(結(jié)構(gòu)域3,四聚體)

pkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpeepkeevtikanliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakengkytvdvadkgytlnikfagkektpee

seqidno:16結(jié)構(gòu)域3(n10q,n45a,n60q)2

pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpee

seqidno:17結(jié)構(gòu)域3(n10q,n45a,n60q)4

pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpee

seqidno:18結(jié)構(gòu)域3(n10q,n45a,n60q)6

pkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpeepkeevtikaqliyadgktqtaefkgtfeeataeayryadllakeagkytvdvadkgytlqikfagkektpee

在某些實(shí)施方案中，如上文公開(kāi)的多肽和/或多聚體還包含在c-末端或n-末端的一個(gè)或多個(gè)偶聯(lián)元件，其選自半胱氨酸殘基、多個(gè)賴(lài)氨酸殘基和多個(gè)組氨酸殘基。偶聯(lián)元件可以例如是在c-末端的單一半胱氨酸。偶聯(lián)元件可直接連接于c-或n-末端，或它/它們可通過(guò)包含至多15個(gè)氨基酸，例如1-5、1-10或5-10個(gè)氨基酸的接頭連接。這段序列(stretch)優(yōu)選在堿性環(huán)境中應(yīng)該也是足夠穩(wěn)定的，不損害突變蛋白的特性。為此目的，如果這段序列不含天冬酰胺，則是有利的。如果這段序列不含谷氨酰胺，則可能是額外有利的。具有c-或n-末端半胱氨酸的優(yōu)點(diǎn)是蛋白的終點(diǎn)偶聯(lián)可通過(guò)半胱氨酸硫醇與支持體上的親電子基團(tuán)的反應(yīng)完成。這提供對(duì)于結(jié)合能力是重要的偶聯(lián)蛋白的優(yōu)越的移動(dòng)性。

多肽或多聚體的堿穩(wěn)定性可通過(guò)使之偶聯(lián)于spr芯片，例如如在實(shí)施例中所述的biacorecm5傳感器芯片，并使用例如特定的含κ輕鏈的蛋白或多克隆人igg(其中大多數(shù)igg分子具有κ輕鏈)，在堿性溶液中孵育之前和之后，在特定的溫度，例如22+/-2℃下，測(cè)量芯片的κ輕鏈-結(jié)合能力來(lái)評(píng)價(jià)。孵育可例如在0.1mnaoh中進(jìn)行許多個(gè)10min的周期，例如50、96或100個(gè)周期。于22+/-2℃，在0.1mnaoh中在96-100個(gè)10min的孵育周期后，基質(zhì)的結(jié)合能力可以是孵育前結(jié)合能力的至少40，例如至少50或至少55%。或者，對(duì)于如上測(cè)量的特定突變體在96-100個(gè)周期后的剩余結(jié)合能力可與對(duì)親本多肽/多聚體的剩余結(jié)合能力比較。在這種情況下，對(duì)于突變體的剩余結(jié)合能力可以是親本多肽/多聚體的至少105%，例如至少110%、至少125%、至少150%或至少200%。

本發(fā)明還公開(kāi)一種包含消化鏈球菌蛋白l的至少一個(gè)突變結(jié)合結(jié)構(gòu)域的κ輕鏈-結(jié)合多肽，其中由seqidno:2-6或12定義的，或與seqidno:2-6或12具有至少95%或98%的序列同源性的親本結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)天冬酰胺殘基已經(jīng)突變?yōu)榱硪粋€(gè)并非天冬酰胺、脯氨酸或半胱氨酸的氨基酸殘基。多肽可包含至少突變n45a和/或突變n60q。在特定的實(shí)施方案中，所述突變選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q,n10q,n60q和n10q,n45a,n60q，或者選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q和n10q,n45a,n60q。相對(duì)于親本多肽的堿穩(wěn)定性可被改進(jìn)和如上文所公開(kāi)進(jìn)行測(cè)定。

在一些實(shí)施方案中，多肽包含多個(gè)突變結(jié)合結(jié)構(gòu)域或基本由多個(gè)突變結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，例如2、3、4、5或6結(jié)構(gòu)域，其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含突變n10q,n45a和n60q的至少一個(gè)，例如n45a和/或n60q。特別地，在每個(gè)結(jié)構(gòu)域中的突變可選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q,n10q,n60q和n10q,n45a,n60q，或者選自n45a；n10q,n45a；n45a,n60q和n10q,n45a,n60q。結(jié)構(gòu)域可任選地通過(guò)包含至多15個(gè)氨基酸的元件彼此連接。

在第二方面，本發(fā)明公開(kāi)編碼依據(jù)以上公開(kāi)的任何實(shí)施方案的多肽或多聚體的核酸。因此，本發(fā)明涵蓋本核酸序列的所有形式，例如編碼多肽或多聚體的rna和dna。本發(fā)明涵蓋載體，例如質(zhì)粒，其除了編碼序列，還包含用于表達(dá)依據(jù)本發(fā)明的多肽或多聚體所需的信號(hào)序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體包含編碼依據(jù)本發(fā)明的多聚體的核酸，其中編碼各個(gè)單位的獨(dú)立的核酸可具有同源或異源的dna序列。

在第三方面，本發(fā)明公開(kāi)一種表達(dá)系統(tǒng)，其包含如上公開(kāi)的核酸或載體。表達(dá)系統(tǒng)可以例如是革蘭氏陽(yáng)性或革蘭氏陰性原核宿主細(xì)胞系統(tǒng)，例如芽孢桿菌(bacillussp)或大腸桿菌(escherichiacoli)，其已被修飾為表達(dá)本發(fā)明的多肽或多聚體。在可供選擇的實(shí)施方案中，表達(dá)系統(tǒng)是真核宿主細(xì)胞系統(tǒng)，例如酵母，例如巴斯德畢赤酵母(pichiapastoris)或釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)。

在第四方面，本發(fā)明公開(kāi)一種分離基質(zhì)，其中依據(jù)以上公開(kāi)的任何實(shí)施方案的多個(gè)多肽或多聚體已經(jīng)偶聯(lián)于固體支持體。這樣一種基質(zhì)可用來(lái)分離含κ輕鏈的蛋白，并且由于多肽/多聚體的改進(jìn)的堿穩(wěn)定性，基質(zhì)將耐受在清潔期間的高堿性的條件，這對(duì)于在生物處理分離背景下的長(zhǎng)期重復(fù)使用是至關(guān)重要的。基質(zhì)的堿穩(wěn)定性可通過(guò)于特定的溫度下，例如22+/-2℃，在堿性溶液中孵育之前和之后，使用例如特定的含κ輕鏈的蛋白或多克隆人igg測(cè)量κ輕鏈-結(jié)合能力來(lái)評(píng)價(jià)。孵育可例如在0.1mnaoh中進(jìn)行一定數(shù)目的15min周期，例如100、200或300個(gè)周期。于22+/-2℃，在0.1mnaoh中經(jīng)100個(gè)15min孵育周期后，基質(zhì)的結(jié)合能力可以是孵育前結(jié)合能力的至少80，例如至少85、至少90或至少95%。或者，孵育可在0.1mnaoh中進(jìn)行多個(gè)4h的周期，例如6個(gè)周期(提供24h的總孵育時(shí)間)。于22+/-2℃，在0.1mnaoh中經(jīng)24h的總孵育時(shí)間后，基質(zhì)的結(jié)合能力可以是孵育前結(jié)合能力的至少80，例如至少85，至少90或至少95%。

如技術(shù)人員應(yīng)該理解的，表達(dá)的多肽或多聚體在被固定到支持體之前，應(yīng)被純化至合適的程度。這樣的純化方法是本領(lǐng)域熟知的，且基于蛋白的配體固定于支持體容易使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。合適的方法和支持體將在下文更詳細(xì)地討論。

依據(jù)本發(fā)明的基質(zhì)的固體支持體可以是任何合適的熟知的種類(lèi)。常規(guī)親和分離基質(zhì)通常具有有機(jī)性質(zhì)并基于親水性表面暴露于所用的水性介質(zhì)(即暴露在它們的外表面上和(如果存在)也在內(nèi)表面上的羥基(-oh)、羧基(-cooh)、甲酰胺基(-conh2，可能呈現(xiàn)為n-取代的形式)、氨基(-nh2，可能呈現(xiàn)為取代的形式)、寡-或聚乙烯氧基)的聚合物。固體支持體可適合為多孔的。孔隙率可以表示為kav或kd值(特定尺寸的探針?lè)肿涌色@得的孔體積的分?jǐn)?shù))，其通過(guò)逆尺寸排阻色譜，例如依據(jù)在gelfiltrationprinciplesandmethods,pharmacialkbbiotechnology1991,pp6-13中描述的方法測(cè)量。按照定義，kd和kav值二者總是在0-1范圍內(nèi)。kav值可有利地為0.6-0.95，例如0.7-0.90或0.6-0.8，如用mw110kda的葡聚糖作為探針?lè)肿訙y(cè)量的。其優(yōu)點(diǎn)是支持體具有大分?jǐn)?shù)的孔，其能夠容納本發(fā)明的多肽/多聚體和結(jié)合于多肽/多聚體的免疫球蛋白并提供免疫球蛋白朝向結(jié)合位點(diǎn)和離開(kāi)結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)量輸運(yùn)。

多肽或多聚體可經(jīng)由常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)，利用例如存在于配體中的硫醇基、氨基和/或羧基，附接于支持體。雙環(huán)氧化物(bisepoxides)、表氯醇、cnbr、n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)等是熟知的偶聯(lián)試劑。在支持體和多肽/多聚體之間，可引入一種稱(chēng)為間隔區(qū)的分子，其改善多肽/多聚體的可利用性并促進(jìn)多肽/多聚體化學(xué)偶聯(lián)于支持體。合適的間隔區(qū)可例如通過(guò)用表氯醇、丁二醇二環(huán)氧化物、烯丙基縮水甘油醚等激活支持體來(lái)引入。或者，多肽/多聚體可通過(guò)非-共價(jià)鍵合，例如物理吸附或生物特異性吸附附接于支持體。

在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)包含5-20，例如5-15mg/ml、5-11mg/ml或8-11mg/ml的偶聯(lián)于支持體的多肽或多聚體。偶聯(lián)的多肽/多聚體的量可受在偶聯(lián)過(guò)程中所用的多肽/多聚體的濃度，受所用的偶聯(lián)條件和/或受所用支持體的孔結(jié)構(gòu)的控制。作為一般規(guī)則，基質(zhì)的絕對(duì)結(jié)合能力隨著偶聯(lián)多肽/多聚體的量增加而增加，至少達(dá)到其中孔變得受偶聯(lián)的多肽/多聚體顯著限制的點(diǎn)。每mg偶聯(lián)的多肽/多聚體的相對(duì)結(jié)合能力將在高偶聯(lián)水平上降低，導(dǎo)致在以上指定范圍內(nèi)的成本效益最優(yōu)化。

在一些實(shí)施方案中，多肽經(jīng)由多點(diǎn)附接偶聯(lián)于支持體。這可通過(guò)使用這樣的偶聯(lián)條件，即多肽中的多個(gè)反應(yīng)性基團(tuán)與支持體中的反應(yīng)性基團(tuán)反應(yīng)來(lái)適當(dāng)?shù)赝瓿伞５湫偷兀帱c(diǎn)附接可涉及序列中氨基酸殘基的幾個(gè)內(nèi)在反應(yīng)性基團(tuán)，例如賴(lài)氨酸中的胺，與支持體上的反應(yīng)性基團(tuán)，例如環(huán)氧化物、氰酸酯(例如來(lái)自cnbr激活)、琥珀酰亞胺酯(例如來(lái)自nhs激活)等反應(yīng)。然而，也可能是有意在多肽的不同位置引入反應(yīng)性基團(tuán)以影響偶聯(lián)特性。為經(jīng)由賴(lài)氨酸提供多點(diǎn)偶聯(lián)，偶聯(lián)反應(yīng)適當(dāng)?shù)卦谄渲泻艽笠徊糠仲?lài)氨酸伯胺呈現(xiàn)非-質(zhì)子化親核狀態(tài)的ph，例如在高于8.0，例如10以上的ph下進(jìn)行。

在某些實(shí)施方案中，多肽或多聚體通過(guò)硫醚鍵偶聯(lián)于支持體。執(zhí)行這樣的偶聯(lián)的方法是本領(lǐng)域熟知的并由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和設(shè)備容易地進(jìn)行。硫醚鍵是撓性和穩(wěn)定的，且一般適用于親和色譜。特別是當(dāng)硫醚鍵經(jīng)由多肽或多聚體上的末端或接近-末端的半胱氨酸殘基時(shí)，偶聯(lián)的多肽/多聚體的移動(dòng)性增加，這提供了改善的結(jié)合能力和結(jié)合動(dòng)力學(xué)。在一些實(shí)施方案中，多肽/多聚體經(jīng)由如上所述的蛋白上提供的c-末端半胱氨酸偶聯(lián)。這允許半胱氨酸硫醇有效偶聯(lián)于支持體上的親電子基團(tuán)，例如環(huán)氧化物基團(tuán)、鹵代醇基團(tuán)等，導(dǎo)致硫醚橋偶聯(lián)。多肽/多聚體可例如經(jīng)由單點(diǎn)附接(例如經(jīng)由單一半胱氨酸)或經(jīng)由直接的多點(diǎn)附接，使用例如接近多肽/多聚體的末端的多個(gè)賴(lài)氨酸或其它偶聯(lián)基團(tuán)偶聯(lián)。

在某些實(shí)施方案中，支持體包含多羥基聚合物，例如多糖。多糖的例子包括例如葡聚糖、淀粉、纖維素、支鏈淀粉、瓊脂、瓊脂糖等。多糖是固有親水性的，具有較低程度的非特異性相互作用，它們提供高含量的反應(yīng)性(可激活的)羥基且它們對(duì)用于生物處理的堿性清潔溶液一般是穩(wěn)定的。

在一些實(shí)施方案中，支持體包含瓊脂或瓊脂糖。用于本發(fā)明的支持體可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，例如逆懸浮凝膠化(inversesuspensiongelation)(shjertén:biochimbiophysacta79(2),393-398(1964)容易地制備。或者，堿性基質(zhì)是可市售獲得的產(chǎn)品，例如以sepharose?ff(gehealthcare)商品名出售的交聯(lián)的瓊脂糖珠。在對(duì)于大規(guī)模分離是特別有利的一個(gè)實(shí)施方案中，已使用在us6602990或us7396467(通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中)中描述的方法，使支持體適應(yīng)于增加其剛性，因而使基質(zhì)更適合于高流速。

在某些實(shí)施方案中，支持體，例如多糖或瓊脂糖支持體被交聯(lián)，例如用羥烷基醚交聯(lián)。產(chǎn)生這樣的交聯(lián)的交聯(lián)劑可以是例如表鹵代醇像表氯醇、雙環(huán)氧化物像丁二醇二縮水甘油醚、烯丙基化劑像烯丙基鹵化物或烯丙基縮水甘油醚。交聯(lián)對(duì)于支持體的剛性是有益的并改善化學(xué)穩(wěn)定性。羥烷基醚交聯(lián)是堿穩(wěn)定的，且不引起顯著的非特異性吸附。

或者，固體支持體基于合成的聚合物，例如聚乙烯醇、聚羥基烷基丙烯酸酯、聚羥基烷基甲基丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺等。在疏水性聚合物的情況下，例如基于二乙烯基和單乙烯基-取代的苯的基質(zhì)，基質(zhì)的表面常常被親水化，以使如上定義的親水性基團(tuán)暴露于周?chē)乃砸后w。這樣的聚合物依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，見(jiàn)例如“styrenebasedpolymersupportsdevelopedbysuspensionpolymerization”(rarshady:chimicael'industria70(9),70-75(1988))容易地生產(chǎn)。或者，使用可市售獲得的產(chǎn)品，例如source?(gehealthcare)。在另一個(gè)替代中，依據(jù)本發(fā)明的固體支持體包含無(wú)機(jī)性質(zhì)的支持體，例如二氧化硅、氧化鋯等。

在再另一個(gè)實(shí)施方案中，固體支持體呈現(xiàn)為另一種形式例如表面、芯片、毛細(xì)管，或?yàn)V器(如膜或深過(guò)濾基質(zhì))。

關(guān)于依據(jù)本發(fā)明的基質(zhì)的形狀，在一個(gè)實(shí)施方案中，基質(zhì)呈現(xiàn)為多孔整料的形式。在可供選擇的實(shí)施方案中，基質(zhì)以可以是多孔或無(wú)孔的串珠或粒子形式呈現(xiàn)。以串珠或粒子形式呈現(xiàn)的基質(zhì)可用作填充床或以懸浮的形式使用。懸浮的形式包括稱(chēng)為膨脹床的那些和純粹的懸浮液，其中顆粒或珠自由移動(dòng)。在整料、填充床和膨脹床的情況下，分離程序通常遵循具有濃度梯度的常規(guī)色譜。在純粹的懸浮液的情況下，應(yīng)使用分批的模式。

在第六方面，本發(fā)明公開(kāi)一種分離含κ輕鏈的蛋白的方法，其中如以上公開(kāi)的分離基質(zhì)被使用。

在一些實(shí)施方案中，該方法包含以下步驟：

a)使包含含κ輕鏈的蛋白的液體樣品與如以上公開(kāi)的分離基質(zhì)接觸，

b)用洗滌液洗滌所述分離基質(zhì)，

c)用洗脫液從分離基質(zhì)洗脫含κ輕鏈的蛋白，和

d)用清潔液清潔分離基質(zhì)。

該方法還可包含以下步驟：在步驟a)之前，提供依據(jù)上文描述的任何實(shí)施方案的親和分離基質(zhì)和提供包含含κ輕鏈的蛋白和至少一種其它物質(zhì)的溶液作為液體樣品，以及在步驟c)之后，回收洗脫液和任選地使洗脫液經(jīng)歷進(jìn)一步的分離步驟，例如通過(guò)陰離子或陽(yáng)離子交換色譜、多峰色譜和/或疏水相互作用色譜。液體樣品的合適的組成，洗滌液體和洗脫液，以及執(zhí)行分離的一般條件是親和色譜領(lǐng)域且特別是蛋白l色譜領(lǐng)域熟知的。包含含κ輕鏈的蛋白和至少一種其它物質(zhì)的液體樣品可包含宿主細(xì)胞蛋白(hcp)，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(cho)細(xì)胞、大腸桿菌或酵母細(xì)胞蛋白。cho細(xì)胞和大腸桿菌蛋白的含量可通過(guò)針對(duì)這些蛋白質(zhì)的免疫測(cè)定法便利地測(cè)定，如得自cygnustechnologies的chohcp或大腸桿菌hcpelisa試劑盒。宿主細(xì)胞蛋白或cho細(xì)胞/大腸桿菌/酵母蛋白可在步驟b)期間被解除吸附。

洗脫可通過(guò)使用用來(lái)從蛋白l介質(zhì)洗脫的任何合適的溶液進(jìn)行。這可以例如是具有ph4或更低，例如ph2.5-4或2.8-3.5的溶液或緩沖液。在一些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液或洗脫緩沖液梯度包含至少一種單-、二-或三官能的羧酸或這樣的羧酸的鹽。在某些實(shí)施方案中，洗脫緩沖液或洗脫緩沖液梯度包含至少一個(gè)選自乙酸鹽、檸檬酸鹽、甘氨酸、琥珀酸鹽、磷酸鹽和甲酸鹽的陰離子種類(lèi)。

在一些實(shí)施方案中，清潔液是堿性的，例如具有12-14的ph。這樣的溶液提供基質(zhì)的有效清潔，特別是在區(qū)間的上端。

在某些實(shí)施方案中，清潔液包含0.01-1.0mnaoh或koh，例如0.05-1.0或0.05-0.1mnaoh或koh。本發(fā)明的多肽的高穩(wěn)定性使得使用這樣的比較強(qiáng)的堿性溶液成為可能。

在一些實(shí)施方案中，步驟a)-d)重復(fù)至少10次，例如至少50次或50-200次。這對(duì)過(guò)程經(jīng)濟(jì)是重要的，因?yàn)榛|(zhì)可重復(fù)利用多次。

實(shí)施例

蛋白的突變發(fā)生

從在us6822075(seqidno:1)中公開(kāi)的，含有4個(gè)κ輕鏈-結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白l設(shè)計(jì)單體構(gòu)建體。這些被編號(hào)為1、2、3和4，從n-末端開(kāi)始(圖1)。dna片段購(gòu)自dna合成公司(dna2.0)。4個(gè)單體構(gòu)建體在pjexpress201克隆載體中制備，每個(gè)具有n-末端半胱氨酸。對(duì)構(gòu)建體的概述，見(jiàn)seqidno:2、4、5、12。

構(gòu)建體被亞克隆至表達(dá)載體pgo，其含有大腸桿菌gap啟動(dòng)子和用于靶蛋白的周質(zhì)定位的ompa信號(hào)肽序列。編碼4個(gè)結(jié)構(gòu)域的序列通過(guò)用含有分別在5’側(cè)和3’側(cè)上的fspi和psti的限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸擴(kuò)增來(lái)制備。制備的編碼每個(gè)結(jié)構(gòu)域的dna片段用fspi和psti(newenglandbiolabs)消化。單獨(dú)地，表達(dá)載體用fspi和psti消化來(lái)制備，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化并回收。將兩者混合并用quick連接試劑盒(newenglandbiolabs)連接。用熱休克方法，將表達(dá)每個(gè)結(jié)構(gòu)域的連接的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌k12株。

結(jié)構(gòu)域3中的氨基酸n10、n45、q19和n60的進(jìn)一步的突變?cè)趌ac操縱子控制機(jī)制下，在含有t5啟動(dòng)子的表達(dá)載體pjexpress401(dna2.0)中制備(seqidno:7-11,13-14)。設(shè)計(jì)含有和不含ompa信號(hào)肽，但無(wú)c-末端半胱氨酸的構(gòu)建體。

結(jié)構(gòu)域3的四聚體，含n45、n10和n60突變的結(jié)構(gòu)域3的二聚體、四聚體和六聚體也在含有和不含c-末端半胱氨酸的pjexpress401中制備(seqidno:15-18)。

構(gòu)建體表達(dá)和純化

于37℃，在裝有補(bǔ)充有25mg/l卡那霉素的lb-肉湯(10g蛋白胨、5g酵母提取物、5gnacl)的搖瓶中培養(yǎng)大腸桿菌k12重組細(xì)胞，直至600nm的光學(xué)密度達(dá)到0.8。在此點(diǎn)，蛋白表達(dá)用1mm的最終濃度的異丙基β-d-1-硫代半乳吡喃糖苷(vwrinternational)誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)后，溫度下降至30℃并將培養(yǎng)物培養(yǎng)5小時(shí)。停止培養(yǎng)并將細(xì)胞以4000xg離心15分鐘，棄去上清液。使細(xì)胞再次懸浮于含磷酸緩沖鹽水(pbs)的1/10培養(yǎng)體積中并使用脈沖聲波降解法超聲處理2分鐘的有效時(shí)間。經(jīng)超聲處理的樣品通過(guò)以6000xg離心30分鐘從細(xì)胞碎片澄清，接著用具有0.2μm孔徑的膜微濾。

純化的配體用lc-ms分析以確定純度并確定分子量對(duì)應(yīng)于期望值(基于氨基酸序列)。

實(shí)施例1

表1中列出的純化的單體配體(在非-突變單一結(jié)構(gòu)域的情況下，還包含在c末端的半胱氨酸和在n-末端的aqv序列)，使用gehealthcare的胺偶聯(lián)試劑盒(用于芯片上羧甲基上的胺的碳二亞胺偶聯(lián))，以足以在biacore儀器(gehealthcare,sweden)中給出約1000ru的信號(hào)強(qiáng)度的量，在biacorecm5傳感器芯片(gehealthcare,sweden)上固定化。為跟蹤固定化表面的igg結(jié)合能力，使1mg/ml人多克隆igg(gammanorm)流過(guò)芯片并記錄信號(hào)強(qiáng)度。然后表面經(jīng)原位清洗(cip)，即于室溫(22+/-2℃)下，用100mmnaoh沖洗10分鐘。重復(fù)96個(gè)周期并在每個(gè)周期后按igg結(jié)合能力(信號(hào)強(qiáng)度)的相對(duì)損失，跟蹤固定化配體的堿穩(wěn)定性。對(duì)于非-突變結(jié)構(gòu)域的結(jié)果示于圖2中并表明結(jié)構(gòu)域1具有比其它結(jié)構(gòu)域明顯更低的堿穩(wěn)定性，和結(jié)構(gòu)域3具有最高的堿穩(wěn)定性。對(duì)于結(jié)構(gòu)域3的單一-結(jié)構(gòu)域天冬酰胺突變體的結(jié)果示于圖3并表明與親本結(jié)構(gòu)域3(其被用作與突變平行的參比)比較，所有突變體的堿穩(wěn)定性改進(jìn)。

表1

實(shí)施例2

表2中列出的純化的多結(jié)構(gòu)域配體，使用gehealthcare的胺偶聯(lián)試劑盒(用于芯片上羧甲基上的胺的碳二亞胺偶聯(lián))，以足以在biacore儀器(gehealthcare,sweden)中給出約1000ru的信號(hào)強(qiáng)度的量，在biacorecm5傳感器芯片(gehealthcare,sweden)上固定化。蛋白l在n-末端具有另外的aihnra序列。為跟蹤固定化表面的igg結(jié)合能力，使1mg/ml人多克隆igg(gammanorm)流過(guò)芯片并記錄信號(hào)強(qiáng)度。然后表面經(jīng)原位清洗(cip)，即于室溫(22+/-2℃)下，用100mmnaoh沖洗10分鐘。重復(fù)96個(gè)周期并在每個(gè)周期后按igg結(jié)合能力(信號(hào)強(qiáng)度)的相對(duì)損失，跟蹤固定化配體的堿穩(wěn)定性。結(jié)果示于表2和圖4中并表明與蛋白l(其作為參比平行運(yùn)行)比較，四聚體結(jié)構(gòu)域3具有改進(jìn)的堿穩(wěn)定性。

表2

實(shí)施例3

使表3中列出的純化的多結(jié)構(gòu)域配體在biacorecm5傳感器芯片上固定化，并通過(guò)用于實(shí)施例2的方法評(píng)價(jià)。配體的名稱(chēng)末端的-cys表明，配體除了由seqidno:16-18定義的序列外，還具有c-末端半胱氨酸。結(jié)果示于表3和圖5并表明與蛋白l(其作為參比平行運(yùn)行)比較，所有的突變結(jié)構(gòu)域3二聚體、四聚體和六聚體具有改進(jìn)的堿穩(wěn)定性。

表3

實(shí)施例4

表4的純化的二聚體、四聚體和六聚體配體使用下面描述的方法在瓊脂糖珠上固定化并對(duì)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果示于表4。

表4

激活

所用的基礎(chǔ)基質(zhì)是依據(jù)us6602990的方法制備的85微米(體積-加權(quán)的)中值直徑的剛性交聯(lián)瓊脂糖珠，且對(duì)于mw110kda的葡聚糖具有對(duì)應(yīng)于逆凝膠過(guò)濾色譜kav值0.70的孔徑(依據(jù)在gelfiltrationprinciplesandmethods,pharmacialkbbiotechnology1991,pp6-13中描述的方法)。

于25℃，將25ml(g)排干的基礎(chǔ)基質(zhì)、10.0ml蒸餾水和2.02gnaoh在帶有機(jī)械攪拌器的100ml燒瓶中混合10min。加入4.0ml表氯醇并進(jìn)行反應(yīng)2小時(shí)。激活的凝膠用10個(gè)凝膠沉降體積(gv)的水洗滌。

偶聯(lián)

激活的凝膠用5gv0.2m磷酸鹽/1mmedtaph11.5(偶聯(lián)緩沖液)洗滌。將15ml凝膠+13mg配體/ml凝膠(5.0ml)+5.5ml偶聯(lián)緩沖液+4.7g硫酸鈉在50ml燒瓶中混合并于30℃攪拌18.5h。ph經(jīng)測(cè)量為10.8。

固定后，凝膠用蒸餾水洗滌3xgv，然后用0.1m磷酸鹽/1mmedtaph8.5洗滌5xgv。將凝膠+1gv{0.1m磷酸鹽/1mmedta/7.5%硫代甘油ph8.5}混合并于45℃，在燒瓶中攪拌2小時(shí)又20分鐘。然后凝膠用1xgv0.1mhac和1xgv{0.1mtris/0.15mnaclph8.5}交替洗滌，然后用蒸餾水洗滌(6xgv)。將凝膠樣品送至外部實(shí)驗(yàn)室用于氨基酸分析并從總氨基酸含量計(jì)算配體含量(mg/ml凝膠)。所用的偶聯(lián)方案提供多點(diǎn)偶聯(lián)，每個(gè)結(jié)構(gòu)域的數(shù)個(gè)賴(lài)氨酸附接于凝膠。

2ml樹(shù)脂被填充于tricorn?5100柱中。

蛋白

a)從木瓜蛋白酶-消化的iggmab制備的純化的fab，在平衡緩沖液中稀釋至1mg/ml。

b)從熱-處理的大腸桿菌上清液制備的純化的dab，在平衡緩沖液中稀釋至1mg/ml。dab僅含有κ輕鏈，而無(wú)任何抗原-結(jié)合位點(diǎn)。

平衡緩沖液

apb磷酸鹽緩沖液20mm+0.15mnacl，ph7,4(medicago)

吸附緩沖液

apb磷酸鹽緩沖液20mm+0.15mnacl，ph7.4(medicago)

洗脫緩沖液

25mm檸檬酸鹽ph2.5

穿透能力用?ktaexplorer10系統(tǒng)，以4分鐘的滯留時(shí)間測(cè)定。然后使平衡緩沖液通過(guò)旁路柱，直到獲得穩(wěn)定的基線(xiàn)。這在自動(dòng)歸零之前進(jìn)行。將樣品施加于柱直至獲得100%uv信號(hào)。然后，再次應(yīng)用平衡緩沖液直至獲得穩(wěn)定的基線(xiàn)。

將樣品裝載于柱直至達(dá)到uv信號(hào)85%的最大吸光度。然后用平衡緩沖液洗滌柱并以0.5ml/min的流速(ph2.5)洗脫。

為計(jì)算在10%時(shí)的穿透能力，采用以下方程。那是裝載到柱中直至柱流出液中的fab/dab濃度是進(jìn)料中fab/dab濃度的10%的fab/dab的量。

a100%=100%uv信號(hào)；

asub=來(lái)自非-結(jié)合蛋白的吸光度貢獻(xiàn)；

a(v)=給定的應(yīng)用體積的吸光度；

vc=柱體積；

vapp=直至10%穿透的應(yīng)用體積；

vsys=系統(tǒng)死體積；

c0=進(jìn)料濃度。

計(jì)算10%穿透的動(dòng)態(tài)結(jié)合能力(dbc)并對(duì)曲線(xiàn)的表現(xiàn)進(jìn)行研究。還關(guān)于結(jié)合、洗脫和cip峰，對(duì)曲線(xiàn)進(jìn)行了研究。對(duì)10和80%穿透，計(jì)算動(dòng)態(tài)結(jié)合能力(dbc)。

本書(shū)面說(shuō)明書(shū)使用實(shí)施例來(lái)公開(kāi)本發(fā)明，包括最佳模式，并且還能使本領(lǐng)域的任何技術(shù)人員實(shí)踐本發(fā)明，包括制造和使用任何設(shè)備或系統(tǒng)并執(zhí)行任何結(jié)合的方法。本發(fā)明的可專(zhuān)利性范圍由權(quán)利要求書(shū)限定，并且可包括本領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)想的其它實(shí)施例。如果這樣的其它實(shí)施例具有與權(quán)利要求書(shū)的文字語(yǔ)言相同的結(jié)構(gòu)要素，或如果它們包括與權(quán)利要求書(shū)的文字語(yǔ)言無(wú)實(shí)質(zhì)性差異的等同結(jié)構(gòu)要素，則打算使這樣的其它實(shí)施例落入權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。本文中提及所有專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中，如同它們單獨(dú)結(jié)合到本文中一樣。