本發明屬生命科學和生物
技術領域：
，特別涉及檢測CYP2C9基因第3、7號外顯子突變的ARMS引物，采用普通PCR技術和凝膠電泳，可用于快速檢測CYP2C9基因多態位點的突變情況。
背景技術：
：人類基因多態性在闡明人體對疾病、毒物的易感性與耐受性，對疾病臨床表現的多樣性，以及對藥物治療的反應性上都起著重要的作用。CYP2C9基因位于人類第10號染色體上，總長83529bp，共10個外顯子。CYP2C9是細胞色素P450酶(CYP)第二亞家族中的重要成員，占肝微粒體P450蛋白總量的20％。CYP2C9參與抗凝血藥、抗驚厥藥、降糖藥、非甾體類解熱鎮痛抗炎藥、抗高血壓藥以及利尿藥等多種藥物的羥化代謝，其中華法林、甲苯磺丁脲和苯妥因均為治療指數較窄的藥物。CYP2C9活性變化可導致這些藥物體內濃度出現較大變化，甚至導致嚴重藥物不良反應的發生。CYPC2C9*2(rs1799853，C430T，Arg144Cys)和CYP2C9*3(rs1057910，A1075C，Ile359Leu)均導致CYP2C9酶活性降低，CYP2C9*3純合子個體酶活性僅為該位點野生型純合子基因型個體(攜帶CYP2C9*1或Arg144/Ile359等位基因)的4-6％。中國人群中CYPC2C9*2的頻率為0％，CYPC2C9*3的頻率為3％。CYP2C9遺傳多態性導致其酶活性變化，從而導致藥物代謝種族和個體差異現象。可用于CYP2C9基因分型的方法很多，包括如DNA直接測序法、雜交芯片法、焦磷酸測序法、變性高效液相色譜法、實時熒光定量法、限制性片段長度多態性(RFLP)以及擴增阻礙突變系統(ARMS)等等。其中，DNA測序法為基因分型的金標準，但該方法在臨床應用上存在一些限制：檢測的靈敏度不高，費時，操作復雜，易污染，通量小等。限制性片段長度多態性僅適用于突變位點附近存在適當的特定限制性內切酶識別序列的情況，應用局限性較大。雜交芯片檢測方法存在假陽性率高、退火溫度要求精確，特異性不高的問題；Taqman法探針制備以及配套使用的儀器設備昂貴，準確性不高。擴增阻滯突變系統利用Taq酶沒有3’→5’的外切酶活性，當3’末端堿基發生錯配，不能有效擴增的原理。基因分型檢測通常包括兩個互補的PCR反應，使用相同的DNA模板和一條相同的共有引物和反應條件，區別僅在于與共有引物配對的ARMS引物不同，野生型ARMS引物3’末端與野生型模板匹配，突變型ARMS引物設計時將突變位點設計在3’端，與突變型模板匹配，使兩個反應選擇性擴增特定的DNA模板，即3’末端不匹配引物的延伸受到阻礙，通常還在3’末端2-4個堿基人為設置錯配堿基，以提高錯配引物的選擇擴增性。技術實現要素：本發明的目的是針對現有檢測CYP2C9基因多態性所存在的問題而提供一種基于ARMS-PCR的方法檢測CYP2C9基因多態性的ARMS引物，可用于快速、有效檢測待測者CYP2C9基因多態位點的突變情況。為了實現上述發明目的，本發明所采用的技術方案如下：針對CYPC2C9*2(rs1799853，C430T，Arg144Cys)和CYP2C9*3(rs1057910，A1075C，Ile359Leu)每個SNP的序列改變而設計的特異性ARMS引物和共用引物，特異性ARMS引物于3’末端第二位或三位引入錯配堿基(下劃線標記堿基)，以此擴大特異性引物3’末端堿基與DNA模版上SNP位點堿基互補和不互補情況下擴增效率間的差距，從而大幅提高檢測的特異性和準確性。其中：一種檢測CYP2C9基因多態性的ARMS引物，包括：檢測CYPC2C9*2(rs1799853，C430T，Arg144Cys)基因的引物，其堿基序列為：共用引物2C9*2-CR：CCAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAG；用于檢測位點CYPC2C9rs1799853，C的特異性引物為下列核苷酸序列之一：2C9*2-W1：GGGAAGAGGAGCATTGAGGGCC；2C9*2-W2：GGGAAGAGGAGCATTGAGGTCC；用于檢測位點CYPC2C9rs1799853，T的特異性引物為下列核苷酸序列之一：2C9*2-M1：GGGAAGAGGAGCATTGAGGGCT；2C9*2-M2：GGGAAGAGGAGCATTGAGGTCT；檢測CYPC2C9*3(rs1057910，A1075C，Ile359Leu)基因的引物，其堿基序列為：共用引物2C9*3-CR：ACCTTGGGAATGAGATAGTTTCTGAAT；用于檢測位點CYPC2C9rs1057910，A的特異性引物為下列核苷酸序列之一：2C9*3-W1：GTGCACGAGGTCCAGAGATAGA；2C9*3-W2：GTGCACGAGGTCCAGAGATAAA；用于檢測位點CYPC2C9rs1057910，C的特異性引物為下列核苷酸序列之一：2C9*3-W1：GTGCACGAGGTCCAGAGATAGC；2C9*3-W2：GTGCACGAGGTCCAGAGATAAC。在本發明的一個優選實施例中，當檢測位點為CYPC2C9*2(rs1799853)時，使用引物組合為共用下游引物2C9*2-CR以及ARMS引物對2C9*2-W2/2C9*2-M2。在本發明的一個優選實施例中，當檢測位點為CYPC2C9*3(rs1057910)時，使用引物組合為共用下游引物2C9*3-CR以及ARMS引物對2C9*3-W2/2C9*3-M2。本發明操作簡單、檢測結果準確可靠，具體有益效果如下：1、回避了家族基因間序列相近區域，避免家族基因間序列的相近區域引起的非特異性擴增，此引物組的設計具有特異性強的優點。2、引入的堿基錯配，提高了引物對SNP的識別能力，使引物能有效識別一個堿基的差異，擴大了最適退火溫度范圍，避免了因退火溫度要求精確所導致檢測結果的假陽性發生，提高了檢測準確性和可靠性。3、檢測方法簡單，無需昂貴設備，僅需要PCR和電泳設備就能完成試驗。4、操作快速便捷，檢測用時短，可在2小時內完成分型工作。附圖說明圖1為CYPC2C9*2(rs1799853)和CYPC2C9*3(rs1057910)的分型電泳圖。圖中所用的marker為Takara公司的50bp的marker。最下面的條帶為50bp，倒數第二條為100bp。左側是檢測樣本CYP2C9*2，從左至右擴增使用的引物分別為2C9*2-W1、2C9*2-M1、2C9*2-W2和2C9*2-M2；右側是檢測樣本CYP2C9*3，從左至右擴增使用的引物分別為2C9*3-W1、2C9*3-M1、2C9*3-W2和2C9*3-M2。圖2為CYPC2C9*2的Sanger測序驗證圖譜。圖中對樣本使用Sanger測序檢測CYPC2C9*2(rs1799853，C430T，Arg144Cys)，圖中框顯示的是多態性位點。圖3為CYPC2C9*3的Sanger測序驗證圖譜。對樣本使用Sanger測序檢測CYPC2C9*3(rs1057910，A1075C，Ile359Leu)，圖中框顯示的是多態性位點。具體實施方式本發明依據ARMS-PCR原理，優選了CYPC2C9的8條特異性引物，包括針對rs1799853的四條特異性引物(2C9*2-W1/2C9*2-M1，2C9*2-W2/2C9*2-M2)；針對rs1057910的四條特異性引物(2C9*3-W1/2C9*3-M1，2C9*3-W2/2C9*3-M2)。這8條特異性引物的3’端堿基與對應SNP位點的兩種不同的堿基相互補，并在3’末端的第二位或第三位引入錯配堿基，錯配堿基的引入可以擴大特異性引物與互補的模版和非互補模版結合后的擴增效率差異，使特異性引物的最佳退火范圍擴大，避免非特異性擴增的產生，提高了檢測的準確性和特異性。經實驗測試，這些引物可在55度～60度范圍內進行退火，進行特異性擴增，最大可能的避免了假陽性的發生。本發明還優選了2條共用下游引物，包括針對rs1799853的2C9*2-CR；針對rs1057910的2C9*3-CR。這2條引物通過在人類基因組數據庫中檢測，回避了家族基因間基因序列的一致的區域，避免與目的片段外模版序列的結合，提高了擴增的特異性。本發明可選取針對同一檢測位點的特異性引物中的任意一條和其對應的下游共用引物結合，組成此為點的檢測引物組合，實現對檢測位點的特異性擴增檢測。檢測位點為CYPC2C9*2(rs1799853)時，使用引物組合為共用下游引物2C9*2-CR，以及ARMS引物對2C9*2-W2/2C9*2-M2、2C9*2-W2/2C9*2-M2兩對特異性引物中任意一對；檢檢測位點為CYPC2C9*3(rs1057910)時，使用引物組合為共用下游引物2C9*3-CR，以及ARMS引物對2C9*3-W2/2C9*3-M2、2C9*3-W2/2C9*3-M2兩對特異性引物中任意一對。下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發明。實施例1一種基于ARMs-PCR法的CYPC2C9基因分型檢測PCR擴增反應液擴增反應液為20ul，使用NEB公司的Q5hifiDNApilymerase試劑裝，包含5xQ5buffer、5xGCbuffer、dNTP、Q5hifiDNApilymerase和5xGCenhancer。PCR反應管每人份2個，1～2號管為特異性反應管。具體見表1表1實施例2一種基于ARMs-PCR法的CYPC2C9基因分型檢測的操作步驟(1)提取受檢者全血DNA或唾液DNA，稀釋成20ng/ul的DNA溶液；(2)PCR擴增：檢測在常規PCR儀上進行，反應條件見表2：表2PCR擴增體系試劑配制方法見表3：表35xQ5buffer4ul5xGCbuffer4ul10mMdNTP0.4ulQ5hifiDNApilymerase0.2ul5xGCenhancer4ultemplateDNA20ng10uMForwardPrimer1ul10uMReversePrimer1ulNuclease-freewaterupto20ul(3)電泳：2％瓊脂糖凝膠電泳，110V，25min。在凝膠成像系統中拍照，獲得電泳結果圖。根據目的條帶的有無，進行基因型分析。若PCR反應管中，如無任何產物帶，僅有引物二聚體帶(小于100bp)，判斷為擴增失敗。若PCR反應管中，野生型引物擴增有目的產物，而特異型ARMS引物擴增后沒有條帶，則判讀為野生型；若PCR反應管中，特異型ARMS引物擴增沒有目的產物，而野生型引物擴增后有條帶，則判讀為突變純合型；若PCR反應管中，野生型引物和特異型ARMS引物擴增都有目的產物，則判讀為雜合型。圖中所用的marker為Takara公司的50bp的marker。樣本為同一個人的基因組DNA。左側是檢測樣本CYP2C9*2，從左至右擴增使用的引物分別為2C9*2-W1、2C9*2-M1、2C9*2-W2和2C9*2-M2。可以從圖中看出兩對引物都是野生型引物擴增有目的產物，而特異型ARMS引物擴增后沒有條帶，判讀為野生型；右側是檢測樣本CYP2C9*3，從左至右擴增使用的引物分別為2C9*3-W1、2C9*3-M1、2C9*3-W2和2C9*3-M2。可以從圖中看出兩對引物都是野生型引物擴增有目的產物，而特異型ARMS引物擴增后沒有條帶，判讀為野生型。經DNA直接測序驗證，如圖2、圖3所示，完全與上述結果一致，樣本的CYP2C9*2和CYP2C9*3均為野生型。上述結果表明，本發明的ARMS引物來檢測CYP2C9基因多態性的方法可靠，靈敏度高，操作簡單，判讀結果客觀。序列表SEQUENCELISTING<110>上海派森諾生物科技股份有限公司<120>用于檢測CYP2C9基因多態性的ARMS引物<130><160>10<170>PatentInversion3.3<210>1<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>1ccagtaaggtcagtgatatggagtag26<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2gggaagaggagcattgagggcc22<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3gggaagaggagcattgaggtcc22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4gggaagaggagcattgagggct22<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5gggaagaggagcattgaggtct22<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>6accttgggaatgagatagtttctgaat27<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>7gtgcacgaggtccagagataga22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>8gtgcacgaggtccagagataaa22<210>9<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>9gtgcacgaggtccagagatagc22<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>8gtgcacgaggtccagagataac22當前第1頁1 2 3