本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻gw5基因在培育粒型改變的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

水稻是重要的糧食作物，世界上一半以上的人口以稻米為主食。隨著耕地的減少、人口的增多以及氣候的變化，提高水稻的產(chǎn)量對解決未來全球的糧食安全問題具有十分重要的戰(zhàn)略意義。谷粒重量是決定水稻產(chǎn)量的重要性狀，提高籽粒重量是一條有效的增產(chǎn)途徑，籽粒重量主要受粒型影響，同時，粒型對水稻的市場價值也有重要影響，不同地域人群對粒型的偏好不同。目前，對粒型基因的分子調(diào)控機(jī)制及遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究非常有限。故解析水稻粒型相關(guān)基因的遺傳調(diào)控機(jī)理，對水稻分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)體系的建立有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供如下1)-3)中任一種物質(zhì)的新用途。

本發(fā)明提供了如下1)-3)中任一種物質(zhì)在調(diào)控植物粒型中的應(yīng)用：

1)蛋白gw5；

2)編碼蛋白gw5的dna分子；

3)含有編碼蛋白gw5的dna分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌；

所述蛋白gw5為如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。

上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

本發(fā)明另一個目的是提供如下1)-3)中任一種物質(zhì)的用途。

本發(fā)明提供的如下1)-3)中任一種物質(zhì)在培育粒型改變植物中的應(yīng)用：

1)蛋白gw5；

2)編碼蛋白gw5的dna分子；

3)含有編碼蛋白gw5的dna分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌；

所述蛋白gw5為如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。

上述應(yīng)用中，所述編碼蛋白gw5的dna分子是如下1)至5)中任一所述的dna分子：

1)序列表中序列1所示的dna分子；

2)序列表中序列1第17-1426位核苷酸；

3)序列表中序列3所示的dna分子；

4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)所限定的dna分子雜交且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的dna分子；

5)與1)或2)或3)所限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的dna分子。

上述嚴(yán)格條件可為在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

上述應(yīng)用中，所述調(diào)控植物粒型或所述粒型改變均為降低籽粒粒寬、降低籽粒粒厚、降低籽粒千粒重、降低穎殼細(xì)胞數(shù)目和/或增加籽粒粒長。

上述應(yīng)用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；

所述單子葉植物具體為水稻。

本發(fā)明第三個目的是提供一種培育粒型改變的轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明提供的方法，為將編碼蛋白gw5的dna分子導(dǎo)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；

所述轉(zhuǎn)基因植物籽粒的粒寬、粒厚、千粒重和/或穎殼細(xì)胞數(shù)目均低于所述目的植物；

和/或，所述轉(zhuǎn)基因植物籽粒的粒長高于所述目的植物；

所述蛋白gw5為如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。

上述方法中，所述編碼蛋白gw5的dna分子是如下1)至5)中任一所述的dna分子：

1)序列表中序列1所示的dna分子；

2)序列表中序列1第17-1426位核苷酸；

3)序列表中序列3所示的dna分子；

4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)所限定的dna分子雜交且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的dna分子；

5)與1)或2)或3)所限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的dna分子。

上述方法中，所述編碼蛋白gw5的dna分子通過重組載體導(dǎo)入所述目的植物中。

上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；

所述單子葉植物具體為水稻。

本發(fā)明第四個目的是提供一種重組載體。

本發(fā)明提供的重組載體，為將編碼蛋白gw5的dna分子插入表達(dá)載體中，得到表達(dá)蛋白gw5的重組載體；

所述蛋白gw5為如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。

在本發(fā)明中，重組載體為在pcambia1390載體bamhⅰ酶切位點(diǎn)間插入序列表中序列1所示的gw5基因得到的載體。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將gw5基因轉(zhuǎn)入野生型水稻中，得到轉(zhuǎn)基因水稻，其余野生型水稻相比，gw5基因過量表達(dá)，水稻的粒寬和粒重顯著減少，粒長顯著增加，葉片變細(xì)變長，葉夾角增大，另外細(xì)胞學(xué)觀察表明gw5基因過量表達(dá)使水稻的穎殼橫向細(xì)胞分裂顯著增加。因此gw5基因與粒型相關(guān)，為提高粒型改變的轉(zhuǎn)基因植物培育奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明對于進(jìn)一步闡明植物籽粒發(fā)育分子機(jī)理并通過基因工程手段培育優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的作物新品種具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

附圖說明

圖1為pcambia1390載體圖譜。

圖2為野生型水稻nipponbare與gw5基因過量表達(dá)水稻的表型。

圖3為野生型水稻nipponbare與gw5基因過量表達(dá)水稻的粒長、粒寬、粒厚以及千粒重統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

圖4為野生型水稻nipponbare與gw5基因過量表達(dá)水稻的表達(dá)檢測。

圖5為野生型水稻nipponbare和gw5基因過量表達(dá)水稻水稻的穎殼橫向細(xì)胞增 殖情況。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

n6培養(yǎng)基購自美國phytotechnologylaboratories，貨號為c167。

水稻品種nipponbare(oryzasativa)和水稻品種kasalath(oryzasativa)在文獻(xiàn)“l(fā)iz,wanj,xiaj,etal.mappingofquantitativetraitlocicontrollingphysico-chemicalpropertiesofricegrains(oryzasatival.).breedingscience,2003,53(3):209-215”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。

根癌農(nóng)桿菌eha105(agrobacteriumtumefacienseha105)在文獻(xiàn)“hood,elizabethe；gelvin,stantonb；melchers,leos；hoekema,andre.1993.newagrobacteriumhelperplasmidsforgenetransfertoplants.transgenicresearch，2(4):p.208-218-218”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。

pcambia1390載體為商業(yè)化載體，公眾可通過商業(yè)渠道購買到，也可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。

實(shí)施例1、gw5基因在培育粒型改變的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用

一、過表達(dá)載體pcambia1390-gw5的構(gòu)建

1、gw5基因的獲得

提取野生型kasalath的總rna并反轉(zhuǎn)錄為cdna，以其cdna為模板，以gw5-cds-f和gw5-cds-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到1442bp的gw5基因(具有序列1所示的核苷酸,序列1第17-1426位核苷酸為gw5基因的開放閱讀框序列,序列1第1-16及第1427-1442位核苷酸為連載體用載體接頭序列)。

gw5基因的基因組序列為序列3，gw5基因的cdna為序列1，其編碼蛋白gw5，蛋白gw5的氨基酸序列為序列表中序列2。

引物如下：

gw5-cds-f:5’-gcaggtcgacggatccatgggcaaggcggcgcggtggtt-3’(下劃線序列為載體接頭序列)

gw5-cds-r:5’-gaattcccggggatcctcaccacctcctctgcaagaacgcgtg-3’(下劃線序列為載體接頭序列)

2、gw5過表達(dá)載體的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶bamhⅰ酶切pcambia1390載體，回收約12060bp的線性質(zhì)粒，得到載體大片段，pcambia1390載體環(huán)狀載體圖譜如圖1所示。利用clontech公司的in-fusion酶(www.clontech.com，貨號：st0344)將12060bp的線性質(zhì)粒與上述1 獲得的gw5基因in-fusion連接，得到重組質(zhì)粒，記作pcambia1390–gw5。(片段通過兩端所加載體接頭序列同源重組進(jìn)載體)

pcambia1390–gw5送去測序，重組質(zhì)粒pcambia1390–gw5為在pcambia1390載體bamhⅰ酶切位點(diǎn)間插入序列表中序列1第17-1426位所示的gw5基因得到的載體。

二、轉(zhuǎn)gw5水稻的獲得

1、重組菌的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pcambia1390–gw5導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌eha105，得到重組農(nóng)桿菌eha105/pcambia1390–gw5。

2、gw5基因過量表達(dá)轉(zhuǎn)gw5水稻獲得

將eha105/pcambia1390–gw5轉(zhuǎn)入水稻nipponbare(oryzasativa)(以下簡稱野生型水稻)胚的愈傷組織中，具體步驟如下：

(一)用含50μmol/l卡那霉素的液體lb培養(yǎng)基懸浮重組農(nóng)桿菌eha105/pcambia1390–gw5，得到od600nm≈0.5的菌懸液。

(二)取野生型水稻的成熟胚愈傷組織與步驟(一)得到的菌懸液混合，侵染30min，用濾紙吸干菌液后將愈傷組織放置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基(含0.03924mg/l乙酰丁香酮的固體n6培養(yǎng)基)上，24℃培養(yǎng)3天。

(三)將步驟(二)得到的愈傷接種至含150mg/lg418的固體n6培養(yǎng)基上，24℃培養(yǎng)16天。

(四)取步驟(三)得到的健康愈傷組織，接種至含200mg/lg418的固體n6培養(yǎng)基上，24℃培養(yǎng)，每15天繼代一次。

(五)取步驟(四)得到的健康愈傷組織，接種至分化培養(yǎng)基(含150mg/lg418、2mg/l激動素、0.05mg/l萘乙酸的固體n6培養(yǎng)基)上，24℃培養(yǎng)45天(此時植株地上部分高度約為15cm)，打開瓶口煉苗3天，然后移栽至溫室栽培，即為t0代植株。

(六)將t0代植株自交，收獲種子并培育為植株，即為t1代植株。

3、轉(zhuǎn)gw5水稻的pcr鑒定

分別提取t0代轉(zhuǎn)gw5水稻植株和t1代轉(zhuǎn)gw5水稻植株的基因組dna作為模板，以1390-f和gw5-r為引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

引物如下：

1390-f：5'-tgccttcatacgctatttatttgc-3'；

gw5-r：5'-gccgcacacgctcttggtc-3'。

1390-f對應(yīng)于圖1載體上的10707-10730bp,gw5-r引物對應(yīng)于序列1中的第1059-1078bp,如果pcr擴(kuò)增出大小約為1284bp的條帶，則說明為植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株。

對于某一t0代植株，如果該植株及其t1代植株pcr鑒定均為陽性，該植株為純合的gw5基因過量表達(dá)植株，該植株及其自交后代為一個gw5基因過量表達(dá)株系，共得到18個t0代轉(zhuǎn)gw5水稻。

4、植株的mrna表達(dá)量的檢測

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因后代的gw5基因表達(dá)程度，利用實(shí)時定量pcr來檢測野生型水稻、及t0代轉(zhuǎn)gw5水稻體內(nèi)gw5基因的表達(dá)情況。實(shí)時定量pcr在定量pcr儀(7900real-time，appliedbiosystems)上按照appliedbiosystems提供的操作步驟進(jìn)行，以水稻ubiqutin基因作為反應(yīng)中的內(nèi)參。引物在60℃退火，反應(yīng)40個循環(huán)，每個樣品設(shè)置三個重復(fù)。反應(yīng)體系為25μl，其中包括2μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、0.25μm的正反向引物和12.5μlsybrgreen混合物(購自takara)。

實(shí)時定量pcr鑒定所使用的引物如下：

qrt-f：5'-tcctctgcaagaacgcgtggc-3'；

qrt-r：5'-gcttgagcggcgtgggcat-3'。

部分結(jié)果如圖4所示，與野生型水稻相比，t0代轉(zhuǎn)gw5水稻株系go-1、go-2和go-3中的gw5基因表達(dá)量顯著提高。

采用同樣的方法將pcambia1390載體導(dǎo)入野生型水稻，得到t2代轉(zhuǎn)空載體水稻。

t0代植株自交，收獲種子并培育為植株，即為t1代植株。

t1代植株自交，收獲種子并培育為植株，即為t2代植株。

三、轉(zhuǎn)gw5水稻的表型以及農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)

1、表型觀察

將t2代轉(zhuǎn)gw5水稻和野生型水稻在抽穗灌漿后，對水稻的株型和粒型進(jìn)行性狀考察和拍照。

結(jié)果如圖2所示。

圖2中，wt代表野生型水稻；gw5-ox代表t2代轉(zhuǎn)gw5水稻。

圖2a為水稻的株型，圖2b為水稻的粒形。

圖2表明，與野生型水稻相比，t2代轉(zhuǎn)gw5水稻的株型變散，葉片變細(xì)長，葉夾角變大，水稻籽粒寬度顯著減小，粒長顯著增加。

2、農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)

當(dāng)t2代轉(zhuǎn)gw5水稻、t2代轉(zhuǎn)空載體水稻和野生型水稻水稻籽粒成熟后，收獲烘干后在室溫下保存3個月，集成糙米，用于稻米粒長測定。

參照《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)》gb/t17981-1999，進(jìn)行水稻糙米和稻谷的粒型測定，重復(fù)3次，取平均值作為性狀表型值。

隨機(jī)挑選各水稻1000粒飽滿水稻稻粒，用千分之一電子天平稱重，重復(fù)三次，取平均值作為千粒重表型值。

結(jié)果如圖3。

圖3中，wt代表野生型水稻；gw5-ox代表t2代轉(zhuǎn)gw5水稻。

圖3a為稻粒的粒寬，圖3b為稻粒的粒長，圖3c為稻粒的粒厚，圖3d為1000粒飽滿水稻稻粒的千粒重。

圖3表明，與野生型水稻相比，t2代轉(zhuǎn)gw5水稻的粒寬、粒厚及千粒重顯著減少，粒長顯著增加。

t2代轉(zhuǎn)空載體水稻和野生型水稻水稻結(jié)果無顯著差異。

3、具體株系農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)

將t2代轉(zhuǎn)gw5水稻株系go-1、go-2和go-3、t2代轉(zhuǎn)空載體水稻和野生型水稻水稻籽粒成熟采用上述2的方法檢測粒型相關(guān)性狀。

結(jié)果如圖4和表1所示，

表1野生型及轉(zhuǎn)基因植株后代粒型相關(guān)性狀的統(tǒng)計(jì)

t2代轉(zhuǎn)空載體水稻和野生型水稻水稻結(jié)果無顯著差異。

可以看出，與野生型水稻相比，t2代轉(zhuǎn)gw5水稻的粒寬、粒厚及千粒重顯著減少，粒長顯著增加，且株型變散，葉片變細(xì)長，葉夾角變大。

4、穎殼橫向細(xì)胞增殖情況

利用石蠟切片在細(xì)胞學(xué)水平觀察野生型水稻nipponbare和t2代轉(zhuǎn)gw5水稻的穎殼橫向細(xì)胞增殖情況，具體如下：

將野生型水稻nipponbare和t2代轉(zhuǎn)gw5水稻株系的抽穗前15天的穎殼浸入faa固定液中，真空抽氣后固定24h以上。梯度酒精脫水，二甲苯透明，隨后用石蠟(paraplastplus,購自sigma)將二甲苯完全置換，利用包埋機(jī)(leicaeg1150)將樣品包埋于蠟塊中。根據(jù)材料幼嫩的程度，用切片機(jī)(leicarm2265)將組織切成8-10μm的薄片，切片用0.025％的甲苯胺藍(lán)溶液染色30min左右，滅菌水漂洗兩次后鏡檢，拍照。利用imagj軟件對穎殼最外層細(xì)胞數(shù)以及周長進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

結(jié)果如圖5所示。

圖5中，wt代表野生型水稻；gw5-ox代表t2代轉(zhuǎn)gw5水稻。

圖5a和5b分別為野生型水稻和t2代轉(zhuǎn)gw5水稻的穎殼橫切面。

圖5c和5d分別為野生型水稻和t2代轉(zhuǎn)gw5水稻的穎殼橫切面對應(yīng)的局部放大圖。

圖5表明，與野生型水稻相比，t2代轉(zhuǎn)gw5水稻的穎殼細(xì)胞數(shù)目明顯減少。