本發明涉及微生物領域，具體涉及一種快速擴增生產細菌纖維素菌種的方法。

背景技術：

細菌纖維素(Bacterial cellulose，BC)是指在不同條件下，由醋酸菌屬(Acetobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)和八疊球菌屬(Sarcina)等中的某種微生物合成的纖維素的統稱。與天然纖維素相比，細菌纖維素具有高純度、高結晶度、高抗張強度及高持水能力等優點，被認為是目前世界上性能最好的纖維素。作為一種新型的生物材料，其在食品、化妝品、生物醫學材料、醫藥、造紙及化工等領域均有良好的應用前景。自該產品面市以來，在國際市場上一直暢銷不衰。現有細菌纖維素生產企業的生產能力遠無法滿足市場對細菌纖維素的大量需求。因此改進細菌纖維素的發酵工藝得到理想的產量已成為當今的研究熱點。

細菌纖維素的制備方法目前主要為靜態培養與動態培養兩種。靜態培養周期較長，成本較高，細菌纖維素產量無法滿足大規模生產的要求，因此目前大都采用動態培養的方法。動態培養是指在培養過程中，將氧氣或空氣以氣泡形式通入培養容器中并結合機械攪拌的方式，人為的使原本氧氣含量十分有限的培養液含有接近空氣中的氧氣含量，制備細菌纖維素。有研究發現在動態培養條件下會產生菌種細胞變異體，變異體不具有產生纖維素的能力，因此動態培養時間過久會抑制纖維素的產量。

現有的細菌纖維素的生產技術，由于沒有將菌體生長繁殖與發酵生產分開，或選用的培養基、培養條件和發酵條件不合適，普遍存在細菌纖維素的生長周期長，產量低等缺點。因此現有一些研究逐漸將菌體增殖和發酵分開進行來縮短細菌纖維素的生長周期和提高產量。由于在菌體擴培過程中，往往會產生大量的纖維素，不僅束縛了菌體阻礙物質的傳遞，使菌體難以大量增殖，而且影響設備的使用，特別是在發酵罐中，會造成發酵罐難以清洗、發酵罐管道堵塞等問題，菌種難以大量擴培一直是阻礙細菌纖維素大規模工業生產的關鍵。因此，在菌種擴培時阻礙細菌纖維素聚集形成膜團可大大的提高細菌纖維素的產量。中國專利CN103740784 A通過在發酵過程中添加熒光增白劑培養后，可降低細菌纖維素纖維帶的聚集情況，從而降低細菌纖維素的結晶度。但該方法雖然能降低細菌纖維素纖維帶的聚集情況，但所添加熒光增白劑均具有一定的毒害性。

技術實現要素：

為了克服上述現有技術存在的缺陷和不足，本發明提供了一種快速擴增生產細菌纖維素菌種的方法。本方法簡單易行，成本低廉、安全可控，可使菌體在發酵罐中大量增殖，從而可有效的縮短生產時間和提高細菌纖維素的產量。

本發明的技術方案一方面公開了羧甲基纖維素鈉在快速擴增生產細菌纖維素菌種中的應用。

本發明的技術方案另一方面提供了一種快速擴增生產細菌纖維素菌種的方法，休眠的菌種經過斜面培養和搖瓶培養后，在發酵罐中進一步擴增培養，發酵罐中的種子培養基中含有羧甲基纖維素鈉。

在本發明的一些實施方式中，搖瓶培養和發酵罐中的培養基，均為種子培養基，組分一致。

在本發明的一些實施方案中，種子培養基中羧甲基纖維素鈉的粘度為200～1200mpa·s。

在本發明的一些實施方案中，種子培養基中羧甲基纖維素鈉的粘度為200～800mpa·s。

在本發明的一些實施方案中，種子培養基中羧甲基纖維素鈉的質量為培養基總質量的0.1％-2％。

在本發明的一些實施方案中，斜面培養的條件為將生產菌種接種于斜面培養基上，于25℃～32℃靜置培養2～3天。

在本發明的一些實施方案中，搖瓶培養是指刮取斜面0.8cm×1.0cm～1.6cm×2.0cm的菌苔于含種子培養基的三角搖瓶中，在25℃～32℃以100～200rpm的振速振蕩培養1～2天。

在本發明的一些實施方案中，發酵罐種子培養基中擴培的培養溫度為25℃～32℃，攪拌轉速為100～200rpm，培養時間為1～3天。

在本發明的一些實施方案中，產細菌纖維素的菌株選自木醋桿菌、醋化醋桿菌、產醋醋桿菌、巴氏醋桿菌、氣桿菌屬(Aerobacter)、根瘤桿菌屬、無色桿菌屬、土壤桿菌屬、假單胞桿菌屬、產堿桿菌屬、八疊球菌屬或動膠菌屬。

在本發明的一些實施方式中，斜面培養基的組分為(質量比)：蔗糖2％～4％，硫酸銨0.2％～0.6％，硫酸鎂0.01％～0.05％，氯化鈣0.01％～0.04％，七水硫酸亞鐵0.0003％～0.0010％，乙酸鈉0.04％～0.10％，酵母膏0.03％～0.10％，瓊脂2％，其余為水。

在本發明的一些實施方式中，種子培養基的組分為(質量比)：蔗糖2％～4％，硫酸銨0.2％～0.6％，硫酸鎂0.01％～0.05％，氯化鈣0.01％～0.04％，七水硫酸亞鐵0.0003％～0.0010％，乙酸鈉0.04％～0.10％，酵母膏0.03％～0.10％，瓊脂2％和羧甲基纖維素鈉0.1％～2％，其余為水。

在本發明的一些實施方式中，所用的器皿均為已滅菌的。

在本發明的一些實施方式中，所用的水均為純化水。

除非明確地說明與此相反，否則，本發明引用的所有范圍包括端值。例如，“種子培養基中羧甲基纖維素鈉的粘度為200～1200mpa·s”，表示種子培養基中羧甲基纖維素鈉的粘度為200≤μ≤1200mpa·s。

本發明使用的術語“或”表示備選方案，如果合適的話，可以將它們組合，也就是說，術語“或”包括每個所列出的單獨備選方案以及它們的組合。例如，“所述菌種選自木醋桿菌、醋化醋桿菌、產醋醋桿菌、巴氏醋桿菌、氣桿菌屬(Aerobacter)、根瘤桿菌屬、無色桿菌屬、土壤桿菌屬、假單胞桿菌屬、產堿桿菌屬、八疊球菌屬或動膠菌屬。”表示生產細菌纖維素的菌種選自生產菌株可以是木醋桿菌、醋化醋桿菌、產醋醋桿菌、巴氏醋桿菌、氣桿菌屬(Aerobacter)、根瘤桿菌屬、無色桿菌屬、土壤桿菌屬、假單胞桿菌屬、產 堿桿菌屬、八疊球菌屬或動膠菌屬之中的一種，也可以是其一種以上的組合。

本發明中的數字均為近似值，無論有否使用“大約”或“約”等字眼。數字的數值有可能會出現1％、2％、5％、7％、8％、10％等差異。每當公開一個具有N值的數字時，任何具有N+/-1％，N+/-2％，N+/-3％，N+/-5％，N+/-7％，N+/-8％或N+/-10％值的數字會被明確地公開，其中“+/-”是指加或減。

由于不同粘度的羧甲基纖維素鈉與細菌纖維素形成過程中羧甲基纖維素的氫鍵結合能力不同，當羧甲基纖維素鈉的粘度在200-1200mpa·s范圍內時，羧甲基纖維素與氫鍵的結合能力隨其粘度的增加而降低。當粘度在200-800mpa·s時，由于羧甲基纖維素與細菌纖維素的氫鍵有較強的結合能力，因此，可以完全阻止細菌纖維素的聚集，從而使菌體能達到大量擴培的目的，其菌體的數量可達到10¹¹～10¹²cfu/ml，而當羧甲基纖維素的粘度在800-1200mpa·s之間時，由于羧甲基纖維素與氫鍵的結合能力不夠強，因而導致其不能完全阻止細菌纖維素的聚集，最終導致具體的擴培數量可達10⁹～10¹⁰cfu/ml。

本發明在種子擴培過程中添加羧甲基纖維素鈉，可以阻礙細菌纖維素結晶，即阻止細菌纖維素微纖維形成帶纖維。該方法不僅解除了纖維素對菌體的束縛，加快物質傳遞，使菌體快速增殖，而且在罐中不形成膜團，加大了設備的利用率，減輕大規模生產難度。且羧甲基纖維素鈉主要用于食品、醫藥等領域，安全性高、價格低廉，在細菌纖維素生產中使用具有很大優勢。

與現有菌種擴培方法相比，本發明簡單易行，成本低廉、安全可控，既可解除纖維素對菌體的束縛，加快物質傳遞，使菌體快速增殖，又可在罐中不形成膜團，加大設備的利用率，減輕大規模生產難度。

附圖說明

圖1為對比例1搖瓶中形成膜團情況。

圖2為實施例3搖瓶中形成膜團情況。

圖3為實施例1搖瓶中菌液的鏡檢圖。

圖4為實施例3搖瓶中菌液的鏡檢圖。

具體實施方式

以下所述的是本發明的優選實施方式，本發明所保護的不限于以下優選實施方式。應當指出，對于本領域的技術人員來說在此發明創造構思的基礎上，做出的若干變形和改進，都屬于本發明的保護范圍。實施例中所用的原料均可以通過商業途徑獲得。

實施例1

斜面培養基為(質量比)：蔗糖2％，硫酸銨0.2％，硫酸鎂0.01％，氯化鈣0.01％，七水硫酸亞鐵0.0003％，乙酸鈉0.04％，酵母膏0.03％，瓊脂2％，其余為水。

搖瓶中與發酵罐中種子培養基為(質量比)：蔗糖2％，硫酸銨0.2％，硫酸鎂0.01％，氯化鈣0.01％，七水硫酸亞鐵0.0003％，乙酸鈉0.04％，酵母膏0.03％，粘度為1200mpa·s的羧甲基纖維素鈉0.1％，其余 為水。

(1)斜面種子培養：將木醋桿菌菌種接種于斜面培養基上，25℃靜置培養3天；

(2)搖瓶種子液培養：刮取0.8cm×1.0cm的斜面菌苔于含100mL種子培養基的500ml三角搖瓶中，25℃200rpm振蕩培養2天；

(3)發酵罐種子液擴培：將搖瓶種子液轉接于添加了10L種子培養基的發酵罐中，25℃200rpm擴培3天。

采用平板稀釋涂布計算活菌量的方法計數得發酵罐中菌濃可達5.20×10⁹cfu/ml，且罐中不產生細菌纖維素膜團。

實施例2

斜面培養基為(質量比)：蔗糖2％，硫酸銨0.2％，硫酸鎂0.03％，氯化鈣0.02％，七水硫酸亞鐵0.0003％，乙酸鈉0.04％，酵母膏0.03％，瓊脂2％，其余為水。

搖瓶中與發酵罐中種子培養基為(質量比)：蔗糖2％，硫酸銨0.2％，硫酸鎂0.03％，氯化鈣0.02％，七水硫酸亞鐵0.0003％，乙酸鈉0.04％，酵母膏0.03％，粘度為800mpa·s的羧甲基纖維素鈉0.5％，其余為水。

(1)斜面種子培養：將木醋桿菌菌種接種于斜面培養基上，28℃靜置培養2天；

(2)搖瓶種子液培養：刮取0.8cm×1.0cm的斜面菌苔于含100mL種子培養基的500mL三角搖瓶中，28℃150rpm振蕩培養1.5天；

(3)發酵罐種子液擴培：將搖瓶種子液轉接于添加了10L種子培養基的發酵罐中，28℃150rpm擴培2天。

采用平板稀釋涂布計算活菌量的方法計數得發酵罐中菌濃可達3.86×10¹²cfu/ml，且罐中不產生細菌纖維素膜團。

實施例3

斜面培養基為(質量比)：蔗糖3％，硫酸銨0.4％，硫酸鎂0.03％，氯化鈣0.02％，七水硫酸亞鐵0.0006％，乙酸鈉0.08％，酵母膏0.07％，瓊脂2％，其余為水。

搖瓶中與發酵罐中種子培養基為(質量比)：蔗糖3％，硫酸銨0.4％，硫酸鎂0.03％，氯化鈣0.02％，七水硫酸亞鐵0.0006％，乙酸鈉0.08％，酵母膏0.07％，粘度為200mpa·s的羧甲基纖維素鈉2.0％，其余為水。

(1)斜面種子培養：將木醋桿菌菌種接種于斜面培養基上，32℃靜置培養2天；

(2)搖瓶種子液培養：刮取0.8cm×1.0cm的斜面菌苔于添加了粘度為200mpa·s、濃度為2.0％的羧甲基纖維素鈉含100mL種子培養基的500mL三角搖瓶中，32℃100rpm振蕩培養1天；

(3)發酵罐種子液擴培：將搖瓶種子液轉接于添加了粘度為200mpa·s的羧甲基纖維素鈉2.0％的10L發酵罐種子培養基中，32℃100rpm擴培1天。

采用平板稀釋涂布計算活菌量的方法計數得發酵罐中菌濃可達9.33×10¹¹cfu/ml，且罐中不產生細菌纖 維素膜團，見圖2。將菌液進行鏡檢，結果見圖4。

實施例4

斜面培養基為(質量比)：蔗糖4％，硫酸銨0.6％，硫酸鎂0.05％，氯化鈣0.04％，七水硫酸亞鐵0.0006％，乙酸鈉0.08％，酵母膏0.07％，瓊脂2％，其余為水。

搖瓶中與發酵罐中種子培養基為(質量比)：蔗糖4％，硫酸銨0.6％，硫酸鎂0.05％，氯化鈣0.04％，七水硫酸亞鐵0.0006％，乙酸鈉0.08％，酵母膏0.07％，粘度為1200mpa·s的羧甲基纖維素鈉0.05％，粘度為200mpa·s的羧甲基纖維素鈉1.0％，其余為水。

(1)斜面種子培養：將木醋桿菌菌種接種于斜面培養基上，30℃靜置培養2.5天；

(2)搖瓶種子液培養：刮取0.8cm×1.0cm的斜面菌苔于含100mL種子培養基的500mL三角搖瓶中，30℃150rpm振蕩培養1.5天；

(3)發酵罐種子液擴培：將搖瓶種子液轉接于添加了10L種子培養基的發酵罐中，30℃150rpm擴培1.5天。

采用平板稀釋涂布計算活菌量的方法計數得發酵罐中菌濃可達5.92×10¹⁰cfu/ml，且罐中不產生細菌纖維素膜團。

實施例5

斜面培養基為(質量比)：蔗糖4％，硫酸銨0.4％，硫酸鎂0.05％，氯化鈣0.03％，七水硫酸亞鐵0.0010％，乙酸鈉0.10％，酵母膏0.10％，瓊脂2％，其余為水。

搖瓶中與發酵罐中種子培養基為(質量比)：蔗糖4％，硫酸銨0.4％，硫酸鎂0.05％，氯化鈣0.03％，七水硫酸亞鐵0.0010％，乙酸鈉0.10％，酵母膏0.10％，粘度為800mpa·s的羧甲基纖維素鈉0.6％，粘度為200mpa·s的羧甲基纖維素鈉0.6％，其余為水。

(1)斜面種子培養：將木醋桿菌菌種接種于斜面培養基上，28℃靜置培養2天；

(2)搖瓶種子液培養：刮取0.8cm×1.0cm的斜面菌苔于含100mL種子培養基的500mL三角搖瓶中，28℃150rpm振蕩培養1.5天；

(3)發酵罐種子液擴培：將搖瓶種子液轉接于添加了10L種子培養基的發酵罐中，28℃150rpm擴培2天。

采用平板稀釋涂布計算活菌量的方法計數得發酵罐中菌濃可達9.80×10¹²cfu/ml，且罐中不產生細菌纖維素膜團。

實施例6

斜面培養基為(質量比)：蔗糖4％，硫酸銨0.4％，硫酸鎂0.05％，氯化鈣0.03％，七水硫酸亞鐵0.0010％，乙酸鈉0.08％，酵母膏0.08％，瓊脂2％，其余為水。

搖瓶中與發酵罐中種子培養基為(質量比)：蔗糖4％，硫酸銨0.4％，硫酸鎂0.05％，氯化鈣0.03％， 七水硫酸亞鐵0.0010％，乙酸鈉0.08％，酵母膏0.08％，粘度為200mpa·s的羧甲基纖維素鈉0.8％，粘度為800mpa·s的羧甲基纖維素鈉0.2％，粘度為1200mpa·s的羧甲基纖維素鈉0.02％，其余為水。

(1)斜面種子培養：將木醋桿菌菌種接種于斜面培養基上，30℃靜置培養2.5天；

(2)搖瓶種子液培養：刮取0.8cm×1.0cm的斜面菌苔于含100mL種子培養基的500mL三角搖瓶中，30℃150rpm振蕩培養1.5天；

(3)發酵罐種子液擴培：將搖瓶種子液轉接于添加了10L種子培養基的發酵罐中，30℃150rpm擴培1.5天。

采用平板稀釋涂布計算活菌量的方法計數得發酵罐中菌濃可達8.83×10¹¹cfu/ml，且罐中不產生細菌纖維素膜團。

對比例1

斜面培養基為(質量比)：蔗糖2％，硫酸銨0.2％，硫酸鎂0.01％，氯化鈣0.01％，七水硫酸亞鐵0.0003％，乙酸鈉0.04％，酵母膏0.03％，瓊脂2％，其余為水。

搖瓶中與發酵罐中種子培養基A為(質量比)：蔗糖2％，硫酸銨0.2％，硫酸鎂0.01％，氯化鈣0.01％，七水硫酸亞鐵0.0003％，乙酸鈉0.04％，酵母膏0.03％，其余為水。

(1)斜面種子培養：將木醋桿菌菌種接種于斜面培養基上，25℃靜置培養3天；

(2)搖瓶種子液培養：刮取1.6cm×2.0cm的斜面菌苔于100mL種子培養基A的500mL三角搖瓶中，25℃200rpm振蕩培養2天；

(3)發酵罐種子液擴培：將搖瓶種子液轉接于10L種子培養基A的發酵罐中，25℃200rpm擴培3天。

采用平板稀釋涂布計算活菌量的方法計數得發酵罐中菌濃為2.00×10⁶cfu/ml，罐中產生大量膜團，見圖1。將菌液進行鏡檢，結果見圖3。