本發明涉及一株雜交瘤細胞株及其分泌的單克隆抗體，尤其涉及一株分泌抗BTV4VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其所分泌的單克隆抗體；本發明還涉及上述雜交瘤細胞株、單克隆抗體在制備診斷或預防BTV4感染檢測中的應用，屬于藍舌病的防治領域。
背景技術：
：藍舌病(Bluetongue，BT)是由呼腸孤病毒科環狀病毒屬的藍舌病病毒(Bluetonguevirus，BTV)引起的反當動物蟲媒傳染病。藍舌病是一種急性非接觸性傳染病，其主要特征為以發熱、白細胞減少、頰粘膜和胃腸道粘膜嚴重卡他性炎癥。BTV能感染大多數家養的和野生的反當動物，因動物的易感性不同表現出不同的臨床癥狀。BTV主要感染綿羊，牛等家養及野生反當類動物，反當動物感染BTV后的死亡率5％-30％不等，易感綿羊可高達80％。由于BT對世界經濟的影響，世界動物衛生組織(OIE)將BT列為法定通報性疾病，我國將其劃定為一類動物疫病。BT所造成的相關經濟損失一方面通過直接降低動物的生產能力和增加動物的死亡率，更重要的是由于控制動物的流動、控制牛精液出口以及實施這些控制措施所需的費用而間接造成的動物貿易損失。藍舌病病毒(Bluetonguevirus，BTV)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)環狀病毒屬(Orbivirus)藍舌病病毒亞群(Bluetonguevirussubgroup)。BTV是雙鏈RNA(dsRNA)病毒，其基因組由10個線性dsRNA片段組成，BTV總基因組約有19，200bp組成，共編碼11種蛋白，包括7種結構蛋白(VP1-VP7)和4種非結構蛋白(NS1、NS2、NS3/NS3a、NS4)。BTV的內層衣殼主要由VP3蛋白組成，由L3編碼，圍繞著三個次要蛋白VP1、VP4、VP6和10個基因組片段構成病毒的亞核心；VP7蛋白構成BTV的中間衣殼，由S7編碼，該蛋白與亞核心組分以及病毒內部其他成分共同裝配成病毒的核心；VP2和VP5蛋白組成病毒的外層衣殼，分別由L2和M5編碼。而四種非結構蛋白主要出現在被感染的細胞中。BTV血清型眾多，目前已發現24個血清型，而隨著氣候變化新的血清型不斷出現。然而由于各個血清型之間交叉免疫保護性差，使得疫苗免疫錯綜復雜不能起到很好的保護作用，到目前為止尚未有有效的可用于防治藍舌病的疫苗。早期準確診斷，早期預防，是防止本病爆發的最有效方法。所以，必須加強我國BT的相關工作的研究，做好必要的技術儲備。技術實現要素：本發明目的之一是提供一株分泌抗藍舌病病毒血清4型(Bluetonguevirus4，BTV4)VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株；本發明目的之二是提供一種由上述雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體，該單克隆抗體可與BTV4-VP2蛋白發生特異性反應；本發明目的之三是提供上述單克隆抗體在制備已檢測BTV4型中的用途。本發明上述目的是通過以下技術方案來實現的：本發明以pET-28a為載體構建表達的VP2-4B蛋白作為免疫原免疫小鼠，取免疫后的小鼠脾淋巴細胞與SP2/0細胞融合。此外，本發明還以pMAL-c5x為載體構建表達的VP2-4B蛋白作為包被抗原，經間接ELISA方法篩選得到一株穩定分泌抗BTV4-VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為雜交瘤細胞株1B6，分類命名是雜交瘤細胞株1B6；保藏在中國典型培養物保藏中心，地址在武漢大學，其微生物保藏號為：CCTCCNo.C2016107，保藏時間為2016年7月1日。本發明還提供了一種由上述雜交瘤細胞株所分泌的單克隆抗體，命名為BTV4-VP2-1B6，經鑒定該單克隆抗體BTV4-VP2-1B6為IgG1亞型，輕鏈為Kappa鏈。Westernblot檢測結果表明BTV4-VP2-1B6可與BTV4-VP2蛋白發生特異性反應，而與SP2/0細胞不發生反應。進一步的，本發明還提出了所述雜交瘤細胞株以及由其分泌的單克隆康體在制備檢測BTV4病毒試劑中的用途。綜上所述，本發明制備并鑒定出了一種特異性針對BTV4-VP2蛋白的單克隆抗體，本發明的單克隆抗體為建立BTV4型特異性免疫學檢測方法研究奠定了基礎。附圖說明圖1為pET-28a-4A、pET-28a-4B和pET-28a-4C的鑒定結果；1.Trans2KPlusⅡDNAMarker；2.pET-28a-4A質粒；3.pET-28a-4A經BamHⅠ單酶切；4.pET-28a-4A經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切；5.pET-28a-4B質粒；6.pET-28a-4B經BamHⅠ單酶切；7.pET-28a-4B經BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切；8.pET-28a-4C質粒；9.pET-28a-4C經BamHⅠ單酶切；10.pET-28a-4C經BamHⅠ和XhoI雙酶切；圖2為pMAL-c5x-4A、pMAL-c5x-4B和pMAL-c5x-4C的鑒定結果；1.Trans2KPlusⅡDNAMarker；2.pMAL-c5x-4A質粒；3.pMAL-c5x-4A經SalⅠ單酶切；4.pMAL-c5x-4A經SalⅠ和NotⅠ雙酶切；5.pMAL-c5x-4B質粒；6.pMAL-c5x-4B經SalⅠ單酶切；7.pMAL-c5x-4B經SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切；8.pMAL-c5x-4C質粒；9.pMAL-c5x-4C經SalⅠ單酶切；10.pMAL-c5x-4C經SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切；圖3為重組His-4B蛋白的SDS-PAGE分析結果；1.pET-28a-4B/BL21誘導前；2.pET-28a-4B/BL21誘導后；3.蛋白質分子量標準；圖4為重組MBP-4B蛋白的SDS-PAGE分析結果；1.蛋白質分子量標準；2.pMAL-c5x-4B/BL21誘導前；3.pMAL-c5x-4B/BL21誘導后；圖5為His-4B純化蛋白與His標簽單抗的Westernblot分析結果；1.His-4B純化蛋白；2蛋白質分子量標準；圖6為本發明的單克隆抗體1B6與BTV4-VP2-A、BTV4-VP2-B以及BTV4-VP2-C的Westernblot分析結果。1.BTV4-VP2-A；2.BTV4-VP2-B；3：BTV4-VP2-C；4.蛋白質分子量標準。具體實施方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。本發明實施例中涉及的主要實驗材料和來源：1、主要試劑和藥品各種限制性內切酶、T4連接酶、反轉錄酶、Taq酶、DNAmarker均為寶生物工程(大連)有限公司產品；質粒小量抽提試劑盒購AXYGE公司；膠回收小量試劑盒購自中科瑞泰有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司；鄰苯二胺(OPD)購自SIGMA公司；胎牛血清均購自GIBCO公司；特級胎牛血清購自天津灝陽公司；1640基礎培養基、二甲基亞砜(DMSO)、胰蛋白酶、PEG3350、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、HAT(50×)培養基、HT(l00×)培養基、二氨基聯苯胺(DAB)、鄰苯二胺(OPD)、抗體亞類鑒定試劑盒購自SIGMA公司。2、實驗動物4-6周齡BALB/C小鼠由遼寧長生生物技術有限公司提供。實施例14BTV-VP2-A、4BTV-VP2-B以及4BTV-VP2-C蛋白的原核表達及純化1、引物設計根據Genbank中已登錄的4型BTV的L2基因序列(登錄號為132566356)。利用蛋白分析軟件等對L2基因進行分析及預測，將4型的L2基因分為A、B、C3個節段：4A：1-1203bp；4B：976-1980bp；4C：1861-2871bp；設計PCR擴增引物，4A(P3-P6)、4B(P7-P10)、4C(P11-P14)的PCR擴增引物序列如下表1、表2所示，表1為針對pET-28a-c(+)載體的引物序列，表2為針對pMAL-c5x載體的引物序列：表1針對pET-28a-c(+)載體的引物序列表2針對pMAL-c5x載體的引物序列2、基因擴增以合成的BTV4L2基因為模板，利用特異性上、下游引物對P7-P8對4B節段進行PCR擴增。反應體系如下：混勻后PCR儀進行擴增，擴增條件為：預變性94℃5min后進入循環，循環參數為94℃1min，53℃40s，72℃1min，30個循環后，72℃延伸10min，4℃保存。將獲得的PCR產物經0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果。其他節段均按照上述體系及PCR擴增條件進行擴增，分別擴增的到用于pET-28a-c(+)載體以及pMAL-c5x載體構建的4A、4B、4C3個節段。3、4BTV-VP2蛋白原核表達重組載體的構建將PCR產物與l0×LoadingBuffer混勻，經1.0％瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈照射下切取含有目的片段的凝膠，將其置于已稱重的EP管中，計算出凝膠的重量，按照小量DNA膠回收試劑盒方法操作：每l00mg核酸膠中加入300μLBufferS1，置于56℃水浴鍋中溶解，過程中每隔2-3min震蕩顛倒混勻一次，當其完全融化時，按照150μL異丙醇/l00mg凝膠體積加入異丙醇并混勻，將所得液體加入吸附柱中，12000rpm離心1min，棄去濾液。加入700μL漂洗液于吸附柱中，12000rpm離心1min，棄去濾液。再加入600μL漂洗液重復洗滌一次，12000rpm離心1min棄去濾液。重復上述規程，空離心2min。在吸附膜中央加入40μL預熱的去離子水，靜止吸附2min，12000rpm離心2min，收集洗脫液于新的離心管中。將純化后的PCR產物與pMD18-Tsimple載體連接，并將其轉入TG1中。將純化后的目的基因4A、4B、4C分別與載體pET-28a-c(+)、pMAL-c5x進行連接。連接反應總體系為10μL：SolutionⅠ5μL，pMD18-Tsimple載體0.3μL，純化回收的PCR產物4.7μL。混勻后放入連接儀中，16℃連接4h。4、轉化與挑菌將連接后產物轉化到大腸桿菌感受態細胞TG1中：從-80℃冰箱中取出感受態細胞，置于冰上融化3min，將連接后產物10μL加入到TG1100μL中，混勻，冰上靜置20min。42℃熱擊100s，冰浴5min。向其中加入LB液體恢復培養基700μL，37℃搖床振蕩培養40min。取出200μL培養后菌液均勻涂布于含有Amp+的LB平板上，待菌液全部被培養基吸收后放入37℃培養箱內，倒置培養12h。5、重組表達質粒的酶切鑒定與測序用質粒小提試劑盒提取重組質粒。取1mL培養后的菌液于EP管中，12000rpm離心1min，將上清棄去，加入250μLBufferP1并充分震蕩混勻使菌體沉淀懸浮充分；再加入250μLBufferP2，溫和的上下顛倒混勻6-8次；加入350μLBufferP3，溫和的上下顛倒混勻5-6次，12000rpm離心10min；將所得上清液加入到吸附柱中，12000rpm離心1min，棄去濾液。加入700μL漂洗液于吸附柱中，12000rpm離心1min，棄去濾液。再加入500μL漂洗液重復洗滌一次，12000rpm離心1min，棄去濾液，空離心2min。將吸附柱放入一個新的EP管中，在吸附膜中央加入60μL預熱的去離子水，靜止吸附2min，12000rpm離心1min，收集質粒DNA洗脫液于新的離心管中。提取的質粒進行單雙酶切鑒定，37℃水浴作用30min。單雙酶切后產物經0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果如圖1及圖2所示。將酶切鑒定正確的陽性克隆質粒送往蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序，比對目的基因序列完全正確。將構建得到的重組表達質粒分別命名為pET-28a(+)-VP2-4A、pET-28a(+)-VP2-4B、pET-28a(+)-VP2-4C、pMAL-c5x-VP2-4A、pMAL-c5x-VP2-4B以及pMAL-c5x-VP2-4C。6、BTV4-VP2基因的原核表達與純化按照4所述轉化方法將陽性重組質粒pET-28a(+)-VP2-4A、pET-28a(+)-VP2-4B、pET-28a(+)-VP2-4C、pMAL-c5x-VP2-4A、pMAL-c5x-VP2-4B以及pMAL-c5x-VP2-4C分別轉化到原核表達用BL21感受態細胞，然后取出100μL菌液涂布于含有氨節青霉素(100μg/mL)的LB平板上，37℃培養過夜，挑取LB平板培養基上的白色孤立菌落，接種于5mL含有氨節青霉素(100μg/mL)的LB液體培養基中37℃培養過夜。表達誘導具體操作如下：取1mL重組菌菌液加入到100mL的LB培養基中37℃震蕩培養至OD600nm約為0.5-1時，加IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃誘導4-5h。將表達產物進行SDS-PAGE電泳，通過切膠方法進行純化。表達載體pET-28a與目的基因4B構建的重組菌經SDS-PAGE鑒定，誘導后的重組菌分別在46kD處出現特異性條帶，與預期大小相符，且其表達形式為包涵體表達，結果如圖3所示，His-4B純化蛋白與His標簽單抗的Westernblot分析結果如圖5所示；表達載體pMAL-c5x與目的基因4B構建的重組菌經SDS-PAGE鑒定，誘導后的重組菌分別在80kD處出現特異性條帶，與預期大小相符，且主要為可溶性表達，結果如圖4所示。重組菌pMAL-c5x-VP2-4B/BL21大量誘導后，利用GST標簽蛋白的親和層析柱進行純化。純化后的蛋白使用微量分光光度計測定蛋白濃度，分裝后-80℃低溫凍存。將重組菌pET-28a(+)-VP2-4B/BL21進行大量誘導，提取包涵體。通過切膠、電洗脫的方式對蛋白進行純化。純化后的蛋白，用微量分光光度計檢測蛋白的濃度，分裝后與-80℃低溫凍存。VP2-4A以及VP2-4C蛋白按照與VP2-4B蛋白相同的處理方法進行鑒定和純化。實施例2單克隆抗體的制備1、小鼠免疫小鼠免疫以切膠純化的pET-28a(+)-VP2-4B/BL21原核表達的重組BTV4-VP2-4B蛋白免疫4只4-6周齡雌性BALB/C小鼠，共免疫3次，每次免疫間隔兩周，免疫劑量為50μg/只，第一次用等量弗氏完全佐劑與蛋白乳化，第二次、第三次取等量弗氏不完全佐劑進行乳化，免疫途徑為腹腔免疫。融合前加強免疫。2、細胞融合融合前1天準備飼養層細胞，按照常規方法取BALB/C小鼠腹腔巨噬細胞鋪于96孔細胞培養板中待用。眼球采血，分離血清保存，處死待取脾的小鼠，無菌取脾并分離脾細胞，按脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞8：1的比例用PEG進行細胞融合，融合后的細胞鋪于準備好的飼養細胞之上。3、陽性雜交瘤細胞株的篩選及克隆利用純化后的pMAL-c5x-VP2-4B/BL21原核表達的帶有MBP標簽的BTV4-VP2-4B蛋白建立間接ELISA檢測方法篩選陽性雜交瘤細胞株，對反應陽性的雜交瘤細胞擴大培養，同時用有限稀釋法進行陽性雜交瘤細胞的亞克隆，至少亞克隆3次，將亞克隆好的陽性雜交瘤細胞及時凍存。最終獲得一株可以穩定分泌抗BTV4-VP2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株，并將其分泌的單克隆抗體命名為雜交瘤細胞株1B6，其特征在于，所述的雜交瘤細胞株保藏在中國典型培養物保藏中心，地址在武漢大學，其微生物保藏號為：CCTCCNo.C2016107。實施例3單克隆抗體的鑒定1、單克隆抗體的亞類鑒定經抗體亞類鑒定試劑盒鑒定，抗BTV4VP2蛋白的單克隆抗體中，1B6的亞類為IgG1。2、Westernblot試驗通過Westernblot試驗對單克隆抗體的反應特異性進行鑒定。將pMAL-c5x-VP2-4B/BL21表達的重組4VP2-B蛋白轉印至NC膜上，以陽性雜交瘤細胞株1B6培養上清液作為一抗，HRP標記的山羊抗鼠IgG作為二抗，ECL顯色。試驗結果證實，本發明所制備的單克隆抗體1B6能夠與BTV4-VP2-B蛋白發生特異性反應，而與BTV4-VP2-A、BTV4-VP2-C不發生反應(如圖6)。3、夾心ELISA法檢測單克隆抗體1B6與BTV病毒的反應兔抗BTV血清包被的ELISA板，每孔100μL，37℃孵育2h。PBST洗三次，每次5min。每孔中加50μLBTV-4型病毒，37℃1h。洗板3次。1：5稀釋1B6上清，每孔50μL。37℃1h；洗板3次。1：8000稀釋羊抗鼠二抗(HRP)，每孔50μL。37℃1小時；洗板3次。TMB顯色15分鐘，加終止液，讀值，結果如表3所示。表3夾心ELISA法檢測單克隆抗體1B6與BTV病毒的反應1(BTV-4型病毒)2(BTV-8型病毒)1B60.59120.2564陽性對照1.71631.6333陰性對照0.12940.179試驗結果證實，與BTV-4型病毒有一定的反應，并與BTV-8型病毒不發生反應。當前第1頁1 2 3