本發明涉及一種高度純化并可立即使用的體外放大培養造血干/前驅細胞的制備方法及其組成物。本發明尤其涉及一種將利用梯度離心純化所得的單核球細胞先經過隔夜培養后，再進行造血干/前驅細胞純化及體外放大培養的方法。經由本發明方法制得的高純化造血干/前驅細胞，不僅含有高比例臨床上的有效造血干/前驅細胞(CD34+CD38-細胞)，且于其純化及制造過程中并未使用含動物來源成分的試劑，因此所得的造血干/前驅細胞培養物可直接施用于臨床應用。

背景技術：

造血干細胞(Hematopoietic stem cells；HSCs)系所有成熟血球的前身，具有自我更新與分化成不同造血細胞系的能力(Blood,Vol.89,No.12,1997:pp4337-4347)。迄今，造血干細胞移植(Hematopoietic stem cells transplantation；HSCT)已為廣泛應用于血液疾病與先天性遺傳疾病等治療。一般而言，于臨床上較合適的造血干細胞來源包含：骨髓(Bone marrow)、外圍血(Peripheral blood)以及臍帶血(Umbilical cord blood)。早期的骨髓干細胞抽取方式常伴隨極度疼痛不適的步驟，逐漸以外圍血作為造血干細胞移植的來源，但因配對不易，故近年來常以臍帶血作為造血干細胞移植的來源選擇。

CD34是一種表現于人類造血干細胞的表面抗原，通常被作為造血干細胞的指標，臨床上已有研究證明：移植細胞表面表現CD34陽性細胞(CD34+細胞)數量的多寡與移植后存活率和成功率成正比(Moore KA,et al.B1ood.1997；89:4337-4347)。隨著研究進一步發現，于細胞表面表現CD34而未帶有CD38抗原的細胞(CD34+CD38-細胞)才是真正有效用的造血干細胞。

雖說臍帶血造血干細胞移植在臨床應用上已有良好成效，但在臨床上,造血干細胞的數量有核細胞(Total nuclear cells；TNC)至少需達到2x10⁷cells/kg,或者是CD34+細胞需達到2x10⁵cells/kg以上才具有較好的移植成效。而所遇 到的課題為：臍帶血所能取得的造血干細胞數量極有限，因此，已有許多致力于造血干細胞體外擴增放大的技術研究。

舉例而言，美國專利申請號US11/255,191公開了一種提供造血干細胞體外擴增及其分析方法，利用加入各種有效含量的細胞激素培養造血干細胞，并提供一用于鑒定分離造血干細胞的試劑盒；日本專利申請號JP2012050357為造血干細胞的制造方法，則利用添加一擴增試劑至培養基中以放大造血干細胞數；以及，中國專利申請號CN2012100087227提供一種以血管內皮細胞靶向的Notch配體的可溶性融合蛋白人D111-RGD(hD111-RGD)體外擴增造血干細胞的方法。另，除了于培養階段促進造血干細胞增生以增其數量外，中國臺灣專利申請號第098115726號，公開了用于分離、體外擴增及收獲造血干細胞的方法與系統，系可快速分離出造血干細胞并進行體外擴增以提高造血干細胞獲取效率。

目前已知的體外擴增造血干細胞的方法，主要于培養基中添加各種不同物質，如細胞激素、化合物及重組蛋白等來促使造血干細胞增生。然而，大部分造血干細胞的培養時間需長達7天甚至于2周以上，并無法在短期間內獲取臨床上有效的造血干細胞(CD34+CD38-細胞)族群。由于造血干細胞的來源極其珍貴且脆弱，因此如何于有效提升造血干細胞的回收率與產率，以及如何將獲取不易的造血干細胞作有效保存，成為體外擴增造血干細胞的核心關鍵。

技術實現要素：

本發明的發明目的一方面在于提供一種體外培養造血干/前驅細胞的方法。

為達到上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種體外培養造血干/前驅細胞的方法，包括：

將含有造血干/前驅細胞的來源血液解凍，以梯度離心進行單核球純化，獲取高純度單核球細胞；

將前述高純度單核球細胞進行隔夜培養，之后分離造血干/前驅細胞；

將自前述經隔夜培養的單核球細胞分離所得的高純度造血干/前驅細胞培養于含有細胞激素、TAT-HOXB4蛋白質及5％人類血清(Human AB serum；HABS)的伊思柯夫改良培養液(Iscove's modified Dulbecco's medium；IMDM)中培養 4-7天；及

收取造血干/前驅細胞培養物。其中該造血干/前驅細胞的來血液為源血液為外圍血(Peripheral blood)或臍帶血(Umbilical cord blood)。

于本發明的一項具體實施例，系將高純度造血干/前驅細胞以細胞密度/1x104-5x105cells/mL培養于含有細胞激素、TAT-HOXB4蛋白質及5％人類血清的伊思柯夫改良培養液中培養4-7天，之后收取造血干/前驅細胞培養物。于本發明的另一項具體實施例，所述的細胞激素包含間白素-3(IL-3)、間白素-6(IL-6)、干細胞因子(SCF)、FMS樣酪氨酸激酶3配體(FLT-3L)及血小板生成素(TPO)。

另一方面，本發明體外培養造血干/前驅細胞的方法進一步包含：將所得的體外培養造血干/前驅細胞以含有24-80％的人體血清白蛋白25％注射液及20％的二甲基亞砜和右旋糖酐細胞凍存混合液(內含6-20％人類白蛋白)的保存劑進行冷凍保存。

本發明以傳統密度梯度離心純化單核球細胞后，透過隔夜培養使單核球細胞活性恢復，進而于隔日純化造血干/前驅細胞，藉以大幅提高造血干/前驅細胞的回收率。

又另一方面，本發明的發明目的在于提供一種根據本發明的制備法所制得的組成物。

為達到上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種造血干/前驅細胞組成物，包括臨床上有效造血干/前驅細胞(CD34+CD38-細胞)的百分比例為15-40％；

于本發明的一具體較佳實施例，其百分比例為25-30％。且所述臨床上有效造血干/前驅細胞(CD34+CD38-細胞)的比例與未經體外培養的造血干/前驅細胞族群比較可提高3-5倍。于本發明的另一較佳具體實施例，所制得的組成物中臨床上有效造血干/前驅系胞(CD34+CD38-細胞)的百分比可高達27％，且相較于未經體外培養的造血干/前驅細胞族群，可提高3.8倍。

附圖說明

圖1為利用流式細胞儀分析以不同純化步驟的造血干/前驅細胞的回收率圖。

圖2(A)為有核細胞總數(Total nuclear cell,TNC)擴增倍率；

圖2(B)為CD34+細胞數量擴增倍率圖。

圖3為利用流式細胞儀分析以不同成分的細胞培養液及不同細胞密度條件培養下所增生的造血干/前驅細胞族群比例的比較圖。

圖4(A)為有核細胞總數(Total nuclear cell,TNC)擴增倍率圖；

圖4(B)為CD34+細胞數量擴增倍率圖。

圖5(A)為細胞存活率分析圖；

圖5(B)為利用流式細胞儀分析造血干/前驅細胞族群比例圖。

具體實施方式

本發明的其他特色及優點將于下列實施例中為進一步舉例說明，但該實施例僅為輔助，并非用于限制本發明的范圍。

實施例一、造血干/前驅細胞的純化及回收

本發明的一方面特征點在于，透過純化及隔夜培養單核球細胞，藉以提高造血干/前驅細胞的回收率。因此于本實施例所進行的實驗分為兩個處理組，一組為將含有造血干/前驅細胞的來源血液解凍，其來源血液可為臍帶血或外圍血；先離心移除二甲基亞砜(DMSO)后加入細胞密度梯度分離液以梯度密度離心純化出單核球細胞，并于當日純化分離造血干/前驅細胞。純化分離造血干/前驅細胞方式如下：將前述的純化單核球細胞收集離心后回溶于300微升的磷酸鹽緩沖液(PBS)或含0.5％人類白蛋白的生理食鹽水中，而后加入100微升的FcR封閉液及100微升的CD34磁珠混合均勻后，置于4℃以翻轉狀態作用30分鐘；作用完畢后再加入5微升的4℃磷酸鹽緩沖液或含0.5％人類白蛋白的生理食鹽水稀釋，以4-12℃離心轉速300g離心10分鐘沉淀。再以3微升的磷酸鹽緩沖液(PBS)或含0.5％人類白蛋白的生理食鹽水回溶細胞，并加入架于磁座的管柱中，再以5微升的磷酸鹽緩沖液(PBS)或含0.5％人類白蛋白的生理食鹽水清洗管柱三次；最后將其移開磁座，加入5微升的磷酸鹽緩沖液或含0.5％人類白蛋 白的生理食鹽水并使用活塞將管柱中被CD34磁珠免疫沉淀的細胞壓出，即純化分離出造血干/前驅細胞。

另一組則將如前述的以梯度密度離心方法純化出單核球細胞，加入或未加入紅血球裂解液進行紅血球裂解，而獲取單核球細胞；并且，以細胞密度5x10⁵-6x10⁶cells/mL回溶于含5％人類血清的伊思柯夫改良培養液當中，并置于培養皿，于37℃5％CO₂培養箱中培養16至18小時之后，再進行純化分離造血干/前驅細胞。

將上述的處理組分別利用流式細胞儀進行分析，可得單核球細胞群落及經過純化分離的造血干/前驅細胞群落的分析結果。以上結果如圖1所示，可觀察到上述處理組間的單核球細胞純化率并無差別，而在將來源血液解凍的當日即直接純化分離造血干/前驅細胞的處理組，其造血干/前驅細胞純度為13.5％；相較于自經過隔夜培養的單核球細胞處理組，其造血干/前驅細胞的比例則皆高達76.2％以上，且依本發明的較佳具體實施例，造血干/前驅細胞的比例已可達92％。以上實驗可證明，透過本發明隔夜培養單核球細胞的方法，可使單核球細胞因細胞解凍變化的損傷獲得恢復活性，而提升了造血干/前驅細胞的回收純度。

實施例二、造血干/前驅細胞的體外擴增培養

除了改良純化方法以提高細胞純化回收率外，特殊的細胞培養液成分亦或是細胞培養的密度皆為影響造血干/前驅細胞的體外擴增培養重要因素，故本發明亦針對以上影響因素進行實驗。將如前述的實施例所純化的高純度造血干/前驅細胞分別培養于含有不同細胞激素成分的含5％人類血清的伊思柯夫改良培養液中培養4天，并進行細胞增生倍率分析比較。實驗中將處理組依其所包含的細胞培養液成分區分為以下3組，

(1)處理組別1：含有5ng/mL間白素-3、10ng/mL間白素-6、50ng/mL干細胞因子、20ng/mL FMS樣酪氨酸激酶3配體、15nM TAT-HOXB4；

(2)處理組別2：含有5ng/mL IL-3、10ng/mL IL-6、100ng/mL干細胞因子、20ng/mL FMS樣酪氨酸激酶3配體、15nM TAT-HOXB4；

(3)處理組別3：含有5ng/mL IL-3、10ng/mL IL-6、100ng/mL干細胞因 子、20ng/mL FMS樣酪氨酸激酶3配體、25ng/mL血小板生成素、15nM TAT-HOXB4。

細胞培養分析結果如圖2所示。由圖2(A)的有核細胞總數(Total nuclear cell,TNC)擴增倍率結果及圖2(B)的CD34+細胞數量擴增倍率結果顯示，不論是細胞樣本1或樣本2，在各處理組培養下皆可具有倍數的成長，其中，又以處理組別3的培養液所培養的擴增率增加最為明顯。由上述結果可知，細胞激素的組成及比例含量對于造血干/前驅細胞的擴增影響極大。

除研究培養液成分對于造血干/前驅細胞擴增的影響以外，細胞培養密度亦是對于細胞放大的影響之一。為此，以含有5ng/mL IL-3、10ng/mL IL-6、100ng/mL干細胞因子、20ng/mL FMS樣酪氨酸激酶3配體、25ng/mL血小板生成素、0.1％牛血清白蛋白(BSA)的培養液或以上述的處理組別3的培養液，將先前實施例所述的高純度造血干/前驅細胞分別以細胞密度5x10⁴、1x10⁵及5x10⁵cells/mL培養4天，之后以流式細胞儀進行細胞群落分析，結果如下表1及圖3所示。

表1.

由表1及圖3的結果顯示，在不同成分及不同細胞密度的培養條件下，雖然皆會使細胞增生，但其細胞族群的增生比例卻不盡相同。首先，以不同細胞 培養液的部份進行比較，可得到與前一實施例實驗相符的結果，不論是何種細胞密度進行培養，以前述的處理組別3細胞培養液成分的培養液培養4天所得的有效造血干/前驅細胞(包含CD34+細胞及CD34+CD38-細胞)比例明顯比牛血清白蛋白(BSA)培養液組別高。

再者，以不同細胞密度進行比較，可觀察到以細胞密度5x10⁴cells/mL培養4天后，有效造血干/前驅細胞族群的比例可高達72.5-77.2％。綜合以上比較，原先有效造血干/前驅細胞族群(CD34+CD38-細胞)僅7％，經由處理組別3的培養液以及特定細胞密度5x10⁴cells/mL培養后，可擴增至高達27.2％，以及，有核細胞總數(Total nuclear cell,TNC)擴增倍率亦高達13.52倍。

再進一步地，以細胞密度5x10⁴cells/mL為基準并下調測試造血干/前驅細胞的最佳培養條件，分為以下4組細胞密度進行培養，并進行細胞數量分析，細胞密度分別為：

(1)細胞密度組別1：以密度1x10⁴cells/mL培養至第7天；

(2)細胞密度組別2：以密度5x10⁴cells/mL培養3天，并于第3天時改以密度1.5x10⁴cells/mL培養至第7天；

(3)細胞密度組別3：以密度5x10⁴cells/mL培養3天，并于第3天時改以密度3x10⁴cells/mL培養至第7天；

(4)細胞密度組別4：以密度5x10⁴cells/mL培養至第7天。

其分析結果如圖4所示，可明顯觀察到，相較于其他組別，在以細胞密度組別1的細胞密度連續培養至第7天的培養條件下，不論是圖4(A)所示的有核細胞總數(Total nuclear cell,TNC)擴增倍率或是圖4(B)所示的CD34+細胞擴增倍率皆明顯擴增，分別高達141.5倍及18.5倍。由本實施例可知細胞密度對于造血干/前驅細胞的體外擴增培養系一重要因子。

實施例三、體外擴增培養的造血干/前驅細胞的冷凍保存

根據以上實施例已可有效擴增體外培養造血干/前驅細胞，然而除此以外，如何對于該細胞進行有效冷凍儲存以及確保其在解凍仍可維持其有效造血干/前驅細胞族群的存活比例為一大重點，因此，本實施例以3種保存劑配方作為 試驗，其配方分別為：

(1)配方1(內含20％人類白蛋白):80％的人體血清白蛋白注射液(內含25％人體血清白蛋白),20％的二甲基亞砜和右旋糖酐細胞凍存混合液；

(2)配方2(內含12％人類白蛋白):48％的人體血清白蛋白注射液(內含25％人體血清白蛋白),20％的二甲基亞砜和右旋糖酐細胞凍存混合液,生理食鹽水；

(3)配方3(內含6％人類白蛋白):24％的人體血清白蛋白注射液(內含25％人體血清白蛋白),20％的二甲基亞砜和右旋糖酐細胞凍存混合液,生理食鹽水。

將前述培養4天所得的造血干/前驅細胞分別使用以上3種冷凍保存劑做冷凍保存，并儲存于液氮儲存系統當中進行為期1個月的冷凍儲存，再經解凍測試以比較不同保存劑對細胞族群的影響，其結果如圖5所示：由圖5(A)的存活率分析(7-AAD染色)可得知，3種不同配方的保存劑所保存的造血干/前驅細胞，在經由解凍后其存活率并沒有明顯不同；而進一步以流式細胞儀分析出有效造血干/前驅細胞族群(CD34+細胞及CD34+CD38-細胞)的結果如圖5(B)所示，則觀察到以配方3的保存劑所冷凍解凍的有效造血干/前驅細胞族群比例相較于其他配方為良好。由此證明，以體外擴增培養的有效造血干/前驅細胞亦可被以適當的保存劑進行冷凍保存，并于解凍后保持高比例的細胞族群純度及良好細胞存活率。

綜合以上實施方式的結果，證實本發明的制備方法可有效獲取高純度的造血干/前驅細胞，并可于短期內(4-7天)即獲得高比例臨床上的有效造血干/前驅細胞的數量，最后，以特殊配方的保存劑進行細胞冷凍保存以維持有效造血干/前驅細胞族群的比例及細胞存活率。

另外本發明的制備法在各個過程中，不論是細胞純化、體外擴增或者是冷凍保存，皆未使用含有其他動物來源成分的試劑，即代表，由本發明的制備方法所制得的組成物，不需再經過其他加工處理即可直接作為臨床的應用。

以上所述，僅為本發明的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。