本發明涉及基因檢測領域，尤其涉及一種DNMT3A基因檢測的方法。
背景技術：
惡性血液病包括急慢性白血病、惡性淋巴瘤、骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)、多發性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)和骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative neoplasms,MPN)等，發病率成逐年上升趨勢，嚴重危害人類的健康。
尤其是白血病，在我國各年齡組惡性腫瘤的死亡率中分別占第6位(男性)和第8位(女性)，在兒童及35歲以下成人中居第一位研究顯示，惡性血液病的發生、發展、演變及預后均與基因的異常變化相關。
隨著人類基因組計劃(human genome project，HGP)的實施和完成，一門重要的新生學利——基因組學應運而生。它主要研究生物體內全部基因的分子特征，而腫瘤基因組學是其研究的重要內容。2005年12月13日，美國宣布啟動“腫瘤基因組計劃”，研究人員初步發現，每一個腫瘤都有自己獨特的基因組藍圖。每個腫瘤的發生都是多種基因變化的積累和多個腫瘤相關基因協同作用的結果，一個基因的改變只是完成其中的一個步驟，往往還需要經過不同腫瘤相關基因的激活與失活的多階段演變。而“腫瘤基因組計劃”的目的是破譯癌癥密碼，建立一個共享數據庫，造福于人類健康。
最近研究發現，惡性血液病的患者DNMT3A基因發生了突變，為此，我們研究了一種DNMT3A基因檢測的方法。
技術實現要素：
本發明提供一種DNMT3A基因檢測的方法，包括的步驟有：基因組DNA的提取、DNA產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測、PCR反應擴增DNMT3A基因、PCR產物測序、結果判定。
(一)基因組DNA的提取
1.試劑準備：
1)在蛋白酶K粉中加入3.3ml純凈去離子水，震蕩溶解，室溫下，靜置30分鐘以上，待徹底溶解后分裝，于4℃保存備用；
2)將160ml無水乙醇加入洗滌液中混勻備用；
3)檢查細胞裂解液，如果里面有沉淀可37℃溫育，使其徹底溶解，冷至室溫后備用；
2.抽取患者外周血約2ml，EDTA抗凝，按以下步驟提取基因組DNA：
1)取1.5ml離心管，并加250μl細胞裂解液到離心管中；
2)加200μl抗凝全血到細胞裂解液中，用移液器來回吸注幾次，以徹底溶解殘留在吸頭上的血液，且充分混合以確保完全釋放基因組DNA；
3)每管加30μl蛋白酶K，旋滿振蕩混勻15S，室溫下5000rpm瞬時離心，再56℃孵育約3分鐘，根據血細胞裂解情況可適當延長至5分鐘，裂解完全應為褐色；
4)在上述裂解完全的混合液中加入250ul無水乙醇，上下顛倒幾次后放在旋禍振蕩器上震蕩15秒，室溫下5000rpm瞬時離心；
5)將過濾離心柱置于1.5ml收集管(試劑盒內提供)中，再將步驟4)中所得混合液轉入過濾離心柱中，室溫下8000rpm離心1分鐘；
6)丟棄含廢液的收集管，將過濾離心柱置于一個新的1.5ml收集管中，并
在離心柱中加入750ul洗滌液，室溫下8000rpm離心1分鐘；
7)重復上一步；
8)將洗脫液置恒溫金屬浴上預熱到65℃以提高洗脫效率；
9)丟棄含廢液的1.5ml收集管，將過濾離心柱置于另一潔凈的1.5ml離心管中，在離心柱中央加入200ul預熱的洗脫液，室溫靜置2-3分鐘；8000rpm離心1分鐘洗脫基因組DNA；
10)將離心管蓋好，-20℃保存備用；
(二)DNA產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測
1.膠液的制備：
稱取0.5g瓊脂糖于錐形瓶中，加入100rnL0.5xTAE電泳緩沖液，在微波爐中加熱至煮沸使瓊脂糖顆粒完全溶解至溶液透明，此時瓊脂糖凝膠濃度為0.5％；
2.膠板的制備：
1)用膠帶將洗凈、干燥的制膠板兩端封好，水平放置在工作臺上，調整好梳子的高度；調節梳子與底板間的距離約1mm，和擋板平行安放；
2)向冷卻至45-50攝氏度的瓊脂糖凝膠液中放入漠化乙錠(ethidhimbromide,EB)，輕輕搖勾使其終濃度為0.5ng/mL；然后用溶化的凝膠將膠帶內側封嚴；
3)將瓊脂糖凝膠小心倒入制膠板中，使膠液緩慢展幵，直到整個制膠板表面形成均勻膠層，一般厚度5mm左右，注意不要有氣泡；
4)室溫靜置約一小時，待膠充分凝固后拔出梳子備用，注意不要損傷梳子底部的凝膠；
5)將制膠板連同膠一起放入電泳槽，加IxTAE電泳緩沖液至浸沒膠約1mm左右；
3.點樣：
將電泳樣品與溴酚藍按6:1比例混合均勻后，用微量移液器將樣品依次點入加樣孔中；注意要及時更換Tip頭，避免損壞凝膠或將凝膠底部刺穿；
4.電泳：
點樣完成后，蓋上電泳槽蓋，接通電源，采用3V/cm的電壓；當溴酚藍指示劑電泳條帶在凝膠的中下段時，停止電泳；
5.觀察結果：
用紫外凝膠成像儀觀察電泳膠板，并記錄結果，在23000bp處出現較亮條帶的即為提取成功，可繼續進行下一步PCR反應擴增產物片段大小為845bp，擴增完成后，取2ul產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測；
6.PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳：
按照以上DNA產物瓊脂糖檢測的方法制備膠液，此時瓊脂糖凝膠溶液濃度應為1％、制備膠板、點樣和電泳；在紫外燈下觀察結果顯示：樣本在約845bp處出現較亮的DNA擴增條帶，用紫外凝膠成像儀拍照并保存結果；
(三)PCR反應擴增DNMT3A基因
1、目的基因的選擇及引物合成：
針對DNMT3A基因突變熱點，第882位精氨酸殘基密碼子(R882)位點設計合成引物，上游引物：AGGAGTTGGTGGGTGTGAGT；下游引物：TGCTCCTATCTGATCAGGCT；加TE緩沖液稀釋至50pmol/ul，-20℃保存；進行PCR反應前需要將TE緩沖液進一步稀釋至10pmol/ul；
2.PCR反應體系和反應條件：
反應體系總體積為20μl，包括如下：
反應條件如下，循環35次：
3.PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳：
擴增產物片段大小為845bp，擴增完成后，取2ul產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測；按照以上DNA產物瓊脂糖檢測的方法制備膠液，此時瓊脂糖凝膠溶液濃度應為1％，制備膠板、點樣和電泳；在紫外燈下觀察結果顯示：幾乎所有樣本均在約845bp處出現較亮的DNA擴增條帶，用紫外凝膠成像儀拍照并保存結果；
(四)PCR產物測序
PCR擴增完成后，將產物-20℃凍存備用，用DNA凝膠回收試劑盒進行產物純化，用ABI3730測序儀和BigDyeTerminators試劑盒進行DNA測序，以Sanger雙脫氧鏈終止法進行；
(五)結果判定
將DNA測序結果用Chrosmas軟件進行分析，并與DNA數據庫進行同源比較，其基因序列號為：NG_029465.1，判斷各患者中有無DNMT3A基因突變，如果發現，則初步判定為患有惡性血液病。
進一步，所述的紫外燈為臺式三用紫外分析儀。
進一步，所述的離心是采用低速自動平衡離心機或高速離心機進行。
本發明的有益效果是：本發明所述的一種DNMT3A基因檢測的方法，使用方便，檢測準確率高，用此方法檢查惡心血液病，可以減輕患者檢測中所受的痛苦。
具體實施方式
以下將結合本發明的實施例進行詳細敘述。
一種DNMT3A基因檢測的方法，包括如下步驟：
(一)基因組DNA的提取
1.試劑準備：
1)在蛋白酶K粉中加入3.3ml純凈去離子水，震蕩溶解，室溫下，靜置30分鐘以上，待徹底溶解后分裝，于4℃保存備用；
2)將160ml無水乙醇加入洗滌液中混勻備用；
3)檢查細胞裂解液，如果里面有沉淀可37℃溫育，使其徹底溶解，冷至室溫后備用；
2.抽取患者外周血約2ml，EDTA抗凝，按以下步驟提取基因組DNA：
1)取1.5ml離心管，并加250μl細胞裂解液到離心管中；
2)加200μl抗凝全血到細胞裂解液中，用移液器來回吸注幾次，以徹底溶解殘留在吸頭上的血液，且充分混合以確保完全釋放基因組DNA；
3)每管加30μl蛋白酶K，旋滿振蕩混勻15S，室溫下5000rpm瞬時離心，再56℃孵育約3分鐘，根據血細胞裂解情況可適當延長至5分鐘，裂解完全應為褐色；
4)在上述裂解完全的混合液中加入250ul無水乙醇，上下顛倒幾次后放在旋禍振蕩器上震蕩15秒，室溫下5000rpm瞬時離心；
5)將過濾離心柱置于1.5ml收集管(試劑盒內提供)中，再將步驟4)中所得混合液轉入過濾離心柱中，室溫下8000rpm離心1分鐘；
6)丟棄含廢液的收集管，將過濾離心柱置于一個新的1.5ml收集管中，并
在離心柱中加入750ul洗滌液，室溫下8000rpm離心1分鐘；
7)重復上一步；
8)將洗脫液置恒溫金屬浴上預熱到65℃以提高洗脫效率；
9)丟棄含廢液的1.5ml收集管，將過濾離心柱置于另一潔凈的1.5ml離心管中，在離心柱中央加入200ul預熱的洗脫液，室溫靜置2-3分鐘；8000rpm離心1分鐘洗脫基因組DNA；
10)將離心管蓋好，-20℃保存備用；
(二)DNA產物的瓊脂糖凝膠電泳檢測
1.膠液的制備：
稱取0.5g瓊脂糖于錐形瓶中，加入100rnL0.5xTAE電泳緩沖液，在微波爐中加熱至煮沸使瓊脂糖顆粒完全溶解至溶液透明，此時瓊脂糖凝膠濃度為0.5％；
2.膠板的制備：
1)用膠帶將洗凈、干燥的制膠板兩端封好，水平放置在工作臺上，調整好梳子的高度；調節梳子與底板間的距離約1mm，和擋板平行安放；
2)向冷卻至45-50攝氏度的瓊脂糖凝膠液中放入漠化乙錠(ethidhimbromide,EB)，輕輕搖勾使其終濃度為0.5ng/mL；然后用溶化的凝膠將膠帶內側封嚴；
3)將瓊脂糖凝膠小心倒入制膠板中，使膠液緩慢展幵，直到整個制膠板表面形成均勻膠層，一般厚度5mm左右，注意不要有氣泡；
4)室溫靜置約一小時，待膠充分凝固后拔出梳子備用，注意不要損傷梳子底部的凝膠；
5)將制膠板連同膠一起放入電泳槽，加IxTAE電泳緩沖液至浸沒膠約1mm左右；
3.點樣：
將電泳樣品與溴酚藍按6:1比例混合均勻后，用微量移液器將樣品依次點入加樣孔中；注意要及時更換Tip頭，避免損壞凝膠或將凝膠底部刺穿；
4.電泳：
點樣完成后，蓋上電泳槽蓋，接通電源，采用3V/cm的電壓；當溴酚藍指示劑電泳條帶在凝膠的中下段時，停止電泳；
5.觀察結果：
用紫外凝膠成像儀觀察電泳膠板，并記錄結果，在23000bp處出現較亮條帶的即為提取成功，可繼續進行下一步PCR反應擴增產物片段大小為845bp，擴增完成后，取2ul產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測；
6.PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳：
按照以上DNA產物瓊脂糖檢測的方法制備膠液，此時瓊脂糖凝膠溶液濃度應為1％、制備膠板、點樣和電泳；在紫外燈下觀察結果顯示：樣本在約845bp處出現較亮的DNA擴增條帶，用紫外凝膠成像儀拍照并保存結果；
(三)PCR反應擴增DNMT3A基因
1、目的基因的選擇及引物合成：
針對DNMT3A基因突變熱點，第882位精氨酸殘基密碼子(R882)位點設計合成引物，上游引物：AGGAGTTGGTGGGTGTGAGT；下游引物：TGCTCCTATCTGATCAGGCT；加TE緩沖液稀釋至50pmol/ul，-20℃保存；進行PCR反應前需要將TE緩沖液進一步稀釋至10pmol/ul；
2.PCR反應體系和反應條件：
反應體系總體積為20μl，包括如下：
反應條件如下，循環35次：
3.PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳：
擴增產物片段大小為845bp，擴增完成后，取2ul產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測；按照以上DNA產物瓊脂糖檢測的方法制備膠液，此時瓊脂糖凝膠溶液濃度應為1％、制備膠板、點樣和電泳；在紫外燈下觀察結果顯示：幾乎所有樣本均在約845bp處出現較亮的DNA擴增條帶，用紫外凝膠成像儀拍照并保存結果；
(四)PCR產物測序
PCR擴增完成后，將產物-20℃凍存備用，用DNA凝膠回收試劑盒進行產物純化，用ABI3730測序儀和BigDyeTerminators試劑盒進行DNA測序，以Sanger雙脫氧鏈終止法進行；
(五)結果判定
將DNA測序結果用Chrosmas軟件進行分析，并與DNA數據庫進行同源比較，其基因序列號為：NG_029465.1，判斷各患者中有無DNMT3A基因突變，如果發現，則初步判定為患有惡性血液病。
進一步，所述的紫外燈為臺式三用紫外分析儀。
進一步，所述的離心是采用低速自動平衡離心機或高速離心機進行。
以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。