本發明涉及基因工程領域，具體地，涉及一種免疫調節蛋白及其基因。

背景技術：
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從真菌中獲得的免疫調節蛋白(Fungal immunomodulatory proteins,以下簡稱為FIPs)是一類具有增強免疫力、抗過敏、抗腫瘤等多種重要的生理功能的小分子蛋白質。

通過基因工程方法從已完成基因組測序的真菌中獲得可開發利用的FIPs蛋白，既能豐富FIPs家族的種類，更能為人類健康的保健和治療提供新的免疫調節劑。

技術實現要素：
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本發明的目的是從已完成基因組測序的真菌中獲得可開發利用的FIPs蛋白。

本發明人通過生物信息學方法篩選到一種來源于真菌Stachybotrys chlorohalonata IBT 40285的蛋白FIP-sch2，為典型的免疫調節蛋白。

所述真菌免疫調節蛋白FIP-sch2，全長112個氨基酸，理論分子量為12.555kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

FIP-sch2蛋白是一種新型的真菌免疫調節蛋白。本發明人通過將其氨基酸序列在GenBank中進行BLAST比對發現：FIP-sch2蛋白與小孢靈芝、赤靈芝、紫靈芝和金針菇真菌免疫調節蛋白GMI、FIP-gja、LZ-8和FIP-fve的序列同源性僅分別為59.5％、52.3％、54.1％和53.6％。說明FIP-sch2是一種新的真菌免疫調節蛋白。

本發明還提供并合成了編碼上述真菌免疫調節蛋白FIP-sch2的基因：通過一對引物FIP-sch2-F(EcoRI)：5'-CCC GAA TTC TCA GCT CCA ACC-3'和FIP-sch2-R(XhoI)：5'-AAA AAA CTC GAG CTT CCA TTG G-3'，用基因合成的方法克隆了這一真菌免疫調節蛋白FIP-sch2的基因，DNA全序列分析結果表明，fip-sch2全長339bp，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明還提供了包含蛋白FIP-sch2基因的重組表達載體。方法是將本發明的真菌免疫調節蛋白FIP-sch2基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。優選的表述載體是pGEX-6T-1。

作為本發明的一個最優選的實施方案，所述表達載體合適的限制性酶切位點之間是pGEX-6T-1上的EcoRI和XhoI限制性酶切位點之間，得到重組大腸表達載體pGEX-fip-sch2。

將上述重組表達載體轉化宿主細胞大腸桿菌。所述宿主細胞優選為大腸桿菌Rosetta，得到重組菌株Rosetta(pGEX-fip-sch2)。

本發明還提供了包含真菌免疫調節蛋白FIP-sch2基因的重組菌株，優選為重組菌株Rosetta(pGEX-fip-sch2)。

本發明還提供了制備真菌免疫調節蛋白FIP-sch2的方法，包括以下步驟：

1)將含FIP-sch2基因的重組表達載體轉化宿主細胞，得重組菌株；

2)培養重組菌株，誘導重組真菌免疫調節蛋白FIP-sch2的表達；以及

3)回收并純化所表達的真菌免疫調節蛋白FIP-sch2。

本發明通過以下實驗證實了本發明發現的新蛋白的功能。

1、體外抗腫瘤活性

實驗結果：FIP-sch2對肺腺癌A549細胞具有毒性作用，半致死計量IC₅₀為9.48μg/mL(圖2)；8μg/ml的不同來源的真菌免疫調節蛋白比較實驗結果表明，FIP-sch2對A549的毒性作用與靈芝免疫調節蛋白LZ-8相當，顯著高于金針菇免疫調節蛋白FIP-fve。

結論：FIP-sch2對腫瘤細胞具有極強的高毒性作用(實施例3)。

2、誘導腫瘤細胞凋亡分析

實驗結果：FIPs對A549細胞具有凋亡作用，8μg/ml的FIP-sch2、LZ-8和FIP-fve處理A549細胞24h后，凋亡率分別為50.19％、38.82％、10.88％(圖3)。

結論：FIP-sch2對腫瘤細胞A549具有凋亡作用，其誘導凋亡作用與LZ-8相似，卻顯著高于FIP-fve，是極具潛力的抗腫瘤藥物(實施例4)。

3、抑制腫瘤細胞遷移檢測

實驗結果：8μg/ml的FIP-sch2促進傷口愈合情況略強于LZ-8，顯著弱于FIP-fve。

結論：FIP-sch2可以抑制腫瘤細胞A549遷移，FIP-sch2對A549的遷移抑制作用略微弱于LZ-8，卻顯著強于FIP-fve。

本發明優點和有益效果：

1、可以提供相當數量的免疫調節蛋白質FIP-sch2純品，完全能滿足臨床與醫藥應用需求。

FIP-sch2在該大腸桿菌表達系統中實現高效表達，表達量為31mg/L(實施例2)；經柱純化后，蛋白質的含量達到電泳純(圖1)。而目前通常從幾千克食用菌中只能提取毫克級蛋白。

2、FIP-sch2具有抗腫瘤活性，具有治療應用潛力。

抗腫瘤效應檢測結果表明，FIP-sch2對A549具有毒性作用(實施例3)，可以誘導A549凋亡(實施例4)，抑制A549遷移(實施例5)；其抗腫瘤效應與靈芝免疫調節蛋白LZ-8相當，但顯著高于金針菇免疫調節蛋白FIP-fve，極具應用潛力。

3、首次運用基因工程手段提供了一個新的真菌來源的免疫調節蛋白。

由于運用基因工程手段來產業化生產真菌免疫調節蛋白FIP-sch2產品還未見報道。本發明首次提供了一個新的真菌來源的免疫調節蛋白FIP-sch2。而且，根據本發明的技術方案就可以實現利用基因工程手段生產真菌免疫調節蛋白FIP-sch2。

附圖說明：

圖1～圖4是對本發明純化制備的真菌免疫調節蛋白FIP-sch2進行分析和功能實驗，其中：

圖1是superdex 75凝膠過濾和SDS-PAGE分析：其中，圖1a為superdex 75凝膠過濾分析，推測FIP-sch2活性蛋白為二聚體；圖1b為SDS-PAGE分析。

圖2是FIP-sch2蛋白抑制腫瘤細胞A549增殖結果。

圖3是FIP-sch2蛋白誘導腫瘤細胞A549凋亡結果。

圖4是FIP-sch2蛋白抑制腫瘤細胞A549遷移結果。

具體實施方式

以下實施例僅用于舉例說明本發明的方法，并不限制本發明的范圍。

試驗材料

1、細胞株：人肺腺癌細胞A549，購買于北京協和醫院細胞資源中心。

2、試劑耗材

CCK試劑盒：全式金細胞活性檢測試劑盒；

TransDetct^TM Annexin V-FITC/PI Cell Apoptosis Detection Kit：全式金細胞凋亡檢測試劑盒；

PCR引物合成和基因測序均由上海生工生物公司完成；

酶類：內切酶EcoRI和XhoI購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司；Prescission Protease由實驗室制備；

儀器：離心機、振蕩搖床、顯微鏡、酶標儀、流式細胞儀；

生化試劑：氨芐青霉素、青霉素(鈉鹽)、硫酸鏈霉素、溴酚蘭、噻唑蘭(MTT)、胎牛血清(FBS)，二甲基亞砜(DMSO)為Sigma產品。

3、培養基

高糖DMEM培養液，加入10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，0.22μm濾膜過濾滅菌后4℃保存。

說明：以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。

本實施例中的抗腫瘤效應檢測，均以靈芝免疫調節蛋白(LZ-8)和金針菇免疫調節蛋白(FIP-fve)為陽性對照。

實施例1真菌免疫調節蛋白FIP-sch2編碼基因篩選、克隆和表達載體構建

以金針菇免疫調節蛋白FIP-fve為誘餌，在NCBI真菌基因組數據庫中進行BLAST比對，在子囊真菌Stachybotrys chlorohalonata IBT 40285基因組中發現與FIP-fve同源性為53.6％的FIP-sch2編碼基因，基因全長339bp(336bp外加一個終止密碼子TAA)，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。經密碼子優化后，合成基因。

設計并合成引物FIP-sch2-F(EcoRI)：5'-CCC GAA TTC TCA GCT CCA ACC-3'和FIP-sch2-R(XhoI)：5'-AAA AAA CTC GAG CTT CCA TTG G-3'，用以上引物擴增合成基因。用EcoRI和XhoI酶切PCR擴增產物，獲得目標基因fip-sch2，將目標基因連接到經相同酶切的表達載體pGEX-6T-1，獲得含有真菌免疫調節蛋白FIP-sch2基因的重組表達載體pGEX-fip-sch2，轉化大腸桿菌Rosetta，獲得重組菌株Rosetta(pGEX-fip-sch2)。

實施例2真菌免疫調節蛋白FIP-sch2表達純化

取陽性轉化子Rosetta(pGEX-fip-sch2)菌株，接種于20mL含有50μg/ml氨芐的LB培養液中，37℃200rpm過夜活化。次日，以2％的接菌量，接種于200mL含有50μg/ml氨芐的LB培養液中，37℃200rpm培養至OD₆₀₀為0.8-1.0，加0.1mM IPTG，20℃200rpm過夜誘導16h后，離心收集菌體。0.2體積的PBS溶解菌體，超聲波破碎，離心收集上清。GST柱純化后，用100U/ml的Prescission Protease 4℃過夜酶切，去除GST標簽。過Q柱和分子篩純化FIP-sch2蛋白。

實驗結果：

經以上表達系統表達FIP-sch2蛋白的理論分子量為14.1KDa(包括部分載體序列和限制酶切位點翻譯氨基酸)；FIP-sch2在大腸桿菌中高效表達，表達量為31mg/L；經柱純化后，蛋白質的含量達到電泳純(圖1)。

結論：

FIP-sch2在該大腸桿菌表達系統中實現高效表達，因此可以快速提供相當數量的蛋白質純品，以滿足臨床與醫藥應用需求。

實施例3CCK法測定真菌免疫調節蛋白FIP-sch2體外抗腫瘤活性

實驗方法：

1)在DMEM培養液中傳代培養A549細胞，計數腫瘤細胞，稀釋到終濃度為2.5×10⁵細胞/ml。

2)在96孔培養板內每孔加入100μl腫瘤細胞懸浮液，繼續培養24h后，加入100μl重組蛋白樣品，使得終濃度為0、1、2、4、8、16、32和64μg/ml。同時加入相同方法制備的8μg/mL靈芝和金針菇免疫調節蛋白LZ-8和FIP-fve做陽性對照。每個樣品5個平行。

3)混勻后，放于5％CO₂，37℃培養箱中培養24小時。

4)24小時后，CCK法檢測細胞活性(具體操作參見說明書)。

實驗結果：

FIP-sch2對肺腺癌A549細胞具有毒性作用，半致死計量IC₅₀為9.48μg/mL(圖2)；8μg/ml的不同來源的真菌免疫調節蛋白比較實驗結果表明，FIP-sch2對A549的毒性作用與靈芝免疫調節蛋白LZ-8相當，卻顯著高于金針菇免疫調節蛋白FIP-fve。

結論：

FIP-sch2對腫瘤細胞具有極強的高毒性作用，及具應用潛力。

實施例4真菌免疫調節蛋白FIP-sch2誘導腫瘤細胞凋亡分析

實驗方法：

1)在5％CO₂，37℃培養箱中用DMEM培養液培養A549細胞，細胞計數，使其終濃度為l x10⁶細胞/ml。

2)在6孔培養板中每孔加入0.8ml腫瘤細胞懸浮液，繼續培養24h后，分別加入0.2ml終濃度為8μg/ml的重組真菌免疫調節蛋白FIP-sch2、LZ-8和FIP-fve，以正常生長的腫瘤細胞做陰性對照；在5％CO₂，37℃培養箱中培養24小時。

3)去上清，胰酶消化，3000rpm，室溫離心5分鐘，收集腫瘤細胞。凋亡檢測試劑盒檢測凋亡，具體操作參見說明書。

實驗結果：

FIPs對A549細胞具有凋亡作用，8μg/ml的FIP-sch2、LZ-8和FIP-fve處理A549細胞24h后，凋亡率分別為50.19％、38.82％、10.88％(圖3)。

結論：

FIP-sch2對腫瘤細胞A549具有凋亡作用，其誘導凋亡作用與LZ-8相似，卻顯著高于FIP-fve，是極具潛力的抗腫瘤藥物。

實施例5真菌免疫調節蛋白FIP-sch2抑制腫瘤細胞遷移檢測

實驗方法：

4)在5％CO₂，37℃培養箱中用DMEM培養液培養A549細胞，細胞計數，使其終濃度為5x10⁵細胞/ml。

5)在6孔培養板中加入上述腫瘤細胞懸浮液，在5％CO₂，37℃培養箱中培養24小時，細胞平鋪長滿，用tip頭在培養板單層細胞中間劃線，PBS洗去懸浮細胞和碎片。

6)分別加入終濃度為8μg/ml的重組真菌免疫調節蛋白FIP-sch2、LZ-8和FIP-fve，以正常生長的腫瘤細胞做陰性對照；在5％CO₂，37℃培養箱中培養24小時。顯微鏡觀察細胞生長情況，并拍照。

實驗結果：

繼續培養24h后，未處理細胞(NC)劃出傷口明顯愈合，8μg/ml的LZ-8處理后，傷口愈合現象不明顯；8μg/ml的FIP-sch2傷口愈合情況較為顯著；8μg/ml的FIP-fve處理A549細胞24h后，傷口愈合情況極為顯著，與陰性對照極為相似(圖4)。

結論：

FIP-sch2可以抑制腫瘤細胞A549遷移，FIP-sch2對腫瘤細胞A549的遷移抑制作用略微弱于LZ-8，卻顯著強于FIP-fve，是極具潛力的抗腫瘤藥物。