本發明屬于BRCA2基因突變體檢測領域，具體涉及專用型BRCA2基因多重PCR建庫試劑盒。
背景技術：
乳腺癌是世界女性最常見的惡性腫瘤之一，占女性癌癥發病總數的23％，占女性癌癥死亡人數的14％。乳腺癌轉移復發是患者重要的致死原因，轉移后中位生存時間不足2年。在我國，近年來乳腺癌的發病率呈逐年上升的趨勢。從90年代以來，中國的乳腺癌發病率增長速度是全球的兩倍多，城市地區尤為顯著。以北京和上海為例，乳腺癌已經連續20年位于女性惡性腫瘤第一位，現在年發病率已達到40/10萬以上，并且每年仍以2-3％的速度上升，有逐步接近歐美發達國家水平的趨勢。另外，與歐美發達國家女性相比，中國乳腺癌患者絕經前患者占一半以上(歐美不足30％)，并且發病年齡高峰較西方女性早5到10年。由于這個年齡段的女性是家庭和社會的中堅力量，進一步突顯了乳腺癌對我國社會和家庭帶來的巨大危害。同時，上海是中國人口最多的城市，也是乳腺癌發病率最高的城市之一，海市乳腺癌發病趨勢代表了未來20年中國城市化進程中的疾病趨勢。
乳腺癌的致病原因至今沒有完全了解。乳腺癌家族史、乳腺良性疾病史、較晚的月經初潮年齡、較高的精神壓力、較高的身體質量指數(Body Mass Index，BMI)及腫瘤家族史等被認為是罹患乳腺癌的重要誘因。乳腺癌的病因從遺傳角度而言也有了較多的突破，BRCA1，BRCA2，TP53，PTEN，STK11/LKB1，CDH1，CHEK2，ATM，MLH1，MSH2等一系列乳腺癌易感基因的突變也被證明與乳腺癌相關?，F有研究已經明確證實BRCA1和BRCA2基因的胚系突變與遺傳性乳腺癌的發生與密切相關。遺傳性乳腺癌約占所有乳腺癌5％-10％左右，其發病年齡相對年輕；30歲以下的年輕乳腺癌患者中約25-35％有乳腺癌易感基因的突變。更重要的是，攜帶BRCA1/2基因突變的婦女，其一生中患乳腺癌、卵巢癌累計危險隨年齡增長而增高，BRCA1/2突變攜帶者到80歲時發生乳腺癌的預測累積風險均超過80％；而普通人群一生患乳腺癌危險度為14％左右，亦即BRCA1/2基因的突變讓婦女罹患乳腺癌的風險升高了5倍以上。
BRCA1/2的功能研究提示其屬于抑癌基因，在DNA損傷修復、細胞周期調節、基因轉錄激活、染色質穩定等方面發揮著重要作用。在外界因素的干擾下，抑癌基因發生突變后，細胞的生長失去正常調控從而導致腫瘤的發生。BRCA1/2基因的任何有害突變都可導致較高的乳腺癌和卵巢癌終身風險，同時還會增加一系列其他腫瘤發生的風險。BRCA1/2突變基因攜帶者終身罹患乳腺癌的累積風險為80％。由此可見，對乳腺癌高危人群進行BRCA1/2基因突變檢測，對于早期發現遺傳性乳腺癌，尤其是對于惡性程度高、預后相對差的三陰性乳腺癌具有重要意義。通過了解合適患者的BRCA1/2狀態有助于評估其癌癥的終身風險，并采取可成功降低患病風險的伴隨措施，比如建議大多數攜帶者接受乳腺癌和卵巢癌預防性手術和增加乳腺定期檢查次數。
BRCA1/2基因突變檢測另一個重要的應用在于為乳腺癌患者使用新一代PARP抑制劑類抗腫瘤新藥提供療效預測。BRCA1/2基因突變顯著增加了婦女罹患乳腺癌和卵巢癌的風險，原因是這些突變會致使某些蛋白無效，無法修復造成額外致癌突變的DNA損壞。但是兩種基因的瑕疵使腫瘤細胞容易遭受PARP抑制劑的攻擊，因為PARP抑制劑能夠進一步破壞腫瘤細胞DNA的修復機制。這種組合效果使腫瘤細胞不能修復對DNA的破壞，然后腫瘤細胞就會死掉，這種觀念被稱為“合成致死”。研究發現新型PARP抑制劑——奧拉帕尼對于攜帶有BRCA1/2突變的乳腺癌和卵巢癌的腫瘤患者有效。因此，了解BRCA的突變狀態對于乳腺癌治療方面的作用也日趨重要，因為它能夠指導PARP抑制劑類藥物的應用，利用BRCA1/2基因檢測來確定哪些乳腺癌患者會受益于奧拉帕尼，進一步加速乳腺癌診治方式的革新，所以對于BRCA1/2基因突變的檢測具有廣泛及深遠臨床應用和市場開發前景。
目前，針對突變基因檢測方法主要分為兩大方向：其一是對全基因序列的檢測，其二是對已知的突變位點檢測。因為BRCA1和BRCA2是兩個功能復雜的大基因，需要進行整個基因的掃描才能確定是否存在基因突變，鑒于二代測序技術的發展，有望成為BRCA1/2基因突變的有效檢測手段。1994年，美國率先在一些人群中開展基因篩檢，經歷了10多年的發展，截至2005年底，包括乳腺癌基因突變的篩查，美國已有500多萬人接受了基因檢測。從總體上看，美國乳腺癌的發病率下降了70％；在美國，已經有超過10萬名婦女接受了乳癌易感基因BRCA1和BRCA2的檢測。而在加拿大針對乳腺癌的基因檢測已成為常規檢測手段，而全部費用由國家支付。因為經過衛生經濟學家測算發現，在早期對包括乳腺癌在內的一些癌癥性疾病進行有效監測和預防，遠比發病后以及病情晚期治療更能減少衛生財政的支出。
然而，在我國BRCA1/2基因突變篩查仍然是盲點。我國目前臨床上仍普遍采用體檢、鉬靶和B超等傳統手段來診斷、評價乳腺癌，這些方法存在明顯的局限性。首先，多數病人在診斷確立時已經跨越了腫瘤的早期階段，而對于基因突變的篩查，根據其結果通過遺傳咨詢可以判斷預估患者罹患乳腺癌的危險度，在乳腺癌發生前行預防性的治療，從而做到“治未病”。其次，乳腺癌病情發生發展復雜多變，現代醫學對癌癥的診治必須以每個患者的信息為基礎決定治療方案，從基因組的差異來對每個患者行個體化治療。安吉麗娜·朱莉和姚貝娜兩位明星，由于采取的措施不同，她們的命運各不相同。由此可以看出，開始階段對乳腺致癌基因BRCA1/2進行的基因檢測可以導致完全不同的生存預后。復旦大學附屬腫瘤醫院的全國多中心研究結果顯示，漢族遺傳性乳腺癌人群中BRCA1/2突變率為9.5％，這意味著對于中國遺傳性乳腺癌患者中，每10個人就至少有1個人攜帶BRCA1/2基因的突變。為此，2014年NCCN指南提出，發生在45歲以下的乳腺癌患者、60歲以下的三陰性乳腺癌患者，乃至有癌癥高危家族史的乳腺癌患者和健康人等，都有進行乳腺癌基因突變篩查的指證。但是，目前國內關于BRCA1/2突變的大規模篩查的方法和評估體系尚未建立，在基因分子檢測迅猛發展的今天，亟需建立穩定的檢測技術和規范的篩查流程，并客觀科學地評估基因的遺傳變異的作用,通過個體的遺傳易感檢測,來評估女性罹患乳腺癌的風險,建立乳腺癌分子預警系統；同時，BRCA1/2突變檢測系統還可為PARP抑制劑類抗腫瘤新藥在乳腺癌上的應用提供可靠的療效預測。
技術實現要素：
本發明第一方面提供一種引物產品，該產品含有SEQ ID NO:1－116所示的引物序列。
在一個或多個實施方案中，所述引物分為獨立包裝的兩組，其中，一組引物含SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90、93、94、95、96、99、100、103、104、107、108、111、112、115和116；另一組引物含SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、63、64、67、68、71、72、75、76、79、80、83、84、87、88、91、92、97、98、101、102、105、106、109、110、113和114。
本發明第二方面提供一種多核苷酸序列產品，所述產品含116種多核苷酸序列，其中，每一種多核苷酸序列含懸掛接頭序列和特異性引物序列，每一種多核苷酸序列所含的所述特異性引物序列各自獨立選自SEQ ID NO:1－116。
在一個或多個實施方案中，SEQ ID NO:1－116所示的引物中，奇數編號的引物為正向引物，偶數編號的引物為反向引物，其中，在正向引物的5’端還連接有SEQ ID NO:117所示的懸掛接頭序列，在反向引物的5’端還連接有SEQ ID NO:118所示的懸掛接頭序列。
本發明第三方面提供一種BRCA2基因多重PCR建庫或BRCA2基因突變篩查試劑盒，所述試劑盒含有本文所述的引物產品。
在一個或多個實施方案中，所述試劑盒含有兩個獨立包裝的容器，其中一個容器含有SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90、93、94、95、96、99、100、103、104、107、108、111、112、115和116的混合物，另一個容器含有SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、63、64、67、68、71、72、75、76、79、80、83、84、87、88、91、92、97、98、101、102、105、106、109、110、113和114的混合物。
在一個或多個實施方案中，所述試劑盒還含有PCR擴增所需的其它試劑，例如酶試劑。
在一個或多個實施方案中，所述SEQ ID NO:1－116所示的序列中，奇數編號的引物為正向引物，偶數編號的引物為反向引物，其中，在正向引物的5’端還連接有SEQ ID NO:117所示的序列，在反向引物的5’端還連接有SEQ ID NO:118所示的序列。
在一個或多個實施方案中，所述酶是來自Kapa Biosystems的KAPA2G Robust hotstart ready mix。
本發明第四方面提供本發明所述引物產品或多核苷酸序列產品在BRCA2基因多重PCR建庫或BRCA2基因突變篩查中的應用。
本發明第五方面提供本發明所述引物產品或多核苷酸序列產品在制備BRCA2基因多重PCR建庫或BRCA2基因突變篩查試劑盒中的應用。
本發明第六方面提供一種BRCA2基因多重PCR建庫或BRCA2基因突變篩查方法，所述方法包括以下步驟：
(1)使用本發明的多核苷酸序列產品擴增樣品中的基因組DNA；
(2)給步驟(1)獲得的擴增產物添加標記的測序接頭；和
(3)將步驟(2)所得產物測序。
具體實施方式
本發明涉及BRCA2基因突變的篩查。具體而言，本發明涉及使用SEQ ID NO:1－116所示的特異性引物序列篩查BRCA2基因中的突變。
通常，將所示116條序列分成兩組，分別與樣品混合后進行PCR。分組的原則是組內的引物擴增區域沒有交叉重疊即可。在某些實施方案中，將所述70條引物分成以下兩組：SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90、93、94、95、96、99、100、103、104、107、108、111、112、115和116；和SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、63、64、67、68、71、72、75、76、79、80、83、84、87、88、91、92、97、98、101、102、105、106、109、110、113和114。
本文中，奇數編號的序列為正向引物序列，偶數編號的序列為反向引物序列。通常，可根據后續的添加測序接頭所使用的標記的接頭引物序列(Index Adapter Primer)中的引物序列，在每一條正向引物和每一條反向引物的5’端各添加一條懸掛接頭序列(overhang adapter sequence)?！皯覓旖宇^序列”為本領域周知，通常與標記的接頭引物序列中的引物互補，用以經由PCR而將測序接頭序列和樣品特異性的標記連接到先前使用該特異性引物或者獲得的產物上。例如，作為示范性的例子，本發明根據Illumina官方公布的信息，分別在每一條正向引物的5’端連上SEQ ID NO:117所示的序列，在每一條反向引物的5’端連上SEQ ID NO:118所示的序列。
因此，在某些實施方案中，本發明提供一種多核苷酸序列產品。該多核苷酸序列產品含有116種多核苷酸序列，其中每一種多核苷酸序列含有懸掛接頭序列和本發明SEQ ID NO:1－116中的任意一條特異性引物，或由懸掛接頭序列和本發明SEQ ID NO:1－116中的任意一條特異性引物組成。如前所述，該多核苷酸序列產品中的116種多核苷酸序列可分成兩組。分組的原則是組內的引物擴增區域沒有交叉重疊即可。例如，在某些實施方案中，基于以下序列將所述116條多核苷酸序列分成兩組：SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90、93、94、95、96、99、100、103、104、107、108、111、112、115和116；和SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、63、64、67、68、71、72、75、76、79、80、83、84、87、88、91、92、97、98、101、102、105、106、109、110、113和114。
本發明的引物產品或多核苷酸序列產品可以是例如組合物的形式。組合物中還可含有合適的溶劑，例如水。組合物還可以是凍干的形式。本發明的引物產品或多核苷酸序列產品可提供于試劑盒中，用于BRCA2基因多重PCR建庫或BRCA2基因突變篩查。在某些實施方案中，本發明的試劑盒可含有兩個獨立包裝的容器，其中一個容器含有SEQ ID NO:1、2、5、6、9、10、13、14、17、18、21、22、25、26、29、30、33、34、37、38、41、42、45、46、49、50、53、54、57、58、61、62、65、66、69、70、73、74、77、78、81、82、85、86、89、90、93、94、95、96、99、100、103、104、107、108、111、112、115和116的混合物，或前文所述的相應的含懸掛接頭序列的多核苷酸序列的混合物；另一個容器含有SEQ ID NO:3、4、7、8、11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、35、36、39、40、43、44、47、48、51、52、55、56、59、60、63、64、67、68、71、72、75、76、79、80、83、84、87、88、91、92、97、98、101、102、105、106、109、110、113和114的混合物，或前文所述的相應的含懸掛接頭序列的多核苷酸序列的混合物。試劑盒還可含有PCR擴增所需的其它試劑，例如酶試劑；以及任選的指導技術人員使用該試劑盒進行PCR及測序的說明書。例如，在某些實施方案中，試劑盒中的酶可以是來自Kapa Biosystems的KAPA2G Robust hotstart ready mix。
因此，本發明也提供SEQ ID NO:1－116所示的引物，或前文所述的相應的含懸掛接頭序列的多核苷酸序列在BRCA2基因多重PCR建庫或BRCA2基因突變篩查中的應用，或在制備BRCA2基因多重PCR建庫或BRCA2基因突變篩查試劑盒中的應用。
本發明還提供一種BRCA2基因多重PCR建庫或BRCA2基因突變篩查方法，所述方法包括以下步驟：
(1)使用本發明的多核苷酸序列產品擴增樣品中的基因組DNA；
(2)給步驟(1)獲得的擴增產物添加標記的測序接頭；和
(3)將步驟(2)所得產物測序。
本文所使用的標記的測序接頭可以是本領域常規的標記的測序接頭。該標記的測序接頭的結構為本領域周知，例如通常包括測序接頭和樣品特異的標記。通常，在擴增產物的兩端分別添加標記的測序接頭。因此，在添加測序接頭后所得的產物中，其5’端和3’端分別是相應的測序接頭序列。上述方法中，步驟(1)到(3)可采用本領域周知的技術手段實施，除了使用本發明的引物或多核苷酸序列進行步驟(1)的擴增。
采用本發明的引物、試劑盒和方法，可利用多重PCR技術實現基因全部外顯子區域的捕獲。相對于探針捕獲方法，極大簡化了實驗流程，縮短了實驗時間，減少了實驗的試劑和人工成本。另外，接頭序列的添加，可實現多個樣本的平行上樣。
本發明中，術語“含有”或“包括”表示各種成分可一起應用于本發明的混合物或組合物中。因此，術語“主要由...組成”和“由...組成”包含在術語“含有”或“包括”中。
如無具體說明，本發明的各種原料均可以通過市售得到；或根據本領域的常規方法制備得到。除非另有定義或說明，本文中所使用的所有專業與科學用語與本領域技術熟練人員所熟悉的意義相同。此外任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明方法中。
本發明的其他方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照國家標準測定。若沒有相應的國家標準，則按照通用的國際標準、常規條件、或按照制造廠商所建議的條件進行。
實施例1：引物設計及制備
引物由Ion Ampl iSeqTM Designer軟件設計。然后在各正向引物的5’端添加序列TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO:117)；在各反向引物的5’端添加序列GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQ ID NO:118)。
引物由上海茂槿生物技術有限公司合成。合成后引物分裝成2組，分別為組1和組2，各組引物及其描述如下表1和2所示：
表1
表2
實施例2：基因組定量
來自血液、組織和唾液等樣本DNA均可用于擴增。本實施例使用來自手術切除的乳腺腫瘤組織DNA，共12份樣品，分別命名為BC1A01到BC1A12。每份樣品25mg組織，采用Blood&Tissue試劑盒(Qiagen)處理，抽提DNA，Nanodrop質控。參考Qubit說明書，對樣本基因組DNA進行準確定量，將DNA的濃度控制在20-50ng/μl的范圍內。定量后DNA濃度若高于50ng/μl，則利用TE緩沖液稀釋至50ng/μl。
實施例3：PCR擴增
采用以下PCR反應體系及PCR程序對實施例2獲得的每份基因組DNA樣品進行擴增，其中，每份基因組DNA樣品平行進行兩個PCR，一個PCR采用實施例1組1引物，另一個PCR采用實施例組2引物：
(1)PCR反應體系，25μl，其中：
酶為KAPA2G Robust hotstart ready mix(Kapa Biosystems)。
(2)PCR程序如下：
采用上述PCR方法擴增得到兩組PCR產物。
實施例4：PCR產物純化
采用以下步驟純化實施例3獲得的兩組PCR產物：
1.將實施例3獲得的PCR反應液(25ul)中加入9μl磁珠(AMPure XP Beads)，移液器吹打10-15次，轉移至純化板，室溫靜置5min；
2.純化板置于磁力架，5min至溶液澄清；
3.取上清至新的純化版，加入17.5μl磁珠，吹打10-15次，室溫靜置5min；
4.純化板置于磁力架，5min至溶液澄清，去除上清；
5.加入100μl 70％乙醇洗滌；
6.純化板置于磁力架，2min至溶液澄清，去除上清；
7.室溫放置，至乙醇揮發干凈；
8.加入20μl洗脫緩沖液，充分懸浮磁珠，室溫靜置2min以洗脫DNA。置磁力架，靜置5min，取上清于新的96孔板。
實施例5：添加被標記的測序接頭
依照Nextera Index Kit說明，添加被標記的測序接頭。具體的PCR反應如下：
1、PCR為20μl反應體系，其中
酶為KAPA2G Robust hotstart ready mix(Kapa Biosystems)。
2、PCR程序：
實施例6：純化
第一步純化：
1.將實施例5的PCR反應液(20ul)中加入14μl磁珠(AMPure XP Beads)，吹打10-15次，轉移至純化板，室溫靜置5min；
2.純化板置于磁力架，5min至溶液澄清，去除上清；
3.加入100μl 70％乙醇洗滌；
4.純化板置于磁力架，2min至溶液澄清，去除上清；
5.室溫放置，至乙醇揮發干凈；
6.加入20μl洗脫緩沖液，充分懸浮磁珠，室溫靜置2min以洗脫DNA。置磁力架，靜置5min，取上清于新的純化板；
第二步純化：
1.第一步純化產物中加入14μl磁珠(AMPure XP Beads)，吹打10-15次，室溫靜置5min；
2.純化板置于磁力架，5min至溶液澄清，去除上清；
3.加入100μl 70％乙醇洗滌；
4.純化板置于磁力架，2min至溶液澄清，去除上清；
5.室溫放置，至乙醇揮發干凈；
6.加入20μl洗脫緩沖液，充分懸浮磁珠，室溫靜置2min以洗脫DNA。置磁力架，靜置5min，取上清于新的96孔板。
實施例7：
參考Qubit說明書，對實施例6的純化產物進行準確定量。定量后的PCR文庫等摩爾混合后稀釋至2nM。文庫采用NaOH變性，標化至8-12pM，在Miseq測序試劑盒v3中上樣600μl，機器運行。
獲得fastq格式的原始測序數據后，使用常規方法進行二代測序的數據分析。簡單地說，首先是BWA軟件將序列與參考基因組進行比對，確定序列在基因組位置，然后利用Samtools等軟件將序列排列，最后GATK尋找樣本測序數據與參考基因組差異，獲得多態及突變位點，并將這些位點進行功能注釋。
結果如下表3、4、5和6所示。
表3：覆蓋倍數
表4：覆蓋倍數
表5：突變結果(插入缺失型)
Freq：2個等位基因的測序深度；DP：總測序深度；數據庫無rs號，則以“.”表示。
僅在BC1A04樣品中檢測到一處缺失突變，在樣品BC1A01到BC1A03以及BC1A05到BC1A12中未檢測到插入或缺失突變。
表6：突變結果(單堿基多態及突變)
Freq：2個等位基因的測序深度；DP：總測序深度。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。