本發(fā)明屬于細胞模型構造技術領域，具體涉及高尿酸血癥細胞模型的構建方法及其在降尿酸功效評價方面的應用。

背景技術：

高尿酸血癥是由于嘌呤代謝紊亂和/或尿酸排泄減少所引起的代謝性疾病，以血尿酸升高為主要特征，是痛風、腎結石等病癥的重要生化基礎。近年來，高尿酸血癥和痛風的患病率越來越高，并且高尿酸血癥作為諸多代謝紊亂因素之一，常與高血壓、糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)展密切相關，是威脅人類的重要疾病。

目前治療高尿酸血癥的藥物根據(jù)作用機制不同可分為：抑制尿酸生成的藥物；促進尿酸排泄的藥物；促進尿酸分解的藥物。常見的有別嘌呤醇、非布索坦、丙磺舒、苯溴馬隆等。但這些藥物大多副作用明顯，對肝功能、腎功能及心肌功能造成一定的損傷，患者易出現(xiàn)不良反應。因此，尋找到副作用小、安全經(jīng)濟的降尿酸藥物十分必要和迫切，而確立一種高效篩選藥物的高尿酸血癥模型顯得尤為重要。

目前，降尿酸藥物的篩選可通過建立高尿酸血癥動物模型進行體內(nèi)篩選，或直接在體外篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑。黃嘌呤氧化酶可以催化次黃嘌呤和黃嘌呤氧化生成尿酸，因此抑制黃嘌呤氧化酶的活性可達到降尿酸的效果。測定黃嘌呤氧化酶活性較為常用的方法是紫外分光光度法，黛立珍和趙慶婭分別在研究中草藥、叉枝藻和海帶提取物對黃嘌呤氧化酶的抑制中就采用了該方法測酶活。在黃嘌呤氧化酶的催化下，底物黃嘌呤被氧化成尿酸，在此反應中，尿酸的生成量和黃嘌呤氧化酶的活力成正比，因此可通過測定體系中尿酸的生成量來反應酶活的大小。尿酸在290 nm處有特征吸收峰，可采用分光光度法測定單位時間內(nèi)尿酸量的變化，從而計算出酶活。（戴立珍，武漢工程大學碩士學位論文，2010）（趙慶婭，中國海洋大學碩士學位論文，2013）。李忠琴等采用辣根過氧化物酶分光光度法測定黃嘌呤氧化酶活性，其原理為：黃嘌呤氧化酶在催化黃嘌呤氧化的反應過程中，每氧化1 mol黃嘌呤，將消耗1 mol分子氧和水，產(chǎn)生1 mol尿酸和1mol H₂O₂。H₂O₂再經(jīng)過氧化物酶作用分解，可使4-氨基安替比林(AAP)與苯酚(PA)形成呈紅色的亞醌類化合物(chromogen)，在可見光范圍內(nèi)測定該顯色化合物的吸光度，即可推算出黃嘌呤氧化酶的酶活（分析化學研究簡報, 2006, 6：821-824）。李忠琴等也報道了采用平板擴散法測定黃嘌呤氧化酶的活性，主要步驟是在三角瓶中加入Tris-HCl緩沖溶液、瓊脂粉和黃嘌呤溶液作為底物，加熱溶解后與顯色液混合，混勻制成瓊脂平板。打孔，用燒燙的接種針熨潤孔壁，在酒精燈上烘烤平皿背面，使瓊脂與平皿底部貼緊。將制備的酶液樣品定量滴加至瓊脂平板的孔中，置于37 oC恒溫培養(yǎng)箱中反應，每隔10 min觀察孔周圍顯色圈的大小和顏色深淺變化情況。研究發(fā)現(xiàn)通過該方法測得的顯色圈的直徑與辣根過氧化物酶分光光度法測得的酶活力之間有良好的線性關系，因此可通過測量顯色圈的直徑估算樣品的酶活力（吉林大學學報，2011,49（3）：544-547）。此外，也有采用反相高效液相色譜法測定黃嘌呤氧化酶的活性。其方法是將酶初提液與含有黃嘌呤的反應體系在37oC下反應20 min，反應終止后通過HPLC 測定產(chǎn)物尿酸生成量的變化來分析酶的活性。檢測波長為290 nm（分析化學研究簡報, 2007, 26(8): 41-44）。

高尿酸血癥動物模型的造模方法主要有三種，一是直接攝入尿酸、高嘌呤食物或尿酸前體物質(zhì)，促進尿酸的生成，形成高尿酸血癥模型。陶兆燕等研究吳茱萸堿對高尿酸血癥動物模型的影響中將大鼠灌胃次黃嘌呤，再皮下注射氧嗪酸鉀鹽可致尿酸增高模型（成都中醫(yī)藥大學學報，2014,37（1）：32-34）。二是通過給藥抑制尿酸排泄，增加血尿酸濃度，形成高尿酸血癥，常用的藥物為腺嘌呤、煙酸等。王宗濤等在高尿酸血癥大鼠模型的實驗研究中以含腺嘌呤的飼料誘導大鼠，獲得持續(xù)性高尿酸血癥（中華內(nèi)分泌代謝雜志，2004,20（5）：474-475）。三是抑制尿酸酶的活性，常用的尿酸酶抑制劑為氧氰酸。牛艷芬等在研究芒果苷對氧嗪酸鉀所致慢性高尿酸血癥大鼠尿酸及肝腎功能的影響中以2.5 g/kg體重的氧嗪酸鉀灌胃大鼠，可獲得慢性高尿酸血癥模型（中國藥理學通報，2012，28（11）：1578-1581）。目前大多數(shù)高尿酸血癥模型多以兩種或三種造模物質(zhì)同時作用，獲得穩(wěn)定持久的高尿酸血癥模型。

選用人腎小管上皮細胞為造模細胞，以腺苷為造模藥物，構建高尿酸血癥細胞模型，用于評價藥物的降尿酸效果，操作簡單，耗時短，可用于藥物的大批量篩選。

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技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的是針對高尿酸血癥動物模型篩選藥物實驗繁瑣，周期長等問題，提出構建一種高尿酸血癥細胞模型的方法，用以代替動物模型進行藥物的高效篩選。

本發(fā)明所提供的一種高尿酸血癥細胞模型的構建方法，具體包括如下步驟：

（1）選取人腎小管上皮細胞（HK-2細胞）為造模細胞，用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；

（2）將處于對數(shù)生長期的人腎小管上皮細胞消化，制成細胞懸液，血球計數(shù)板計數(shù)后，調(diào)整細胞密度，接種于孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

（3）培養(yǎng)12-36 h后，棄去細胞上清液，清洗，加入腺苷進行孵育；

（4）腺苷孵育12-36 h后，加入黃嘌呤氧化酶，繼續(xù)孵育12-36 h后，獲得高尿酸血癥細胞模型；取出細胞上清液，高效液相分析細胞上清液中的尿酸含量。

進一步地，步驟（2）中所述消化是指在棄去培養(yǎng)液后的培養(yǎng)基中，加入胰蛋白酶，降解細胞間蛋白后棄去胰蛋白酶；所述制成細胞懸液是指用吸管吹打制成細胞懸液。

進一步地，步驟（2）中所述調(diào)整細胞密度為10⁵-10⁶個/mL。

進一步地，步驟（3）中所述清洗是指用聚丁二酸丁二醇酯清洗2-3次。

進一步地，步驟（3）中所述腺苷為誘導物質(zhì)，腺苷用量為0.25-1 mmol/L，優(yōu)選為0.75 mmol/L。

進一步地，步驟（4）中加入黃嘌呤氧化酶為每孔加入0.1-0.3 IU黃嘌呤氧化酶，優(yōu)選為每孔加入0.2 IU黃嘌呤氧化酶。

由上述任一項所述制備方法制得的高尿酸血癥細胞模型。

制得的高尿酸血癥細胞模型在降尿酸功效評價方面的應用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和技術效果：

本發(fā)明首次建立了高尿酸血癥細胞模型，該模型可用于高效篩選降尿酸的藥物，相對于動物模型周期短，操作簡單。

附圖說明

圖1為六種標準品高效液相色譜圖；

圖2 為尿酸標準曲線；

圖3為實施例1中空白對照組和模型組細胞上清液高效液相圖；

圖4為不同實施例組尿酸含量圖；

圖5a為實施例5中高尿酸血癥細胞模型組的高效液相圖；

圖5b為實施例5中陽性對照組中別嘌呤醇組的高效液相圖；

圖5c為實施例5中陽性對照組中丙磺舒組的高效液相圖；

圖5d為實施例5中陽性對照組中非布索坦組的高效液相圖；

圖6為實施例5中高尿酸血癥細胞模型組和陽性對照組尿酸含量圖。

具體實施方式

實驗細胞：人腎小管上皮細胞HK-2，購自無錫菩禾生物醫(yī)藥技術有限公司。

實驗試劑：培養(yǎng)基RMPI1640、鏈霉素和青霉素、胰酶購自美國Gibco公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司；腺苷購自廣州碩恒生物科技有限公司；別嘌呤醇購自國藥集團化學試劑有限公司；丙磺舒購自上海源葉生物科技有限公司；非布索坦購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司；黃嘌呤氧化酶購自美國Sigma公司。

造模細胞的培養(yǎng)：人腎小管上皮細胞HK-2用RPMI1640進行培養(yǎng)，并加入10 wt%的胎牛血清，1 wt %雙抗（鏈霉素和青霉素），放入37 °C、5%（V/V）CO₂培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

圖1為六種標準品高效液相圖，由圖可知尿酸出峰時間為4.8 min左右；圖2為尿酸標準曲線，可根據(jù)標準曲線方程對細胞上清液中生成的尿酸定量。

實施例1

一種高尿酸血癥細胞模型的構建：實驗設空白對照組和模型組。

模型組：取對數(shù)生長期的HK-2細胞，加入胰酶消化，用吸管吹打制成懸液，通過稀釋將細胞濃度調(diào)整為10⁵個/mL，接種于12孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，棄去細胞上清液，PBS清洗2次，加入用量為0.25 mmol/L的腺苷孵育12 h后，每孔加入0.1 IU黃嘌呤氧化酶，繼續(xù)孵育12 h后，得到高尿酸血癥細胞模型；

空白對照組：不加腺苷誘導物，其余條件和模型組一樣。

取出細胞上清液，HPLC分析細胞上清液，高效液相色譜圖和尿酸含量圖分別如圖3和圖4所示。由圖3可知空白對照組基本無尿酸生成，模型組生成尿酸。

實施例2

一種高尿酸血癥細胞模型的構建：

取對數(shù)生長期的HK-2細胞，加入胰酶消化，用吸管吹打制成懸液，通過稀釋將細胞濃度調(diào)整為3×10⁵個/mL，接種于12孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，棄去細胞上清液，PBS清洗2次，加入用量為0.5 mmol/L的腺苷孵育12 h后，每孔加入0.1 IU黃嘌呤氧化酶，繼續(xù)孵育12 h后，得到高尿酸血癥細胞模型；取出細胞上清液，HPLC分析細胞上清液中尿酸含量，結果如圖4所示。

實施例3

一種高尿酸血癥細胞模型的構建：

取對數(shù)生長期的HK-2細胞，加入胰酶消化，用吸管吹打制成懸液，通過稀釋將細胞濃度調(diào)整為3×10⁵個/mL，接種于12孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去細胞上清液，PBS清洗3次，加入用量為0.5 mmol/L的腺苷孵育24 h后，每孔加入0.2 IU黃嘌呤氧化酶，繼續(xù)孵育24 h后，得到高尿酸血癥細胞模型；取出細胞上清液，HPLC分析細胞上清液尿酸含量，結果如圖4所示。

實施例4

一種高尿酸血癥細胞模型的構建：

取對數(shù)生長期的HK-2細胞，加入胰酶消化，用吸管吹打制成懸液，通過稀釋將細胞濃度調(diào)整為10⁶個/mL，接種于12孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去細胞上清液，PBS清洗3次，加入用量為0.75 mmol/L的腺苷孵育36 h后，每孔加入0.2 IU黃嘌呤氧化酶，繼續(xù)孵育36 h后，得到高尿酸血癥細胞模型；取出細胞上清液，HPLC分析細胞上清液尿酸含量，結果如圖4所示。

實施例5

一種高尿酸血癥細胞模型的構建：

取對數(shù)生長期的HK-2細胞，加入胰酶消化，用吸管吹打制成懸液，通過稀釋將細胞濃度調(diào)整為10⁶個/mL，接種于12孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，棄去細胞上清液，PBS清洗3次，加入用量為1 mmol/L的腺苷孵育36 h后，每孔加入0.3 IU黃嘌呤氧化酶，繼續(xù)孵育36 h后，得到高尿酸血癥細胞模型；取出細胞上清液，HPLC分析細胞上清液尿酸含量，結果如圖4所示。

從圖4可知，模型組均有尿酸生成。由實施例1和實施例2可知，隨著誘導物腺苷濃度和細胞密度的增加，尿酸生成含量顯著增加。細胞密度增加，產(chǎn)生的腺苷代謝相關的酶增加，因而一段時間內(nèi)生成的尿酸含量增加。由實施例2和實施例3可知，隨著細胞鋪板時間，誘導物孵育時間及加入黃嘌呤氧化酶后孵育時間的延長，尿酸生成量顯著增加。由實施例4和實施例5可知，當細胞密度較大，誘導物腺苷達到一定濃度后，繼續(xù)增加腺苷的濃度，尿酸生成量雖然增多，但無顯著性差異。

實施例6

實驗設為空白對照組，模型組，陽性對照組。

模型組：取對數(shù)生長期的HK-2細胞，加入胰酶消化，用吸管吹打制成懸液，通過稀釋將細胞濃度調(diào)整為10⁶個/mL，接種于12孔板中，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后；棄去上清液，PBS清洗3次，加入用量為0.75 mmol/L的腺苷孵育36 h后，每孔加入0.2 IU黃嘌呤氧化酶，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，得到高尿酸血癥細胞模型；

陽性對照組：置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，陽性對照組分別加入20 μmol/L別嘌呤醇、20 μmol/L丙磺舒和20 μmol/L非布索坦，其余條件與模型組一樣；

空白對照組：不加腺苷誘導物，其余條件和模型組一樣。

取出細胞上清液，高效液相分析，結果如圖5a、圖5b、圖5c和圖5d所示，尿酸含量如圖6所示；空白對照組尿酸含量結果參照圖3，基本不產(chǎn)生尿酸。

結果表明，陽性藥物組尿酸含量均顯著低于模型組，且在相同濃度下非布索坦降尿酸效果最好。由結果可知高尿酸血癥細胞模型造模成功，具有降尿酸功效評價的效果，可應用于篩選降尿酸藥物。