本發(fā)明屬于魚類細(xì)胞研究技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在魚類生殖系細(xì)胞中特異性表達(dá)基因的3'UTR區(qū)序列及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

牙鲆，俗稱牙片，為鲆鰈魚類，屬于鰈形目、牙鲆科、牙鲆屬，是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖魚類，該物種具有性別二態(tài)性。為了獲得更多的雌性個(gè)體，近年來(lái)針對(duì)牙鲆等鲆鰈魚類的養(yǎng)殖進(jìn)行了性別控制育種、雌核發(fā)育和多倍體育種等多種育種方法的嘗試，但是對(duì)魚類生殖腺的發(fā)生和發(fā)育研究仍然面臨諸多困難。為此，對(duì)魚類原始生殖細(xì)胞(PGCs)進(jìn)行特異性的識(shí)別和分離培養(yǎng)，并通過(guò)冷凍保存技術(shù)對(duì)優(yōu)良種質(zhì)魚類的PGCs進(jìn)行保存，不僅可以為魚類生殖調(diào)控進(jìn)行深入研究，也可為魚類優(yōu)良種質(zhì)的保存提供新的技術(shù)手段和方法。然而，有關(guān)于鲆鰈魚類PGCs特異性的識(shí)別和標(biāo)記的相關(guān)研究尚未見(jiàn)到報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種在魚類生殖系細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的3′UTR區(qū)序列，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。

本發(fā)明首先提供一種3′UTR區(qū)序列，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1；

上述的3′UTR區(qū)序列用于調(diào)控基因在牙鲆原始生殖細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)；

作為實(shí)施例的優(yōu)選，所述基因?yàn)闃?biāo)記基因，例如綠色或紅色等熒光蛋白基因；

本發(fā)明再一個(gè)方面提供一種重組報(bào)告載體質(zhì)粒，其中插入有上述的3′UTR區(qū)序列；

本發(fā)明另一個(gè)方面提供一種研究原始生殖細(xì)胞發(fā)生和發(fā)育的方法，是在原始生殖細(xì)胞中轉(zhuǎn)入上述的報(bào)告載體質(zhì)粒體外合成的mRNA。

本發(fā)明的3′UTR區(qū)序列為牙鲆魚特有的序列，可以用于鲆鰈魚、斑馬魚等魚類生殖系細(xì)胞的示蹤以及在魚類生殖系細(xì)胞中外源基因特異表達(dá)的定位；本發(fā)明為牙鲆等魚類原始生殖細(xì)胞的識(shí)別、標(biāo)記、跟蹤、分離奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為開(kāi)展魚類的性別分化機(jī)制以及生殖系細(xì)胞發(fā)生發(fā)育研究提供了技術(shù)方法。

附圖說(shuō)明

圖1：3′UTR區(qū)序列的核苷酸序列圖；

圖2：3'UTR RACE第一輪電泳圖；

圖3：3'UTR RACE第二輪電泳圖；

圖4：胚胎早期對(duì)PGCs的跟蹤結(jié)果圖；

圖5：體節(jié)期跟蹤結(jié)果圖；

圖6：出膜前跟蹤結(jié)果圖；

圖7：出膜后跟蹤結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

原始生殖細(xì)胞(PGCs)是生殖細(xì)胞的祖細(xì)胞，在生殖腺形成之前便在胚胎的特定位置特化形成，之后遷移到原始生殖腺即性原基前的生殖細(xì)胞，在性腺分化過(guò)程中分化為卵原細(xì)胞和精原細(xì)胞，并進(jìn)一步發(fā)育成卵母細(xì)胞和精母細(xì)胞，隨后經(jīng)過(guò)發(fā)育最終產(chǎn)生成熟的配子--卵子和精子。

UTR(Untranslated Regions)即非翻譯區(qū)，是信使RNA(mRNA)分子兩端的非編碼片段。3'UTR區(qū)是從編碼區(qū)末端的終止密碼子延伸至多聚A尾巴(Poly-A)的末端。3'UTR區(qū)是miRNA作用時(shí)結(jié)合的主要位置，引起該基因mRNA的降解，與DNA轉(zhuǎn)錄不大相關(guān)，主要影響的是mRNA翻譯。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1：3′UTR區(qū)序列的篩選

1、RNA提取

牙鲆精巢或卵巢的總RNA采用Trizol(Invitrogen)法提取，具體步驟如下：取約0.1g牙鲆性腺，加入1mL Trizol，電動(dòng)勻漿，室溫放置5min，使其充分裂解后12,000rpm離心5min。將上清轉(zhuǎn)移到新的干凈離心管，加入氯仿0.2mL，溫和混勻，室溫放置15min。4℃12,000rpm離心15min，吸取上層水相，至另一離心管中。加入0.5ml異丙醇,輕輕混勻，-20℃放置20min。4℃12,000rpm離心10min，棄上清，RNA沉于管底。加入預(yù)冷的75％乙醇1mL，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4℃,8,000rpm離心5min，盡量棄上清。置于超凈臺(tái)中使乙醇揮發(fā)。加入DEPC水(無(wú)RNA酶)50ul，55℃水浴10min使RNA溶解，取出后置于冰上。加入DNAaseI，37℃水浴2h，去除DNA。利用博邁德的RNA clean清潔純化試劑盒去除蛋白質(zhì)(具體步驟見(jiàn)說(shuō)明書)，最后用30ulDEPC水溶解RNA。取1ul電泳檢測(cè)質(zhì)量及完整度，取1ul測(cè)吸光度檢測(cè)樣品濃度。剩余RNA樣品-80℃保存。

2、SMARTer 3’RACE cDNA文庫(kù)的建立

SMARTer 3’RACE cDNA文庫(kù)的合成利用BD SMART^TMRACE cDNA Amplification試劑盒進(jìn)行，具體操作如下：

配制反應(yīng)體系:RNA 1ug，3’CDS Primer 1ul，Rnase-free H₂O補(bǔ)足5ul。混勻，瞬時(shí)離心；70℃，2min；冰上2min,瞬時(shí)離心；加入5ul反應(yīng)體系：5*First-strand Buffer 2ul，DTT(20mM)1ul,dNTP(10mM)1ul,BD PowerScript^TMReverse Transcriptase 1ul。輕輕吹吸混勻，瞬時(shí)離心；42℃，90min；72℃，7min；冰上冷卻后，稀釋10倍，至20ng/ul。分裝后，-20℃保存。

3、基因3'UTR的獲得

利用巢式PCR擴(kuò)增基因的3’UTR區(qū)，PCR所用的引物如下：

Nested Universal Primer A(NUP)：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT，(10uM)

3’-GSP-1 GACCTCCCTGTGAACTTGGATGGAAATG

3’-GSP-2 AGCGATGCTGCAGAGATGGAGAAA

擴(kuò)增反應(yīng)體系(25ul)如下：

3’RACE模板1ul,

10x Taq酶buffer 2.5ul,

dNTP 2.0ul,

NUP 0.5ul,

基因特異性引物0.5ul,

ddH₂0 18.375ul。

將RACE一輪PCR產(chǎn)物跑檢測(cè)膠(圖2),RACE二輪PCR產(chǎn)物跑回收膠(圖2)，將目的條帶回收純化。連接到PMD19-T載體上，送測(cè)序；獲得了3′UTR區(qū)序列，其核苷酸序列為SEQ ID NO:1。

實(shí)施例2：針對(duì)基因3′UTR區(qū)序列構(gòu)建重組報(bào)告載體

1、構(gòu)建基因3'UTR報(bào)告載體

1)針對(duì)基因3’UTR區(qū)設(shè)計(jì)一對(duì)兩端帶有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的PCR引物，其中5’和3’引物上加入了一個(gè)BamHI和SacI的酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR。其引物如下：

5’-primer:CGCGGATCCATTGTTCGCTCCACGCA

3’-primer:CGAGCTCCTCCTGCTCACTCTGGAAAC

PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸30s，循環(huán)35次，72℃后延伸10min PCR獲取目的片段，

2)利用膠回收試劑盒(TM16090646)回收擴(kuò)增的基因3’UTR片段，連接在pMD19-T載體上，利用氨芐抗性篩選帶有目的片段的陽(yáng)性菌。

3)利用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI分別切開(kāi)帶有牙鲆基因3’UTR的質(zhì)粒和帶有SP6啟動(dòng)的EGFP-nanos3 3’UTR在體質(zhì)粒，并分別使用膠回收試劑盒(TM1609 0646)回收基因3’UTR和除去nanos3 3’UTR的載體片段；

4)使用T4連接酶將牙鲆基因3’UTR基因片段和載體片段鏈接起來(lái)，構(gòu)建成由SP6啟動(dòng)的并帶有所述基因3'UTRE的熒光報(bào)告載體。

實(shí)施例3：帶有綠色熒光的基因3′-UTR區(qū)序列特異性識(shí)別斑馬魚原始生殖細(xì)胞

1、體外合成帶有綠色熒光的基因的3′-UTR mRNA

1)對(duì)實(shí)例2的第4)步獲得的報(bào)告載體進(jìn)行線性化，使用KpnI對(duì)載體進(jìn)行線性化，應(yīng)用酚氯仿法對(duì)線性化的載體進(jìn)行回收，用10ul DEPC水溶解。

2)體外合成RNA

使用mMESSAGESP6Kit(Ambion)試劑盒體外合成mRNA。2×NTP/CAP 10ul,10×Reaction Buffer 2ul,Linear template DNA 1ug，SP6Enzyme Mix 2ul,加DEPC水補(bǔ)至20ul，混勻瞬離后，37℃反應(yīng)2h。想反應(yīng)體系中加入1ul DnaseI，37℃孵育15min，取1ul跑膠檢測(cè)。加入115ul的DEPC水和15ul的NH₄AC，終止反應(yīng)。加入150ul氯仿：苯酚(1:1)渦旋震蕩后12000rpm離心1min，取上清加入新的1.5mL離心管中,并向原管中加入50ulDEPC水，渦旋震蕩后12000rpm離心1min，取上清加入上一步的1.5mL離心管中。加入200ul的氯仿，渦旋震蕩后12000rpm離心1min，取上清加入新的1.5mL離心管中，并加入200ul異丙醇，放入-80℃沉淀至少1h。4℃，12000rpm離心15min，吸棄異丙醇后再加入200ul 75％乙醇。4℃，12000rpm離心5min，吸棄上清，晾干后加入10ulDEPC水溶解RNA。取1ul電泳檢測(cè)質(zhì)量及完整度，取1ul測(cè)吸光度檢測(cè)樣品濃度。剩余RNA樣品分裝8管(每管1ul)-80℃保存。

2、顯微注射驗(yàn)證基因的3'UTR功能

分別取1ul帶有綠色熒光的基因的3'UTR mRNA和1ul RFP-P.O nanos3 3'UTR mRNA稀釋至400ng/ul，然后兩者1:1混勻，吸取2ul混和好的RNA溶液在一細(xì)胞時(shí)期共注射到斑馬魚胚胎中，對(duì)基因3'UTR功能驗(yàn)證，nanos3 3'UTR已有報(bào)道能標(biāo)記斑馬魚PGCs細(xì)胞，用來(lái)作為陽(yáng)性對(duì)照。注射后放在28℃的恒溫箱中孵育，并每隔一段時(shí)間對(duì)注射的斑馬魚胚胎進(jìn)行綠色和紅色熒光檢查，基因3'UTR功能驗(yàn)證。

結(jié)果顯示，在桑葚胚期就可以檢測(cè)到綠色熒光見(jiàn)圖4a,其中b和c分別是原腸晚期正面和側(cè)面熒光照片，結(jié)果顯示這一時(shí)期已經(jīng)能清清晰的看到PGCs簇。

在體節(jié)期，可清晰的看到基因3'UTR所標(biāo)記的帶有綠色熒光的PGCs簇和nanos3 3'UTR所標(biāo)記的帶有綠紅色熒光的PGCs簇完全重合見(jiàn)圖5；其中d、e、f為帶有綠色熒光基因3'UTR標(biāo)記PGCs結(jié)果，d’、e’、f’為帶有紅色熒光的nanos3 3'UTR標(biāo)記PGCs結(jié)果。

出膜前以及出膜后的跟蹤結(jié)果分別見(jiàn)圖6和圖7，其中g(shù)、h、i為帶有綠色熒光基因3'UTR標(biāo)記PGCs結(jié)果，g’、h’、i’為帶有紅色熒光的nanos3 3'UTR標(biāo)記PGCs結(jié)果。

以上結(jié)果證明帶有綠色熒光的基因3'UTR能和RFP-P.O nanos3 3'UTR實(shí)現(xiàn)共定位，其中帶有基因3'UTR的質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)物能成功的識(shí)別、標(biāo)記斑馬魚PGCs，實(shí)現(xiàn)斑馬魚PGCs活體標(biāo)記，并且熒光結(jié)果顯示比nanos3 3'UTR特異性更強(qiáng)。