本發明屬于環境微生物學領域，具體涉及一株高效除磷和降解卵磷脂的假單胞菌及其在廢水處理、農業等方面的應用。

背景技術：

近幾十年來，隨著我國人口劇增、工業化的大力發展，水體富營養化污染問題愈發嚴重。一般認為，磷是水體富營養化的主要誘發因子，廢水除磷是防止水體富營養化的重要途徑；另一方面，磷是植物生長所需的主要營養元素，磷素不足會嚴重影響植物的生長。為了實現磷資源的可持續發展，目前在廢水除磷領域，如何變傳統的“處理”為“回收”，已經逐漸成為世界各國學者的研究熱點和政府的重點關注對象。

假單胞菌屬在自然界分布廣泛，是土壤中存在的最常見的一種革蘭氏陰性菌，其中一些具備抑菌、硝化和反硝化等功能，對生物防治和環境治理有重大意義。目前有關假單胞菌的報道主要集中在生物防治和廢水處理等方面。如專利201510400702.3（中國，劉立鶴等）報道了一株銅綠假單胞菌，能有效防治玉米大斑病、玉米莖基腐病、玉米紋枯病、包菜葉腐病、豇豆銹病、辣椒葉腐病等植物病害；專利201410598044.9（中國，李強等）發現了一株能處理污水中氨氮的短程硝化細菌，經鑒定為假單胞菌，其對污水中的總氮和COD有一定的去除能力；專利200910032681.9（中國，輝劉等）公開了一株能夠解卵磷脂、促進楊樹苗生長的蠟狀芽孢桿菌；在專利201410665101.0（中國，朱希坤等）中提到一株可以降解不同的酚類化合物的假單胞菌，在處理含酚的工業廢水中有很好的應用價值；專利201010538869.3（中國，袁紅莉等）則報道了一株施氏假單胞菌及其在水體除磷中的應用等。目前，尚無既能處理磷污水又有降解卵磷脂功能的假單胞菌報道，且已公開的磷污水處理方法也不能實現對磷的回收再利用。

本發明菌株MET69是一株假單胞菌(Pseudomonas sp.)，兼具除磷和降解卵磷脂的功能。該菌株與現有報道相比，在除磷能力上有顯著優勢，且該菌株制成固定化小球后，不僅除磷效果進一步提升，并且還能夠實現對磷的回收和循環利用。此外，土壤中的磷有20%～50%是以植酸、核蛋白和卵磷脂的狀態存在的，難以被植物吸收利用，菌株MET69對卵磷脂有降解作用，將其施用于土壤中能夠顯著提高土壤對植物的供磷能力，在制備生物菌肥和解磷酶制劑中都有一定的應用前景。因此，本發明菌株MET69對磷廢水處理和生物農業的發展均具有重要意義。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一株高效除磷和降解卵磷脂的假單胞菌(Pseudomonas sp.)MET69，并將其固定化小球應用于廢水除磷。

本發明通過以下技術方案實現上述目的：

一株高效除磷和降解卵磷脂的假單胞菌，分類命名為：假單胞菌(Pseudomonas sp.)MET69，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號：CCTCC NO：M2016474, 保藏日期：2016年9月12日。

菌株MET69的16S rDNA序列，見序列表。

上述假單胞菌MET69的培養方法：牛肉膏蛋白胨培養基（蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，NaCl5 g/L，蒸餾水1000ml，pH 7.0~7.2），裝液量100 mL（250 mL錐形瓶），種子液接種量1%（牛肉膏蛋白胨培養基體積的1%），以150 r/min在28℃培養10 h。

上述假單胞菌MET69的高效除磷研究：含磷廢水（PAM培養基）配方（g/L）：檸檬酸鈉4.0，氯化鈉0.5，硫酸銨2.5，氯化鈣0.25，硫酸鎂0.25，磷酸二氫鉀0.0439，麥芽糖0.01，甲苯胺藍-O 0.025，蒸餾水1000ml，pH7.2，121℃滅菌30min。

上述假單胞菌MET69的固定化小球處理高磷濃度廢水的研究：模擬廢水配方（g/L）：葡萄糖0.3，蛋白胨0.1，醋酸鈉0.15，氯化鈉0.05，，七水合硫酸鎂0.15，氯化銨0.18，磷酸二氫鉀（以P計：20:mg/L，0.0878），蒸餾水1000mL，pH7.0，115℃滅菌25min。

上述假單胞菌MET69對卵磷脂降解的研究：基礎培養基：葡萄糖10.0 g，(NH₄)₂SO₄0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.3 g，NaCl0.3g，KCl0.3 g，FeSO₄·7H₂O 0.03 g，MnSO₄·4H₂O 0.03 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL ，pH自然，115℃滅菌25min。滅菌后冷卻至 50～60℃。將一個生雞蛋表面消毒后取蛋黃倒入滅菌三角瓶內，加入 50ml 無菌水，混勻按添加量10%加入基礎培養基中，得卵磷脂培養基。

與現有的專利菌株比較，本發明菌株具有以下優點：

（1）用本發明菌株MET69處理低濃度廢水（P≤10mg/L）時，24h內可使廢水滿足《城鎮污水處理廠污染物排放標準》（GB18918-2002）一級B標準（P<0.5mg/L）；用本發明菌株MET69與殼聚糖交聯的固定化小球處理高磷濃度廢水（P約20 mg/L）時，48h磷去除率可達98.54%，處理后可滿足《城鎮污水處理廠污染物排放標準》（GB18918-2002）一級B標準（P<0.5mg/L），說明菌株MET69的除磷容量總體較好，且環境適應性好，在工業化上應用價值大。

（2）本發明菌株MET69對卵磷脂具有較好的降解能力，能夠在以卵磷脂為唯一磷源的培養基上形成顯著的解磷圈，將MET69菌劑施于土壤中，能夠顯著提高土壤的速效磷含量，是良好的土壤改良劑。

附圖說明

圖1是MET69菌株的多除磷酸鹽染色效果。

圖2是MET69在牛肉膏蛋白胨液體培養基中的生長曲線。

圖3是MET69菌株在牛肉膏蛋白胨平板上的培養形態。

圖4是MET69菌株的16S rDNA基因序列系統發育樹。

圖5是MET69殼聚糖固定化小球處理高磷濃度廢水效果。

圖6是MET69對卵磷脂的降解效果。

具體實施方式

以下是本發明的具體實施例，對本發明的技術方案做進一步描述，但本發明的內容不僅僅局限于實施例所述的范圍，凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發明的保護范圍之內。

實施案例中涉及到的培養基組分：

PAM-TBO培養基(g/L)：檸檬酸鈉4.0，氯化鈉0.5，硫酸銨2.5，氯化鈣0.25，硫酸鎂0.25，磷酸二氫鉀0.0439，麥芽糖0.01，甲苯胺藍-O 0.025，蒸餾水1000ml，pH7.2，PAM-TBO培養基用于除磷菌的定性篩選。

富磷培養基(g/L)：醋酸鈉5，氯化銨2, 磷酸二氫鉀0.0439，七水合硫酸鎂0.5，氯化鈣0.2，蒸餾水1000ml，pH7.0~7.2，富集培養基用于除磷菌的活化。

牛肉膏蛋白胨培養基(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，蒸餾水1000ml，pH7.0~7.2，牛肉膏蛋白胨培養基用于菌株的分離純化、保藏及馴化。

模擬廢水配方（g/L）：葡萄糖0.3，蛋白胨0.1，醋酸鈉0.15，氯化鈉0.05，，七水合硫酸鎂0.15，氯化銨0.18，磷酸二氫鉀（以P計：10mg/L，0.0439；以P計：20:mg/L， 0.0878），蒸餾水1000mL， pH7.0。

卵磷脂培養基：基礎培養基（g/L）：葡萄糖10.0 ，(NH₄)₂SO₄ 0.5 ，MgSO₄·7H₂O 0.3，NaCl 0.3，KCl 0.3 ，FeSO₄·7H₂O 0.03 ，MnSO₄·4H₂O 0.03 ，瓊脂20，蒸餾水1000 mL ，pH自然，115℃滅菌25min。基礎培養基滅菌后冷卻至 50～60℃。將一個生雞蛋表面消毒后取蛋黃倒入滅菌三角瓶內，加入 50ml 無菌水，混勻按添加量10%加入基礎培養基中，即得卵磷脂培養基。

實施例1假單胞菌(Pseudomonas sp.)MET69的篩選

VasviChaudhry和Chandra ShekharNautiyal曾在2011年第102卷17期的《Bioresource Technology》上報道了一種高通量篩選除磷菌的方法，利用甲苯胺藍能夠對菌株中的多除磷酸鹽顆粒染色的特性，可以快速鑒定除磷菌。本發明菌株即通過此方法篩選獲得，具體操作步驟：

①將采集到的湖北省黃石市陽新縣化工廠廢水樣與無菌水按1:9的比例稀釋混勻，所得懸浮液濃度為10^-1；

②再將此菌懸液10倍比稀釋成不同濃度，分別涂布于富磷培養基上，28℃倒置培養48h；

③挑取形態特征不同的菌落進行劃線純化，對純化菌株進行編號，留存備用；

④將上述菌株活化獲得種子液，在96孔板上每孔分別加0.18ml液體PAM-TBO培養基，并接種20μL菌液，縱列每三個孔為一組，即每個菌株做3次重復，以不接種菌樣的處理作為對照；

⑤用封口膜將96孔板密封，正置28℃培養2~3d，觀察孔板內褪色情況，結果見圖1。褪色越明顯表明菌株除磷能力越強，對褪色明顯的菌株進行甘油法保藏。

通過上述篩選方法，獲得1株能夠使甲苯胺藍培養基顯著褪色的菌株，編號為MET69，即本專利菌株。MET69活化后按1%接種量（占牛肉膏蛋白胨培養基體積的1%）接種至牛肉膏蛋白胨液體培養基，生長曲線見圖2。由圖可知MET69的對數期大約在10~28h，此時MET69活性最強，除磷效率較高。

實施例2 菌株MET69的鑒定

（1）形態特征和生理生化特征

菌株MET69的形態和生理生化特征：在牛肉膏蛋白胨平板上28℃恒溫培養48h，菌落呈2~3mm圓形，邊緣光滑，呈淡黃色，不透明，具體菌落形態見圖3。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》，得該菌株還有如下特征：革蘭氏染色陰性，菌體桿狀，無芽孢和莢膜形成，兼性厭氧，無鞭毛，過氧化氫酶陽性，淀粉酶反應陰性，甲基紅陰性，V-P反應陰性。

（2）16S rDNA分子鑒定

以菌株DNA 為模板進行16S rDNA V3 區的PCR 擴增，引物序列為：27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）；

PCR體系建立（50μL）：Template DNA 1μL、Forward Primer(10uM) 1μL、Reverse Primer(10uM) 1μL、Taq-Plus 1μL、Taq-Plus Buffer 5μL、dNTPs(2mM）5μL、無菌水36μL。

PCR反應參數為：95℃預變性5min，94℃變性30s，55℃復性45s，72℃延伸90s，共30個循環，最后再72℃延伸10min。

PCR結束后，取5μLPCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段大小約1.5kb。將PCR產物回收后送至武漢擎科創新生物科技有限公司進行測序。所測序列長度為1566bp。

將所測得序列在NCBI上進行BLAST 比對，結果顯示序列與菌株MET69相似性達99%的均為假單胞菌屬。下載相關性較高的16S rDNA序列，用MEGA軟件構建MET69的系統發育樹，見圖4。

結合菌株形態、生理生化特征和16S rDNA序列比對分析，最終確定菌株MET69是一株假單胞菌(Pseudomonas sp.)。

實施例3本發明菌株除磷性能研究

為了評價本發明菌株的除磷性能，對菌株MET69在磷濃度分別為5、10、15、20 mg/L的含磷廢水（PAM培養基）中的除磷率進行測定并比較。

將菌株MET69活化培養至OD₆₀₀為1.0，按10%的接種量（為PAM培養基的體積10%）轉接至200 mL的PAM培養基（以P計：5、10、15、20 mg/L）中，于28 ℃、150 r/min條件下培養，隔12、24、36、48、60（h）取樣，10000 r/min離心10 min后，鉬銻抗比色法測定上清液的磷濃度（GB 11893-89），并計算除磷率（結果見表1）。

除磷率（%）=（X_進樣－X_出樣）／X_進樣×100％

X_進樣：接入菌株前的富集培養液的總磷濃度

X_出樣：接入菌株后的富集培養液的總磷濃度

表1 MET69處理不同磷濃度廢水效果比較

結果表明，本發明菌株能高效處理低濃度（P≤10mg/L）含磷廢水，處理后24h內可滿足《城鎮污水處理廠污染物排放標準》（GB18918-2002）一級B標準（P<0.5mg/L），除磷效果顯著，但在處理較高濃度（10<P≤20mg/L）的含磷廢水時，尚不能滿足排放標準。為了提高菌株MET69的除磷性能和循環性能，對菌株進行固定化處理研究。

實施例4菌株MET69固定化小球高磷濃度廢水（P約20 mg/L）處理

固定化空白小球的制備：將2.5%殼聚糖膠體溶液用8號針頭滴入凝結液（20%甲醇和30%NaOH）中，作用2 h后得到中空殼聚糖球，取出用去離子水洗滌，備用。

固定化包埋菌小球的制備：將制備好的固定化空白小球放入濕菌與滅菌生理鹽水的質量體積比（g:ml）為2:100的菌懸液中，吸附2 h，取出殼聚糖球并用滅菌生理鹽水洗滌后備用。

分別稱取2g固定化空白小球、固定化包埋菌小球，然后分別放入裝有200 ml磷濃度為20 mg/L廢水的500 ml錐形瓶中，在28 ℃、150 r/min搖床中處理，每隔一定時間0、12、24、36、48、72（h）取廢水5 ml，于離心機中10000 r/min離心10 min，取上清，按照鉬酸銨分光光度法（GB11893-89）測定其中總磷含量，計算除磷率。

實驗結果見附圖5，如圖所示，固定化包埋菌小球處理高磷濃度廢水在48 h時，除磷效果達到最佳，除磷率為98.54%，此時體系中的磷濃度為0.292 mg/L。

實驗結果表明，用假單胞菌MET69與殼聚糖的交聯小球處理高磷濃度廢水（P約20 mg/L），，能夠在48 h內使其滿足《城鎮污水處理廠污染物排放標準》（GB18918-2002）一級B標準（P<0.5mg/L）。說明菌株MET69被固定化后，不僅除磷能力進一步提高，還實現了對磷素的回收和循環利用。

實施例5菌株MET69對卵磷脂的降解作用

MET69對卵磷脂的降解作用采用解磷圈法進行驗證，將MET69在牛肉膏蛋白胨液體培養基中活化10h后，在卵磷脂平板上劃線（點樣），37℃下倒置培養48h后，可見MET69的菌落周圍出現明顯的解磷圈（解磷圈是指在含有機磷的固體培養基上，菌落周圍產生的因有機磷降解而形成的透明圈），結果見附圖6。MET69能夠在以卵磷脂為唯一磷源的平板上生長并形成透明解磷圈，說明MET69對卵磷脂有較好的降解作用。

實施例6 MET69對土壤速效磷含量的影響

取大學周邊未施肥的普通土壤作為參照，驗證MET69對土壤速效磷的影響。土壤速效磷也稱土壤有效磷，包括水溶性磷和弱酸溶性磷，速效磷容易被植物吸收利用，故其含量是判斷土壤供磷能力的一項重要指標。本實施例用0.5mol/L的NaHCO₃（pH8.5）為浸提劑處理土壤，浸出液的含磷量采用鉬銻抗比色法（GB 11893-89）測定。

將MET69在牛肉膏蛋白胨液體培養中活化10h后，收集菌體并用無菌水清洗1次，再用無菌水調OD₆₀₀至1.0，此時菌濃度約3×10⁸cfu/mL。每100g土樣添加10mL的MET69菌液并攪拌均勻，置于自然環境下并于0h，24h，48h，72h分別取樣。

稱取通過1mm篩孔的風干土樣5.00g置于250ml三角瓶中，加入一小勺無磷活性炭和0.5mol/L的NaHCO₃（pH8.5）浸提液100ml，塞緊瓶塞于劇烈震蕩30min，取出后立即用干燥漏斗和無磷濾紙過濾，濾液用另一只三角瓶盛接。取10mL濾液用鉬銻抗比色法測定磷濃度，代入公式計算對應的土壤速效磷含量，結果見表2。

土壤速效磷含量（mg/kg）=

注：

表2 MET69在72h內對土壤有效磷含量的影響

由表2可知，供試土壤原本的供磷能力較低，但在將MET69菌劑施用于土壤72h后，供試土壤中速效磷含量明顯提高，供磷能力呈中等偏上水平，說明MET69是良好的土壤改良劑，能夠促進土壤及時為植物補充磷素，對減少化學肥料的施用，降低農業成本，實現對土壤環境的生物修復具有重要意義。

序列表

<110>湖北大學

<120>一株高效除磷和降解卵磷脂的假單胞菌

<160>3

<210>1

<211>1566

<212>DNA

<213>假單胞菌(Pseudomonas sp.)

<400>1

ggcctgcagg tcgacgattg gttaccttgt tacgacttca ccccagtcat gaatcactcc 60

gtggtaaccg tcccccttgc ggttagacta gctacttctg gagcaaccca ctcccatggt 120

gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gtgacattct gattcacgat 180

tactagcgat tccgacttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccggac tacgatcggt 240

tttatgggat tagctccacc tcgcggcttg gcaacccttt gtaccgacca ttgtagcacg 300

tgtgtagccc tggccgtaag ggccatgatg acttgacgtc atccccacct tcctccggtt 360

tgtcaccggc agtctcctta gagtgcccac ccgaggtgct ggtaactaag gacaagggtt 420

gcgctcgtta cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca gccatgcagc 480

acctgtgtct gagttcccga aggcaccaat ccatctctgg aaagttctca gcatgtcaag 540

gccaggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 600

cccccgtcaa ttcatttgag ttttaacctt gcggccgtac tccccaggcg gtcgacttat 660

cgcgttagct gcgccactaa gatctcaagg atcccaacgg ctagtcgaca tcgtttacgg 720

cgtggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgcacc tcagtgtcag 780

tatcagtcca ggtggtcgcc ttcgccactg gtgttccttc ctatatctac gcatttcacc 840

gctacacagg aaattccacc accctctacc gtactctagc tcagtagttt tggatgcagt 900

tcccaggttg agcccgggga tttcacatcc aacttgctga accacctacg cgcgctttac 960

gcccagtaat tccgattaac gcttgcaccc ttcgtattac cgcggctgct ggcacgaagt 1020

tagccggtgc ttattctgtt ggtaacgtca aaacagcaag gtattaactt actgcccttc 1080

ctcccaactt aaagtgcttt acaatccgaa gaccttcttc acacacgcgg catggctgga 1140

tcaggccttc gcccattgtc caatattctc cactgctgcc tcccgtagga gtctggaccg 1200

tgtctcagtt ccagtgtgac tgatcatcct ctcagaccag ttacggatcg tcgccttggt 1260

aggcctttac cccaccaact agctaatccg acctaggctc atctgatagc gtgaggtccg 1320

aagatccccc actttctccc tcaggacgta tgcggtatta gcgcccgttt ccggacgtta 1380

tcccccacta ccaggcagat tcctaggcat tactcacccg tccgccgctg aatccaggag 1440

caagctccct tcatccgctc gacttgcatg tgttaggcct gccgccagcg ttcaatctga 1500

gccaggatca aactctaatc tctagaggat ccccgggtac cgagctcgaa ttcgtaatca 1560

gttttc 1566

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19