本發(fā)明屬于食品加工和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種利用生物技術(shù)構(gòu)建基因工程菌用于鎘超標(biāo)稻米（簡(jiǎn)稱鎘米）降鎘加工生產(chǎn)海藻糖的方法。
背景技術(shù)：
：鎘米，一般指鎘含量超標(biāo)（中國(guó)國(guó)標(biāo)為0.2mg/kg）的大米。過(guò)去幾十年，由于片面追求GDP的增長(zhǎng)和對(duì)環(huán)保的不重視，中國(guó)土壤污染越來(lái)越嚴(yán)重，大米鎘等重金屬超標(biāo)也越來(lái)越嚴(yán)重；2008年南京農(nóng)大潘根興團(tuán)隊(duì)在全國(guó)多個(gè)縣級(jí)以上市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu)樣品，結(jié)果表明10%左右的市售大米鎘超標(biāo)；2013年廣東鎘米風(fēng)波中報(bào)道湖南、江西等地流向廣東的鎘米最高竟超過(guò)國(guó)標(biāo)6倍；由于土地污染治理困難，今后相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間中國(guó)將面臨大量鎘米的加工處理難題；楊居榮等人的研究表明，鎘在稻米中主要與蛋白質(zhì)結(jié)合，與淀粉結(jié)合較少；而現(xiàn)在的去鎘方法多集中在物理或化學(xué)方法，少見生物方法去鎘，更缺乏將鎘米脫鎘后加工成高附加值產(chǎn)品如海藻糖等產(chǎn)品的研究。海藻糖（Trehalose）是由兩分子葡萄糖以α，α-1，1-糖苷鍵相連而成的非還原性二糖，由于其具有對(duì)生物體優(yōu)良的抗逆保護(hù)作用等優(yōu)良性能而被譽(yù)為“生命之糖”和“二十一世紀(jì)的新型糖類”，其大規(guī)模制造方法受到廣泛關(guān)注；海藻糖現(xiàn)在主要以雙酶法或單酶法生產(chǎn)，單酶法以麥芽糖為原料，由于只用一種酶，因而具有簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，但現(xiàn)有海藻糖合成酶存在反應(yīng)溫度偏低，易染雜菌，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率偏低的缺陷，而用來(lái)生產(chǎn)海藻糖合成酶的基因工程菌常用甘油等為發(fā)酵培養(yǎng)基主成分，成本較高，這些缺點(diǎn)均嚴(yán)重影響了單酶法的推廣和應(yīng)用。展示蛋白或酶的酵母菌細(xì)胞具有固定化可重復(fù)使用的優(yōu)點(diǎn)，又具有制備簡(jiǎn)單，可高密度培養(yǎng)獲得大量菌體，成本較低的特點(diǎn)，因而自上世紀(jì)末問(wèn)世以來(lái)，發(fā)展迅猛，已有許多種蛋白或酶被成功表達(dá)的報(bào)道；馮俠等（基于展示技術(shù)的Cd2+結(jié)合肽篩選與酵母重金屬吸附研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42（9）：142-145）報(bào)道將十二肽展示在釀酒酵母EBY100上，誘導(dǎo)24h后得到能吸附Cd2+的酵母菌，但其對(duì)Cd2+的吸附率不高，只有30.4%。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題一是構(gòu)建吸附效果更好的酵母基因工程菌來(lái)更有效地脫去鎘米蛋白酶解游離出來(lái)的鎘，二是構(gòu)建能產(chǎn)耐高溫、反應(yīng)時(shí)間較短、轉(zhuǎn)化率較高的海藻糖合成酶基因工程菌，三是利用脫鎘大米蛋白肽作為海藻糖合成酶基因工程菌的主成分培養(yǎng)基，進(jìn)一步降低海藻糖合成酶生產(chǎn)成本，從技術(shù)上進(jìn)一步方便生產(chǎn)使用并降低大米生產(chǎn)海藻糖的加工利用成本，提升鎘米的加工附加值，降低鎘米因不能食用只能賤賣所造成的經(jīng)濟(jì)損失。本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：（1）將鎘米浸泡1~3h，磨成50~80目的米漿，加水調(diào)成20~40%（W/W）濃度的淀粉乳，調(diào)pH到6.1~6.5，按5~10U/g加α-淀粉酶在90~110℃條件下分解20~60分鐘，然后降溫到55~65℃，用板框壓濾機(jī)將其分離成鎘蛋白與液化糖漿；（2）將上述（1）所得的鎘蛋白以重量計(jì)加入1~3倍的水，加NaOH調(diào)pH到7~8，然后按1~3%（W/W）的比例加入蛋白酶攪拌4~8h后，按2~6%（W/W）加入展示金屬親和肽BMP的畢赤酵母基因工程菌（簡(jiǎn)稱BMP基因工程菌），攪拌16~24h吸附蛋白酶分解游離出來(lái)的鎘，然后用離心機(jī)將其分離成吸鎘酵母與脫鎘大米蛋白肽，將脫鎘大米蛋白肽冷凍干燥后用作海藻糖合成酶TreS基因工程菌（簡(jiǎn)稱TreS基因工程菌）發(fā)酵培養(yǎng)基的主成分；（3）在上述（1）所述液化糖漿中按15~25U/g的量加入β-淀粉酶，糖化2~4h后，得麥芽糖漿；（4）將TreS基因工程菌按4~8%的接種量接入大米蛋白肽為主成分的培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)至OD約為0.6時(shí)加入終濃度為0.5mmol/L的乳糖作為誘導(dǎo)劑，在22~26℃，200r/min誘導(dǎo)16~24h，將發(fā)酵液經(jīng)均質(zhì)機(jī)破碎菌體細(xì)胞后即得海藻糖合成酶粗酶液；（5）以重量計(jì)將5~10份（4）所述海藻糖合成酶粗酶液加入95~90份（3）所述的麥芽糖漿中，在pH4.5~7，42~52℃溫度下進(jìn)行催化反應(yīng)2~8h后過(guò)濾分離，將過(guò)濾分離后所得的反應(yīng)液再經(jīng)壓濾、離交、色譜分離，所得的海藻糖漿經(jīng)濃縮、干燥、結(jié)晶即得到結(jié)晶海藻糖，而色譜分離所得麥芽糖漿返回合并到（3）所述的麥芽糖漿中作為海藻糖生產(chǎn)原料。如[0006]所述BMP基因工程菌制備方法如下：通過(guò)半理性設(shè)計(jì)等方法，在前人基因序列基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，設(shè)計(jì)合成一系列新的基因序列，委托生物公司進(jìn)行序列合成和多個(gè)相關(guān)基因工程菌構(gòu)建；然后通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選擇合成鎘親和性好的SEQNO1序列（見后附序列表SEQNO1），將合成得到的DNA克隆在pUC57載體上，然后進(jìn)一步亞克隆到pPIC9K載體中，再轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，得到展示金屬親和肽BMP的畢赤酵母基因工程菌，即BMP基因工程菌，其對(duì)鎘的吸附率在70~80%。如[0006]所述TreS基因工程菌的制備方法如下：通過(guò)半理性設(shè)計(jì)等方法，在前人基因序列基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，設(shè)計(jì)合成一系列新的基因序列，委托生物公司進(jìn)行序列合成和多個(gè)相關(guān)基因工程菌構(gòu)建；然后通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選擇合成具有耐高溫、催化反應(yīng)時(shí)間較短且活性較高特點(diǎn)的海藻糖合成酶DNA序列SEQNO2（見后附序列表SEQNO2），將合成的基因構(gòu)建到pET28a(+)載體中的NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)之間，將構(gòu)建好的基因轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)plysS大腸桿菌中，得到一種TreS反應(yīng)溫度在42~52℃、反應(yīng)時(shí)間2~8h的TreS基因工程菌。如[0006]（2）、（4）中所指用作TreS基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基是按每L培養(yǎng)基用（2）中所述冷凍干燥后的脫鎘大米蛋白肽20~30g，與2~3gMgSO4及5~10ml微量元素液混合后，再加水復(fù)配成1L制成的；其中微量元素液預(yù)先按：FeSO4·7H2O10g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、CuSO4·5H2O2.25g/L、MnSO4·5H2O0.5g/L、CaSO4·2H2O2g/L用1mol/LHCl溶解配制并儲(chǔ)于棕色試劑瓶中備用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，脫鎘率較高，達(dá)到75%左右；用脫鎘大米蛋白為主成分培養(yǎng)基培養(yǎng)海藻糖合成酶大腸桿菌基因工程菌比原來(lái)用甘油等為主成分的培養(yǎng)基成本降低50%以上；用該菌生產(chǎn)的海藻糖合成酶催化麥芽糖生產(chǎn)海藻糖，轉(zhuǎn)化率達(dá)到73.92%左右，反應(yīng)溫度為42~52℃，難染雜菌，且反應(yīng)時(shí)間較短，只要2~8h，因而海藻糖生產(chǎn)成本大大降低。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明生產(chǎn)工藝流程圖。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此，對(duì)于未特別注明的工藝參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。實(shí)施例1pPIC9K-BMP載體的構(gòu)建：將BMP金屬親和肽DNA序列SEQNO：1人工合成，序列的5’端添加EcoRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，3’端添加NotI位點(diǎn)。EcoRI-BMP-NotI委托生物公司合成并克隆到pUC57載體的多克隆位點(diǎn)上，命名為pUC57-BMP；分別將pUC57-BMP和pPIC9K載體進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切反應(yīng)，37℃水浴4h后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定；采用凝膠回收試劑盒對(duì)目的基因片斷BMP和pPIC9K載體片段進(jìn)行回收；再用T4DNALigase進(jìn)行連接反應(yīng)，22℃過(guò)夜連接，將其轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布在含有amp和kana抗性的LB固體培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨+0.5%酵母提取物+0.5%NaCl+1.5%瓊脂）上37℃過(guò)夜培養(yǎng)后挑取克隆進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，質(zhì)粒抽提，并進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切反應(yīng)，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定；將陽(yáng)性克隆命名為pPIC9K-BMP；實(shí)施例2pPIC9K-BMP轉(zhuǎn)化到畢氏酵母GS115中，按照如下步驟進(jìn)行：（1）煮沸1ml鮭魚精DNA5min，迅速冰浴后以制備單鏈擔(dān)體DNA；（2）將pPIC9K-BMP用SacI內(nèi)切酶進(jìn)行線性化處理；（3）將感受態(tài)酵母菌GS115離心，用Tips去除殘余的LiCl溶液；（4）對(duì)于每一個(gè)轉(zhuǎn)化，按以下順序加入：50%PEG3350，240ml；1MLiCl，36ml；2mg/ml單鏈SalmonspermDNA，25ml；5～10mg/50mlH2O質(zhì)粒DNA，50ml；（5）劇烈旋渦混勻至沉淀菌體完全分布均勻（約1min）；（6）30℃水浴孵育30min；（7）42℃水浴熱休克20～25min；（8）6000～8000rpm離心收集酵母菌體；重懸酵母于1mlYPD培養(yǎng)基（2%Trypton+2%Dextrose)；（9）30℃搖床孵育；(10)1～4h后，取25～100ml菌液鋪YD選擇性培養(yǎng)基（1.67%YNB+2%dextrose+1%瓊脂粉）平板，于30℃培養(yǎng)2～3d鑒定（將表達(dá)菌株和對(duì)照菌株在固體培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)）。實(shí)施例3BMP基因工程菌制備：將畢赤酵母重組菌接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min培養(yǎng)24h進(jìn)行活化；按1%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的BMGY培養(yǎng)基（1%Yeastextract+2%Peptone+1.34%YNB+4×10-5生物素+1%甘油/0.5%甲醇+10%1MPBS)中，30℃，180r/min培養(yǎng)4～5d，每24h添加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)；收集發(fā)酵菌體，菌泥用pH8.0緩沖液洗滌3次；經(jīng)離心后得濕菌體，制得BMP基因工程菌。實(shí)施例4BMP基因工程菌對(duì)鎘米脫鎘處理：將鎘米浸泡2h，磨成60目的米漿，加水調(diào)成30%（W/W）濃度的淀粉乳，調(diào)pH到6.3，按8U/g加α-淀粉酶在100℃條件下分解30~40分鐘，然后降溫到60℃，用板框壓濾機(jī)將其分離成鎘蛋白與液化糖漿；將所得鎘蛋白以重量計(jì)加入2倍的水，加NaOH調(diào)pH到7.5，然后按2%（W/W）的比例加入蛋白酶攪拌6h后，按4%（W/W）加入BMP基因工程菌，振蕩20h吸附蛋白酶分解游離出來(lái)的鎘等重金屬，然后用離心機(jī)將其分離成吸鎘酵母與脫鎘大米蛋白肽，將脫鎘大米蛋白肽冷凍干燥后用作海藻糖合成酶基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基的主成分。實(shí)施例5酵母工程菌脫鎘程度的測(cè)定：按國(guó)標(biāo)法用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定Cd2+離子質(zhì)量濃度，然后計(jì)算吸收率，進(jìn)而計(jì)算對(duì)鎘的吸附率，測(cè)定結(jié)果如下：表1MBP酵母工程菌脫鎘效果鎘蛋白中鎘含量脫鎘多肽中鎘含量BMP基因工程菌脫鎘率0.60±0.11mg/kg0.15±0.03mg/kg75.0±5.0%實(shí)施例6TreS基因工程菌的制備：按SEQNO2所示TreSDNA序列，將合成的基因構(gòu)建到pET28a(+)載體中的NcoI和XhoI酶切位點(diǎn)之間，再將構(gòu)建好的基因轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)plysS大腸桿菌中，得到一種反應(yīng)溫度在42~52℃、反應(yīng)時(shí)間2~8h的TreS基因工程菌。實(shí)施例7TreS基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：每L培養(yǎng)基按將上述所得冷凍干燥后的脫鎘大米蛋白肽以重量計(jì)按25g加入2.08gMgSO4、10ml微量元素液的比例再加水復(fù)配成1L發(fā)酵培養(yǎng)基方式配制，供TreS基因工程菌經(jīng)LB種子發(fā)酵和搖瓶發(fā)酵后進(jìn)一步發(fā)酵擴(kuò)培生產(chǎn)用；其中微量元素液按：FeSO4·7H2O10g/L、ZnSO4·7H2O2.25g/L、CuSO4·5H2O2.25g/L、MnSO4·5H2O0.5g/L、CaSO4·2H2O2g/L用1mol/LHCl溶解并儲(chǔ)于棕色試劑瓶中配制備用。實(shí)施例8海藻糖合成酶的制備：以[0019]中所述培養(yǎng)基，將TreS基因工程菌按5%的接種量接入，培養(yǎng)至OD約為0.6時(shí)加入終濃度為0.5mmol/L的乳糖作為誘導(dǎo)劑，在25℃，200r/min誘導(dǎo)20h，將發(fā)酵液經(jīng)均質(zhì)機(jī)破碎后離心，取上清液即為海藻糖合成酶粗酶液。實(shí)施例9海藻糖漿的制備：在[0016]所述液化糖漿中按20U/g的量加入β-淀粉酶，糖化3h后，得麥芽糖漿；以重量計(jì)將10份[0020]中所述的海藻糖合成酶粗酶液加到90份該麥芽糖漿中，在pH4.5~7，42~52℃溫度下進(jìn)行催化反應(yīng)6h后，用HPLC對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行各種糖含量分析，結(jié)果為海藻糖21.51±2.33%，麥芽糖5.58±1.37%，葡萄糖含量1.83±0.36%，由底物濃度29.10%，計(jì)算轉(zhuǎn)化率為21.51/29.1=73.92%；將催化反應(yīng)所得糖漿再經(jīng)壓濾、離交、色譜分離，即得海藻糖漿和麥芽糖漿，如圖1所示，海藻糖漿可根據(jù)市場(chǎng)需要調(diào)配成海藻糖濃度為20~70%的糖漿出售或進(jìn)一步制成結(jié)晶海藻糖，而麥芽糖漿可重新用作海藻糖生產(chǎn)原料。實(shí)施例10結(jié)晶海藻糖的生產(chǎn)：[0021]所述生產(chǎn)所得海藻糖漿如圖1所示經(jīng)濃縮、結(jié)晶、離心、干燥后得到純度在98%以上的結(jié)晶海藻糖。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3