本發明涉及一種好氧酒糟有機肥浸提液的制備及應用，屬于堆肥提取液技術領域。

背景技術：

堆肥提取液(compost tea或者compost extracts)是指堆制腐熟的有機物料經過不同方法提取后的提取液。目前堆肥提取液的生產主要有兩種工藝，但各有其優缺點。其中一種是好氣提取堆肥提取液(Aerated fermentation extracts compost，即AFEC)，特點是提取時間短，但是需要外在能源(氧氣，糖蜜，魚乳膠物0.5mol·L^-1，腐殖物質，植物提取物等)的補充；而另一種則是厭氣提取堆肥提取液(Non-aerated fermentation extracts compost，即NAFEC)，特點是不需要外在的能源供應，但是提取時間比較長。

越來越多的研究表明，堆肥提取液不僅能夠為作物提供養分和有益的有機營養物質，而且還能夠抑制作物病害和改良土壤結構。然而，目前關于堆肥提取液中物質成分和結構特征研究的報道較少。到目前為止，很少有文獻報道好氣提取酒糟堆肥提取液(AFEC)和厭氣提取酒糟堆肥提取液(NAFEC)與直接提取酒糟堆肥提取液(DEC：提取時間短，不需要外加物質和能源)的物質成分與結構特征及其對作物促生效果的差異。

特別是以酒糟堆肥為原料，好氣提取和厭氣提取工藝對酒糟堆肥提取液中可培養微生物數量以及細菌結構功能多樣性的影響目前不清楚。因此，無法針對性的根據作物實際需要來提供不同的酒糟浸提液。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是：提供一種好氧酒糟有機肥浸提液的制備及應用，制備的浸提液微生物量以及豐度顯著高于采用厭氧及直接提取方法，且養分轉化性好，易被作物直接吸收，可以克服現有技術的不足。

本發明的技術方案：一種好氧酒糟有機肥浸提液的制備方法，將酒糟堆肥與水按1:8的質量比例充分混勻后置于塑料桶內，在塑料桶中均勻分布地插入三根帶有冒氣頭的氣管，在20℃-25℃下持續通氣36h，再經紗布過濾后即得酒糟有機肥浸提液。

所述酒糟堆肥中含有機質74.8％、全氮3.57％、全磷2.18％和全鉀1.23％。

所述通氣量為33L·min-1。

所述酒糟有機肥浸提液在作物葉面噴施上的應用。

本發明的有益效果是：本發明好氧方法所制備的浸提液，與厭氧和直接提取方法相比，在微生物量以及豐度方面提高顯著，養分轉化性較好；同時由于本浸提液的活性較好，因此特別適合作物葉面使用，易被作物直接吸收。

附圖說明

圖1為不同提取比例和通氣條件對酒糟堆肥提取液養分含量的影響；

圖2為不同浸提比例和通氣條件對可浸提主要成分提取率的影響(25℃)；

圖3為不同提取工藝酒糟堆肥提取液中細菌16S rDNA V3片段PCR產物的DGGE圖譜；

圖4為不同提取工藝酒糟堆肥提取液細菌DGGE圖譜系統分析。

具體實施方式

為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步地詳細描述。

一、實施例：

1、材料準備

酒糟堆肥由金沙加孟農業專業合作社提供，其基本性質如下：有機質(OM)：74.8％；全氮(TN)：3.57％；全磷(TP)：2.18％和全鉀(TK)：1.23％。

2、浸提液制備

將酒糟堆肥與水按1:8的質量比例充分混勻后置于塑料桶內，在塑料桶中均勻分布地插入三根帶有冒氣頭的氣管，在20℃-25℃下持續通氣36h，再經雙層紗布過濾后即得酒糟有機肥浸提液，在4℃下保存備用，其中通氣量為33L·min-1。

3、浸提液使用

在作物生長階段，可將該浸提液作為根施施用，以利于作物根系的生長，進而起到促生作用。

二、設計試驗及分析方法

1、材料準備

原料酒糟堆肥如前所述。

2、不同提取工藝酒糟堆肥提取液制備

將堆肥與水(堆肥與水質量比為1：8)充分混勻，連續攪拌15min，靜置片刻，雙層紗布過濾后，濾液(在4℃下保存)備用。這種提取方法所獲得的提取液稱之為直接提取酒糟堆肥提取液(DEC)。

將堆肥與水充分混勻后，密封塑料桶并蓋好蓋子，保存7天(20℃-25℃)，再經雙層紗布過濾，濾液(在4℃下保存)備用。這種提取方法所獲得的提取液稱之為厭氣提取酒糟堆肥提取液(NAFEC)。

將堆肥與水充分混勻后，在每個桶中均勻分布地插入三根帶有冒氣頭的氣管，持續通氣(通氣量為33L·min-1)36h(20℃-25℃)，經雙層紗布過濾，濾液(在4℃下保存)備用。這種提取方法所獲得的提取液稱之為好氣提取酒糟堆肥提取液(AFEC)。

每種工藝重復3次。

3、不同提取工藝酒糟堆肥提取液基本理化性質分析

酒糟堆肥提取液理化性質分析參照有機肥養分測定農業行業標準(2002)和鮑士旦(2000)主編《土壤農化分析》。分析前，需將堆肥提取液經中速定量濾紙(直徑為11cm)過濾。有機質含量的測定采用重鉻酸鉀容量法。

TN、TP和TK的前處理：取2mL酒糟堆肥提取液，雙氧水-濃硫酸消煮，定容到100毫升待測。

TN：用連續流動自動分析儀(Auto Analyzers 3，Bran+Luebbe Germany)測定；TP：用鉬銻抗比色法722分光光度計測定；TK：用FP6400火焰光度計測定。

電導率(EC)和pH的測定：酒糟堆肥提取液經濾紙過濾后用電導儀(WTW，LF91，Germany)和pH計(PB-10，Sartorius)直接測定。

以上各樣品分析重復5次。

總水溶性有機碳(TWSOC)和腐殖酸碳：TWSOC和Humic-C含量采用TOC儀測定(Elementar Liquid TOCⅡ，德國)，重復3次。

4、不同提取工藝酒糟堆肥提取液微生物區系和細菌群落結構分析

①不同提取工藝酒糟堆肥提取液可培養微生物區系分析

采用連續稀釋培養法(Ren等，2008)。堆肥提取液可培養微生物計數培養基：細菌采用牛肉膏蛋白胨培養基；放線菌用高氏1號培養基；真菌用馬丁氏培養基。

②不同提取工藝酒糟堆肥提取液細菌群落結構多樣性分析

土壤DNA的提取和純化方法參考：張瑞福等(2003)；黃婷婷等(2004)方法，并稍作修改。具體方法如下：

稱取5mL堆肥提取液樣品，與13.5mL DNA提取緩沖液混合，加入100μL蛋白酶K(10mg·mL-1)，于37℃搖床上振蕩30min(225r·min-1)；再加入1.5mL的200g·L-1十二烷基硫酸鈉(SDS)，65℃水浴2h，其間每隔15-20min輕輕顛倒混勻；迅速置于-70℃冰凍30min，取出后于65℃水浴融化，如此反復2-3次裂解細胞；室溫離心(12000rpm)10min，收集上清液，轉移到50mL離心管中，樣品沉淀再加入4.5mL提取液和0.5mL的200g·L-1SDS，渦旋10s，65℃水浴10min，室溫離心(12000rpm)10min，收集上清液并與前次上清液合并。上清液用等體積的氯仿-異戊醇(v：v＝24：1)抽提，離心后吸取水相轉移至另一50mL離心管中，以0.6體積異丙醇室溫沉淀1h，室溫離心(12000rpm)20min，收集核酸沉淀，用冷的700ml·L-1乙醇洗滌沉淀，吹干，溶解于滅菌的超純水中，最終體積為200μL。

聚合酶鏈式反應(PCR)參考Nakatsu等(2000)方法。PCR擴增反應體系：10×緩沖液2.5μL，dNTP(25mmol·L-1)2μL，引物1(25pmol·ìL-1)0.5μL，引物2(25pmol·ìL-1)0.5μL，Mg2+(25mmol·L-1)2.5μL，模板(適當稀釋的土壤DNA)1μL，Taq DNA聚合酶1μL，雙蒸水15μL，總體積25μL。反應條件：94℃預變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸15s，72℃保持5min，共循環35次，4℃保溫。

引物為細菌通用引物：引物1：PRBA338F Bacteria V3region(338-358)5-AC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3；引物2：PRUN518R Universal V3region(534-518)5-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3；GC clamp：5-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G-3。

DGGE及DGGE凝膠的分析參考Asakawa等(2008)，Nakatsu等(2000)和Navarro-Noya等(2010)。

堆肥提取液中DNA經過PCR擴增后，采用D-Code突變檢測系統(Bio-Rad)對樣品進行DGGE分析。所用的聚丙烯酰胺凝膠濃度為8％，變性梯度為40％-60％，80V恒溫60℃，1×TAE中電泳16h，銀染后掃描，采用Quantity One(Bio-Rad)分析結果。

③不同提取工藝酒糟堆肥提取液細菌群落功能多樣性指數

準確稱取10mL堆肥提取液樣品，加入到加入90mL無菌生理鹽水(0.85％NaCl)中稀釋，在搖床里振搖30min，靜止沉淀3～5min，然后進行100倍稀釋，以每孔150μL稀釋液加入微孔板中，將制備好的菌懸液倒入無菌移液槽中，使用八孔移液器將其接種于Ecoplate的96孔中，放入Biolog Omnilog儀中28℃恒溫培養，每15min自動測定波長為590nm和750nm的顏色與濁度。

計算土壤微生物群落功能多樣性指數分別由Shannon多樣性指數(H)、Simpson優勢度指數(D)—和McIntosh均勻度指數(U)來表示。

H＝-∑PilnPi；

其中Pi為第i孔相對吸光度值與整個平板相對吸光度值總和的比率；

其中，ni為第i孔的相對吸光值，N為相對吸光度值總和。

5、數據處理

可浸提主要成分提取率(％)＝(堆肥浸提液中全氮含量×全氮所占權重+全磷含量×全磷所占權重+全鉀含量×全鉀所占權重)/(試驗所用堆肥中全氮含量×全氮所占權重+全磷含量×全磷所占權重+全鉀含量×全鉀所占權重)×100。

某一成分所占權重＝堆肥浸提液中某一成分的量/全部成分的量。

試驗數據用采用Microsoft Excel 2003處理，顯著性分析采用SPSS Base Ver.13.0統計軟件(SPSS,IL,Chicago,USA)進行Duncan多重比較(P≤0.05)。

6、結果與分析

6.1不同提取比例及通氣條件對酒糟堆肥提取液的養分含量的影響

從圖1可以看出，不同提取比例和通氣條件都能在一定程度上影響酒糟堆肥提取液中的主要養分含量。對于浸提液全氮量而言，不管好氣條件和厭氧條件下1:4處理的全氮含量與1:8處理之間無明顯差異但顯著高于1:10處理，比1:10處理增加39.2％(好氣條件)和40.8％(厭氧條件)。對于浸提液全磷量而言，在好氣條件下，不論提取比例如何，好氣提取酒糟堆肥提取液中的有機質和全磷含量均高于厭氣提取酒糟堆肥提取液中的有機質和全磷含量。而好氣提取酒糟堆肥提取液和厭氣提取酒糟堆肥提取液中的全氮和全鉀含量相當。對于不同提取比例而言，堆肥與水的比例為1：8和1：5處理的酒糟堆肥提取液中主要養分含量相對較高(圖2)。

6.2好氧條件下不同浸提時間對酒糟堆肥提取液的養分含量的影響

在好氣條件下，酒糟堆肥提取液中有機質、全氮、全磷和全鉀含量均隨著提取時間的延長而逐漸增加，最后趨于穩定(表1)。從表中可以看出，提取36h-84h的酒糟堆肥提取液中有機質、全氮、全磷和全鉀含量均沒有顯著差異。提取36h的酒糟堆肥提取液中有機質、全氮、全磷、全鉀含量比提取12h和24h的酒糟堆肥提取液中有機質和全氮含量分別增加了30.5％和5.8％、32.2％和13.7％、25.7％和11.8％、19.0％和8.0％。

表1不同時間對好氣提取酒糟堆肥提取液中主要養分含量的影響

注：每列數值后標不同字母表示在5％水平差異顯著(鄧肯檢驗)。

6.3不同提取工藝酒糟堆肥提取液可培養微生物區系分析

表2為不同提取工藝酒糟堆肥提取液可培養微生物區系，從表3可以看出，DEC中可培養細菌數量分別比AFEC和NAFEC增加了163.6％和217.8％，而DEC和NAFEC中可培養放線菌數量分別比AFEC提高了256.1％和166.4％，DEC

注：每列數值后標不同字母表示在5％水平差異顯著(鄧肯檢驗)。

6.4不同提取工藝酒糟堆肥提取液細菌群落結構多樣性分析

圖3為不同提取工藝酒糟堆肥提取液中細菌16S rDNA V3片段PCR產物的DGGE圖譜，從該圖中可看出，與DEC中的細菌DGGE條帶數相比，AFEC和NAFEC細菌DGGE條帶數明顯減少，但是AFEC細菌DGGE條帶數又多于NAFEC細菌DGGE條帶數。DGGE條帶圖案相似性系統樹由Quantity One軟件根據戴斯系數按照Neighbor Joining計算繪出，戴斯系數的范圍從0(沒有共同條帶)到1(所有條帶相同)。用戴斯系數計算出的各泳道樣品相似性矩陣，用它可以對DGGE圖譜中各泳道樣品間的相似性進行比較。鄰接法分析(Neighbor Joining)表明(圖4)，三種酒糟堆肥提取液樣品的細菌分為兩大族群，DEC為一個族群，AFEC和NAFEC為另一個族群，且AFEC和NAFEC族群的相似度達到0.51。

6.5不同提取工藝酒糟堆肥提取液細菌群落功能多樣性分析

表3表示不同提取工藝酒糟堆肥提取液細菌DGGE群落結構多樣性分析結果。從表中可以看出，AFEC和NAFEC細菌豐度指數分別比DEC減少了15.0％和45.0％，而NAFEC細菌豐度指數比AFEC減少了35.3％。三種酒糟堆肥提取液細菌多樣性指數的變化趨勢同細菌豐度指數的變化趨勢，DEC細菌多樣性指數分別比AFEC和NAFEC增加了7.9％和19.0％，而AFEC細菌多樣性指數比NAFEC增加了13.7％。然而，三種酒糟堆肥提取液細菌均度指數則沒有顯著差異。對于不同提取工藝酒糟堆肥提取液細菌穩定性指數，DEC和AFEC細菌穩定性指數比NAFEC分別增加了51.0％和54.2％，而DEC細菌穩定性指數與AFEC細菌穩定性指數相當。

表3不同提取工藝酒糟堆肥提取液細菌DGGE群落結構多樣性分析

以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發明的保護范圍。