本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種抗菌肽、其制備方法及應用。

背景技術：

抗菌肽是生物防御系統中所產生的對抗外源病原體的肽類物質，廣泛存在于動物、植物、微生物中，是機體先天性免疫系統的重要組成部分。迄今為止，已有數千種抗菌肽得到分離和鑒定。抗菌肽對細菌、真菌、寄生蟲、病毒、腫瘤細胞等有著廣泛的抑制作用。近年來，抗生素的濫用引發了一系列安全問題，如病原菌的耐藥性不斷增強，種類不斷增加，進而嚴重威脅人類健康。抗菌肽作為一種安全環保的抗生素替代品，在醫藥行業、飼料和食品添加劑等領域都具有廣泛的應用前景。

目前已報道的抗菌肽中，有幾種來自于唾液乳桿菌的抗菌肽類物質被證實具有高效廣譜的抑菌活性和良好的開發潛力，其中部分唾液乳桿菌天然存在于動物的消化道中。

現有技術中已報道的研究比較成熟的抗菌肽ABP-118，由唾液乳桿菌L.salivarius UCC118產生，由兩條多肽所組成，包括ABP-118α(4096Da)和ABP-118β(4332Da)，分別由abp118α和abp118β基因編碼，另外由abpIM基因所編碼的免疫蛋白可免疫該抗菌肽對產生菌自身的抑制作用。該機制普遍存在于可產生該抗菌肽的唾液乳桿菌中。組成該抗菌肽的兩種多肽均為小分子肽，具有較高的熱穩定性，且對很多革蘭氏陽性菌、陰性菌及真菌均具有較好的抑菌活性，因而具有較好的應用前景。有些該類抗菌肽的兩條多肽分開時不具有抑菌活性或活性較弱，只有在兩者混合在一起時才會有很好的抑菌效果。

為了進一步開發利用抗菌肽，找到更多的抗菌肽進行研究可以為后期的實際應用奠定基礎。

技術實現要素：

針對現有技術的不足及實際的需求，本發明提供一種抗菌肽、其制備方法及應用，所述抗菌肽，所述抗菌肽具有較強的抑制耐藥性金黃色葡萄球菌的活性。

為達此目的，本發明采用以下技術方案：

第一方面，本發明提供一種抗菌肽，所述抗菌肽包含如SEQ ID NO.1-2所示的氨基酸序列。

本發明中，所述抗菌肽命名為salivaricin SJH-8，簡稱SJH-8，包括SJH-8α和SJH-8β兩條肽鏈。

所述SEQ ID NO.1(SJH-8α)所示的氨基酸序列如下：Lys Arg Gly Pro Asn Cys Val Gly Asn Phe Leu Gly Gly Leu Phe Ala Gly Ala Ala Ala Gly Val Pro Leu Gly Pro Ala Gly Ile Val Gly Gly Ala Asn Leu Gly Met Val Gly Gly Ala Leu Thr Cys Leu；

所述SEQ ID NO.2(SJH-8β)所示的氨基酸序列如下：Lys Asn Gly Tyr Gly Gly Ser Gly Asn Arg Trp Val His Cys Gly Ala Gly Ile Val Gly Gly Ala Leu Ile Gly Ala Ile Gly Gly Pro Trp Ser Ala Val Ala Gly Gly Val Ser Gly Gly Phe Thr Ser Cys Arg。

優選地，所述抗菌肽包含如SEQ ID NO.3-4所示的核苷酸序列；

所述SEQ ID NO.3(SJH-8α)所示的核苷酸序列如下：AAACG TGGAC CTAAC TGTGT AGGTA ACTTC TTAGG TGGTC TATTT GCTGG AGCAG CTGCA GGAGT TCCAC TTGGA CCAGC TGGTA TCGTA GGTGG GGCAA ACTTA GGAAT GGTAG GCGGA GCGCT TACTT GTTTA TAA；

所述SEQ ID NO.4(SJH-8β)所示的核苷酸序列如下：AAAAA TGGTT ATGGT GGTAG TGGAA ATCGC TGGGT TCACT GTGGA GCTGG CATCG TAGGT GGAGC TTTAA TTGGA GCTAT CGGTG GACCC TGGTC AGCCG TAGCG GGTGG AGTTT CTGGT GGTTT TACAA GTTGC CGTTA A。

優選地，所述抗菌肽包含的氨基酸序列的分子量為α鏈(SEQ ID NO.1)：4074；β鏈(SEQ ID NO.2)：4297。

優選地，所述抗菌肽來自于三黃雞回腸菌群。

第二方面，本發明提供一種表達載體，所述表達載體含有至少一個拷貝的如第一方面所述的核苷酸序列。

第三方面，本發明提供一種重組的宿主細胞，所述宿主細胞含有如第二方面所述的表達載體。

優選地，所述宿主細胞為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或乳酸乳球菌中的任意一種，優選為乳酸乳球菌。

本發明中，所述宿主為大腸桿菌或枯草芽孢桿菌時，除抗菌肽自身(SJH-8α、SJH-8β)以外，應連同其攜帶的前導肽序列(SJH-8α的信號肽序列：MET MET Lys Glu Phe Thr Val Leu Thr Glu Cys Glu Leu Ala Lys Val Asp Gly Gly；SJH-8β的信號肽序列：MET Lys Asn Leu Asp Lys Arg Phe Thr Ile MET Thr Glu Asp Asn Leu Ala Ser Val Asn Gly Gly)和免疫蛋白SJH-8m一起轉入宿主中表達；而宿主選用乳酸乳球菌時，用其特有的usp45信號肽替代原前導肽，同時表達免疫蛋白SJH-8m。

第四方面，本發明提供一種如第一方面所述的抗菌肽的制備方法，包括如下步驟：

(1)提取三黃雞回腸菌群宏基因組；

(2)根據抗菌肽ABP-118設計引物，以提取的三黃雞回腸菌群宏基因組為模板進行擴增；

(3)將步驟(2)擴增出的片段的前導肽替換為宿主的分泌表達信號肽，再進行全合成整個片段，得到完整的分泌表達抗菌肽；

(4)構建分泌表達抗菌肽重組質粒，導入宿主細胞，得到表達抗菌肽的表達工程菌。

優選地，步驟(1)所述引物為SEQ ID NO.5-6所示的序列；

上游引物如SEQ ID NO.5所示，下游引物如SEQ ID NO.6所示：

上游引物(118αF)：5'-ATGATGAAGGAATTTACAGTATTGA-3'，(SEQ ID NO.5)；

下游引物(118imR)：5'-CTATAGCCACCACATAAAATTTAAC-3'，(SEQ ID NO.6)。

優選地，步驟(4)所述構建分泌表達抗菌肽重組質粒為將得到的分泌表達抗菌肽連接到pNZ8148質粒的BtgI和HindⅢ克隆位點。

第五方面，本發明提供一種如第一方面所述的抗菌肽、如第二方面所述的表達載體、如第三方面所述的宿主細胞在制備動物飼料中的應用。

第六方面，本發明提供一種如第一方面所述的抗菌肽、如第二方面所述的表達載體、如第三方面所述的宿主細胞在制備治療藥物中的應用。

本發明中，所述的藥物可以治療包括但不限于由金黃色葡萄球菌引起的感染。

與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：

(1)本發明制備的抗菌肽SJH-8，具有高效廣譜抑菌作用，具有較強的抑制耐藥菌的能力，尤其針對金黃色葡萄球菌有很好的抑制作用；

(2)本發明制備的抗菌肽SJH-8毒性低，可作為抗生素替代品使用；

(3)本發明制備的抗菌肽SJH-8為進一步開發利用抗菌肽奠定了基礎。

附圖說明

圖1是本發明抗菌肽相關基因的PCR產物；

圖2是本發明重組質粒構建示意圖；

圖3是本發明NZ9000重組子的平板單菌落圖；

圖4是本發明工程菌發酵液抑菌效果圖。

具體實施方式

為更進一步闡述本發明所采取的技術手段及其效果，以下結合附圖并通過具體實施方式來進一步說明本發明的技術方案，但本發明并非局限在實施例范圍內。

實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件，或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可通過正規渠道商購獲得的常規產品。

三黃雞購自廣州南沙菜市場；

乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.Cremoris)NZ9000、配套質粒pNZ8148(氯霉素抗性)購于上海北諾生物科技有限公司；

大腸桿菌MG1655為本實驗室保存；

引物由上海生工生物工程有限公司合成；

主要試劑購自上海生工生物工程有限公司；

質粒提取和DNA凝膠回收試劑盒購自天根公司；

酶制劑購自TaKaRa公司。

主要試劑的配制：

(1)乳酸乳球菌GM17培養基

大豆胨5.0g，蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，牛肉浸粉5.0g，抗壞血酸鈉0.5g，β-甘油磷酸鈉19.0g，硫酸鎂0.25g，加ddH2O至900ml，121℃高壓蒸汽滅菌15min。待滅菌冷卻后分別加入50ml用0.22μm濾膜過濾后的5％葡萄糖、5％乳糖溶液。配制固體培養基時加入瓊脂粉含量為2％。

(2)LB培養基

胰化蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl 10g，搖動容器直至溶質溶解，用5mol/L NaOH調pH至7.0，用去離子水定容至1L，在121℃、0.1Mpa下滅菌20min。配制固體培養基時加入瓊脂粉含量為2％。

(3)乳酸乳球菌感受態細胞培養用G-SGM17培養基

大豆胨5.0g，蛋白胨5.0g，酵母浸粉2.5g，牛肉浸粉5.0g，抗壞血酸鈉0.5g，β-甘油磷酸鈉19.0g，硫酸鎂0.25g，蔗糖171.1g，甘氨酸25g，加ddH2O至900ml，121℃高壓蒸汽滅菌20min。待滅菌冷卻后分別加入50ml用0.22um濾膜過濾后的5％葡萄糖、5％乳糖溶液。

(4)MRS培養基

蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖20.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸二胺2.0g、吐溫-80 1.0ml、磷酸氫二鉀0.4g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.29g、碳酸鈣20.0g、瓊脂15.0g，蒸餾水溶解并定容到1000ml，pH調至6.2–6.6，攪拌后加熱，煮沸2min，在121℃、0.1Mpa下滅菌20min。

(5)氯霉素溶液

稱取氯霉素溶解于無水乙醇中，0.22μm針頭過濾器過濾除菌，1.5ml離心管分裝，-20℃儲存備用。儲存濃度為35mg/ml，工作濃度為10μg/ml。

(6)大腸桿菌電轉孵化液用SOC培養基

配方如下：2％(W/V)胰蛋白胨，0.5％(W/V)酵母提取物，0.05％(W/V)氯化鈉，2.5mM氯化鉀，10mM氯化鎂，20mM葡萄糖溶液(0.22μm過濾器除菌，培養基滅菌后加入)。121℃高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后4℃儲存備用。

(7)50×TAE(Tris-乙酸)電泳緩沖液

Tris堿242g，EDTA 18.622g，加入800ml ddH2O，充分攪拌溶解后加入57.1ml醋酸，充分混勻，再加ddH2O定容至1L，室溫保存。使用前稀釋為1×TAE電泳緩沖液。

實施例1 提取三黃雞回腸的腸道菌群基因組

提取三黃雞回腸的腸道菌群基因組，包括如下步驟：

(1)將剪刀、鑷子用75％酒精消毒；

(2)取三黃雞腸道，剪碎，加入5mL PBS，轉移至15mL離心管，用振蕩器混勻；

(3)4000×g室溫離心10min；

(4)將上清轉移至2mL EP管，12000rpm離心5min，棄上清，加入200μL溶菌酶溶液(20mg/mL)，37℃放置1h；

(5)將溶菌酶處理過的樣品用Ezup柱式土壤DNA抽提試劑盒(生工Sangon Biotech)提取基因組。

實施例2 制備抗菌肽重組載體

(1)根據抗菌肽ABP-118基因序列設計引物：

上游引物(118αF)：5'-ATGATGAAGGAATTTACAGTATTGA-3'，(SEQ ID NO.5)；

下游引物(118imR)：5'-CTATAGCCACCACATAAAATTTAAC-3'，(SEQ ID NO.6)。

(2)PCR擴增：以實施例1提取的三黃雞回腸的腸道菌群基因組為模板進行PCR擴增，反應體系如下：

設置一組以水為樣本的陰性對照。

反應條件如下：

所獲得PCR產物核酸進行驗證，結果如圖1所示，可見條帶正確。

驗證后用天根公司的膠回收試劑盒進行切膠回收。

(3)全合成：

對PCR產物進行測序，并對原序列進行重新設計。

新序列包括α鏈、β鏈和免疫蛋白M。對α鏈和β鏈上的前導肽用乳酸乳球菌特有的分泌表達信號肽Usp45進行替換，并在序列5’端加上BtgI酶切位點，在3’端加上HindIII酶切位點。全長序列命名為SJH8αβM，如圖2所示，由上海生工生物工程有限公司合成；

(4)構建重組質粒：

酶切連接，構建重組質粒，反應體系如下：

37℃恒溫水浴鍋中反應3h，酶切產物經膠純化回收，將酶切后的載體與基因進行連接，反應體系如下：

輕輕混勻組分，置于16℃水浴鍋反應2h，得到重組載體pNZ8148-SJH8αβM。

實施例3 構建抗菌肽宿主細胞

(1)將實施例2制備的重組載體轉化MG1655感受態細胞，挑選陽性克隆進行測序驗證，涂氯霉素抗性LB平板，挑選陽性克隆；

大腸桿菌MG1655感受態細胞的制備：

①50μL菌液接種到5mL LB培養液中，37℃，200-250rpm過夜培養；

②5mL培養基稀釋到800ml LB培養液中，37℃，200-250rpm培養，直到OD₆₀₀到0.4-0.6；

③菌液在冰上預冷30min；

④5000×g，4℃離心15min，棄上清；

⑤用滅菌的冰水重懸細胞，先用移液器重懸浮細胞于少量體積中(幾毫升)，然后加水注滿離心管，5000×g，4℃離心15min，棄上清；

⑥重復上述步驟一次；

⑦用滅菌的冰冷的10％甘油重懸細胞，先用移液器重懸浮細胞于少量體積中(幾毫升)，然后加10％甘油注滿離心管，5000×g，4℃離心15min，棄上清；

⑧用滅菌的冰冷的10％甘油重懸細胞至終體積為2-3mL；

⑨分裝100μL一管于1.5mL離心管里，-80℃保存，待用于轉化。

(2)將重組質粒轉化NZ9000感受態細胞，挑選陽性克隆；

乳酸乳球菌乳脂亞種NZ9000感受態細胞的制備：

Solution I的配制：蔗糖171.1g，甘油100ml，加ddH2O至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

Solution II的配制：蔗糖171.1g，甘油100ml，EDTA 18.612g，加ddH2O至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

Solution III的配制：G-M17培養液+20mM MgCl2+2mM CaCl2。

①50μL NZ9000菌液接種到5mL G-SGM17培養液中(擰緊15mL離心管管口)，30℃過夜培養；

②5mL菌液稀釋到50mL G-SGM17培養液中(用封口膜封住錐形瓶瓶口)，30℃過夜培養；

③50mL菌液稀釋到400mL G-SGM17培養液中(用封口膜封住錐形瓶瓶口)，30℃培養，直到OD₆₀₀在0.2-0.3之間(約3h)；

④6000×g，4℃離心20min,棄去上清；

⑤用400mL Solution I(4℃)洗滌細胞，6000×g離心，棄去上清；

⑥用200mL Solution II(4℃)重懸細胞，冰浴15min，6000×g離心，棄去上清；

⑦用100mL Solution I(4℃)洗滌細胞，6000×g離心，棄去上清；

⑧用4mL Solution I(4℃)重懸細胞；

⑨分裝40μL一管到1.5mL離心管中，-80℃保存，使用前在冰上解凍。

(3)抗菌肽的表達

(1)將構建好的重組質粒pNZ8148-SJH8αβM轉化乳酸乳球菌乳脂亞種NZ9000感受態細胞，在GM17平板上培養；

(2)挑取轉化子到5mL GM17液體培養基(含氯霉素10μg/mL)中，30℃過夜培養；

(3)取0.8mL菌液到10mL新鮮GM17培養液(含氯霉素10μg/mL)中，至OD₆₀₀達0.4左右；

(4)加入終濃度為10ng/mL的Nisin誘導，12h后檢測抗菌肽活性。

實施例4 構建抗菌肽宿主細胞

(1)所述重組質粒也可以通過電轉化到大腸桿菌MG1655感受態細胞，其大腸桿菌MG1655感受態細胞的制備方法如下：

①從-80℃冰箱取出MG1655感受態細胞100μL，放在冰上解凍5min；待感受態細胞解凍后，與10μL連接產物混合加入已預冷的電轉杯中，冰浴5min；

②在電擊儀上調好電轉條件：2kV，將電轉杯放入電轉槽，按下電擊儀Pulse按鈕進行電轉化；

③電轉化后立即加入1mL SOC培養基(4℃)，冰浴5min；

④將電轉杯中菌液轉入1.5mL離心管，37℃、250rpm復蘇40min；

⑤離心管離心后倒掉上清，加入200μL含氯霉素抗性的LB培養液，吸取200μL培養液加到LB篩選平板(含氯霉素10μg/mL)，用玻璃涂布器把菌液涂布于整個平板的表面，37℃倒置過夜培養(12-16h)。

(2)所述重組質粒也可以通過電轉化到乳酸乳球菌乳脂亞種NZ9000感受態細胞，其乳酸乳球菌乳脂亞種NZ9000感受態細胞的制備方法如下：

Solution I的配制：蔗糖171.1g，甘油100ml，加ddH2O至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

Solution II的配制：蔗糖171.1g，甘油100ml，EDTA 18.612g，加ddH2O至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌15min。

Solution III的配制：G-M17培養液+20mM MgCl2+2mM CaCl2。

①從-80℃冰箱取出NZ9000感受態細胞40μL，放在冰上解凍5min；

②待感受態細胞解凍后，與10μL連接產物混合加入已預冷的電轉杯中，冰浴5min(陽性對照組：40μL感受態細胞+4μL空載pNZ8148)；

③在電擊儀上調好電轉條件：2kV，將電轉杯放入電轉槽，按下電擊儀Pulse按鈕進行電轉化；

④電轉化后立即加入1mL Solution III(4℃)，冰浴5min，然后在30℃孵育1.5h；

⑤離心管離心后倒掉上清，加入100μL含氯霉素抗性的GM17培養液，用移液器充分吸吹后吸取100μL培養液加到GM17篩選平板(含氯霉素10μg/mL)，用玻璃涂布器把菌液涂布于整個平板的表面，用封口膜將平板密封，30℃倒置過夜培養。

培養結果如圖3所示，30℃培養后出現的單菌落圖，從中篩選出陽性克隆。

(3)抗菌肽的表達

(1)將構建好的重組質粒pNZ8148-SJH8αβM轉化乳酸乳球菌乳脂亞種NZ9000感受態細胞，在GM17平板上培養；

(2)挑取轉化子到5mL GM17液體培養基(含氯霉素10μg/mL)中，30℃過夜培養；

(3)取0.8mL菌液到10mL新鮮GM17培養液(含氯霉素10μg/mL)中，至OD₆₀₀達0.4左右；

(4)加入終濃度為10ng/mL的Nisin誘導，12h后檢測抗菌肽活性。

實施例5 抗菌肽活性的檢測

(1)將兩種菌發酵液于4℃ 6000g離心15min，將獲得的上清液進行0.22μm過濾獲得誘導后的無菌上清液；

(2)以金黃色葡萄球菌為指示菌(～10⁶CFU/mL)，用濾紙片法做抑菌實驗，每個樣品點10μL，做四個重復。

(3)于37℃培養12h后，導入SJH8αβM基因的重組乳酸乳球菌乳脂亞種NZ9000(實驗組)上清液樣品可見明顯的抑菌圈，結果如圖4所示。

申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細方法，但本發明并不局限于上述詳細方法，即不意味著本發明必須依賴上述詳細方法才能實施。所屬技術領域的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明產品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護范圍和公開范圍之內。