本發(fā)明涉及一種酶法制備硫酸軟骨素的方法，屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate，CS)是由葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺以β1→3、β1→4糖苷鍵交替形成、并伴隨N-乙酰半乳糖胺一定程度硫酸化修飾的粘多糖。其中N-乙酰半乳糖胺4號位發(fā)生硫酸化修飾的軟骨素稱為硫酸軟骨素A(chondroitin sulfate A,CSA)，6號位發(fā)生硫酸化修飾的軟骨素稱為硫酸軟骨素C(chondroitin sulfate C,CSC)。CSA和CSC廣泛存在于細胞表面和胞外基質(zhì)中，對維持神經(jīng)干細胞穩(wěn)定、神經(jīng)元遷移、神經(jīng)突起延長、樹突再生等方面作用明顯，廣泛用于治療骨關(guān)節(jié)炎等疾病。此外，CS口服液常用于治療心臟疾病及乳腺癌、AIDS等。

目前臨床上使用的CS從動物軟骨組織中提取，但動物來源CS的硫酸化程度及硫酸化類型差異較大。此外，動物軟骨組織中含有一定量的硫酸角質(zhì)素，而硫酸角質(zhì)素和CS在理化性質(zhì)方面較為相近，故在工業(yè)化大規(guī)模CS提取過程中，會參雜一定量的硫酸角質(zhì)素，而降低臨床藥效。且感染過瘋牛病的動物軟骨組織來源的CS易導(dǎo)致患者感染瘋牛病(SubhashDhawan,FDA,2016)。

基于上述動物來源CS的限制，人們提出了酶法合成CS，此方法具有能得到專一性具有生物學(xué)活性的CS的優(yōu)點。軟骨素4-硫酸轉(zhuǎn)移酶C4ST催化軟骨素N-乙酰基葡萄糖胺4號位羥基硫酸化形成CSA，軟骨素6-硫酸轉(zhuǎn)移酶C6ST催化軟骨素N-乙酰基葡萄糖胺6號位羥基硫酸化形成CSC。目前C4ST和C6ST主要從動物細胞中提取，但動物細胞培養(yǎng)復(fù)雜，成本高昂，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種制備具有生物學(xué)活性的硫酸軟骨素的方法，是以含軟骨素為底物，經(jīng)PAPS再生系統(tǒng)和軟骨素4-硫酸轉(zhuǎn)移酶(C4ST)硫酸化修飾形成不含其他糖胺聚糖的CSA；或者經(jīng)PAPS再生系統(tǒng)和軟骨素6-硫酸轉(zhuǎn)移酶(C6ST)硫酸化修飾形成不含其他糖胺聚糖的CSC。

所述方法中，編碼所述C4ST、C6ST的基因來源于動物，在微生物中異源表達得到。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述C4ST是將NCBI中Gene ID：58250的基因以pET系列載體為表達載體，在大腸桿菌中表達得到的；或者以pPIC系列載體為表達載體在畢赤酵母中表達得到。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述C6ST是將NCBI中Gene ID：53374的基因以pET系列載體為表達載體，在大腸桿菌中表達得到的；或者以pPIC系列載體為表達載體在畢赤酵母中表達得到。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述PAPS再生系統(tǒng)，是在1-200mM的pH 5-9的Tris-HCl溶液中，添加0.1-50mM PNPS、1-200μM PAP、0.1-100μgASST IV。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述酰基硫酸轉(zhuǎn)移酶(aryl sulfotransferase,ASST IV)是將NCBI中Gene ID：83783的基因以pET系列載體為表達載體，在大腸桿菌進行表達得到的。

在本發(fā)明的一種實施方式中，制備硫酸軟骨素時，向PAPS再生系統(tǒng)中添加0.1-100μgC4ST或C6ST。

在本發(fā)明的一種實施方式中，ASST IV的酶活為0.1-100nmol/min·mg·蛋白，C4ST的酶活為0.1-100pmol/min·mg·蛋白，C6ST的酶活為0.1-100pmol/min·mg·蛋白。

在本發(fā)明的一種實施方式中，制備硫酸軟骨素時，酶催化反應(yīng)溫度為10-50℃。

在本發(fā)明的一種實施方式中，制備硫酸軟骨素時，酶催化反應(yīng)溫度為25-50℃。

在本發(fā)明的一種實施方式中，制備硫酸軟骨素時，酶促反應(yīng)時間為1-50h。

在本發(fā)明的一種實施方式中，制備硫酸軟骨素時，酶促反應(yīng)時間為20-50h。

本發(fā)明首次采用微生物細胞表達動物來源的C4ST和C6ST，得到具有生物學(xué)活性的酶，整合軟骨素及ASST，得到具有生物學(xué)活性的硫酸軟骨素CSA及CSC，且轉(zhuǎn)化率達到10-30％，具有巨大的工業(yè)應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1重組表達ASST IV的SDS-PAGE圖，其中M：Marker；1：以pET系列載體構(gòu)建的重組菌株的胞內(nèi)全細胞SDS-PAGE圖譜；2：以pUC系列載體構(gòu)建的重組菌株的胞內(nèi)全細胞SDS-PAGE圖譜；3：以pET系列載體構(gòu)建的重組菌株的胞內(nèi)全細胞SDS-PAGE圖譜；4：以pUC系列載體構(gòu)建的重組菌株的胞內(nèi)全細胞SDS-PAGE圖譜。

圖2重組表達C4ST、C6ST的SDS-PAGE圖，其中M：Marker；1：以pPET系列載體構(gòu)建的表達C4ST的重組菌株的胞外上清SDS-PAGE圖譜；2：以pUC系列載體構(gòu)建的表達C4ST的重組菌株的胞外上清SDS-PAGE圖譜；3：以pPET系列載體構(gòu)建的表達C6ST的重組菌株的胞外上清SDS-PAGE圖譜；4：以pUC系列載體構(gòu)建的表達C6ST的重組菌株的胞外上清SDS-PAGE圖譜。

圖3重組表達C4ST、C6ST的Western blot圖譜，其中M：Marker；1：以pPIC系列載體構(gòu)建的表達C4ST的重組菌株的胞外上清Western blot圖譜；2：以pGAPZ系列載體構(gòu)建的表達C4ST的重組菌株的胞外上清Western blot圖譜；3：以pPIC系列載體構(gòu)建的表達C6ST的重組菌株的胞外上清Western blot圖譜；4：以pGAPZ系列載體構(gòu)建的表達C6ST的重組菌株的胞外上清Westernblot圖譜。

圖4 C4ST及C6ST酶活，其中，兩種酶催化反應(yīng)都基于兩種底物動物來源硫酸軟骨素及微生物來源軟骨素，C4ST(□)，C6ST(■)。

圖5硫酸軟骨素A、C二糖單位質(zhì)譜圖，其中，(a)C4ST催化產(chǎn)物二糖單位質(zhì)譜圖；(b)軟骨素二糖單位質(zhì)譜圖；(c)C6ST催化產(chǎn)物二糖單位質(zhì)譜圖。

具體實施方式

ASST IV：酰基硫酸轉(zhuǎn)移酶IV，編碼該酶的基因序列參見NCBI中Gene ID：83783。

C4ST：軟骨素4-硫酸轉(zhuǎn)移酶，編碼該酶的基因序列參見NCBI中Gene ID：58250。

C6ST：軟骨素6-硫酸轉(zhuǎn)移酶，編碼該酶的基因序列參見NCBI中Gene ID：53374。

CS：硫酸軟骨素

PNPS：對硝基苯磺酸

PNP：對硝基苯酚

PAP：3’5’-二磷酸腺苷

C4ST、C6ST的酶活測定方法：以軟骨素為原料，構(gòu)建催化反應(yīng)體系，包括20mM Tris-HCl(pH7.0)，3mM PNPS，20μM PAP，10mgASST IV，5mg/mL軟骨素及20μg C4ST或C6ST，37℃，反應(yīng)20h后100℃加熱5min終止反應(yīng)后在400nm波長下測定吸光值。

產(chǎn)物得率的計算公式：Y＝10^-3*(18.83*(A_C-A_ASSTIV)+0.38)；其中，A_C為C4ST或C6ST酶活測定時的吸光值；A_ASSTIV為對照吸光值。

實施例1 PAPS再生系統(tǒng)

PAPS再生系統(tǒng)組分濃度為：PNPS的濃度為3mM，PAP的濃度為20μM，ASST IV 10mg，以1-200mM的pH 5-9的Tris-HCl為基底液。加入C4ST或C6ST作為軟骨素硫酸化的硫酸基供體。

實施例2工具酶ASST IV、C4ST、C6ST的制備

(1)重組大腸桿菌的搖瓶表達

以誘導(dǎo)性載體pET系列載體pET26b為載體，分別構(gòu)建pET26b-ASSTIV、pET26b-C4ST、pET26b-C6ST，轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到轉(zhuǎn)化子。以pUC系列載體分別構(gòu)建攜帶編碼ASST IV、C4ST、C6ST的基因的重組表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌得到轉(zhuǎn)化子，作為對照。

挑取以pET系列載體構(gòu)建的重組菌株單菌落于3mL LB培養(yǎng)基(加入終濃度為50μg/mL的氨芐青霉素)中，37℃，200rpm培養(yǎng)過夜。按1％(V/V)的比例轉(zhuǎn)接50mLTB培養(yǎng)基(加入終濃度為50μg/mL的氨芐青霉素)，37℃，200rpm培養(yǎng)2h至OD_600nm大約在0.6-0.8，加入終濃度為0.1mM的IPTG，誘導(dǎo)48h。將上述培養(yǎng)物于8000rpm，4℃離心5min收集菌體，用預(yù)冷的Tris-HCl(pH 7.0)清洗、重懸菌體至50mL，冰浴超聲，條件為：400W，工作2s，間歇3s，200個循環(huán)至菌液澄清，14000rpm，4℃離心20min，收集上清，即為粗酶液(圖1、圖2)。

從圖1可以看出，以pET26b載體構(gòu)建的重組菌株的胞內(nèi)全細胞有明顯的ASST IV條帶。從圖2可以看出，以pET26b載體構(gòu)建的表達C4ST、C6ST的重組菌株的胞外上清中出現(xiàn)了相應(yīng)目的條帶，而以pUC系列載體構(gòu)建的重組菌則未能成功表達兩酶。

(2)重組畢赤酵母的搖瓶表達

以誘導(dǎo)性啟動子pPIC系列載體構(gòu)建pPIC3.5-C4ST、pPIC3.5-C6ST轉(zhuǎn)化畢赤酵母得到轉(zhuǎn)化子；以pGap系列載體構(gòu)建重組表達載體后轉(zhuǎn)化畢赤酵母得到轉(zhuǎn)化子，作為對照。挑取以pPIC系列載體構(gòu)建重組菌株單菌落于3mLYPD培養(yǎng)基中，30℃，200rpm培養(yǎng)過夜。按1％(V/V)的比例轉(zhuǎn)接50mLBMMY培養(yǎng)基(加入終濃度為0.5g/L的甲醇)中，20℃，200rpm誘導(dǎo)5d。將上述培養(yǎng)物于8000rpm，4℃離心5min收集上清，即為粗酶液(圖3)。

從圖3可以看出，以pPIC系列載體構(gòu)建的重組菌株實現(xiàn)了酶的分泌表達，而以pGap系列載體構(gòu)建的重組菌則未能實現(xiàn)表達。

(3)ASST-IV、C4ST、C6ST工具酶的純化

用BufferA(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，20mM咪唑，pH 7.4)平衡Ni-NTAAgarose FastFlow柱子后，將粗酶液透過0.22μm濾膜后，上清液以3mL/min的速度通過Ni-NTAAgaroseFast Flow柱子，結(jié)合10min后，Buffer B(20mM Tris-HCl，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH7.4)洗脫收集酶活性部分，濃縮，冷凍干燥，測算酶活(圖4)。

實施例3 CSA的制備

以發(fā)酵得到的軟骨素為原料，構(gòu)建催化反應(yīng)體系，包括20mM Tris-HCl(pH7.0)，3mMPNPS，20μM PAP，10mgASST IV(酶活單位0.1-100nmol/min·mg·protein)，5mg/mL軟骨素及20μg C4ST(酶活單位0.1-100pmol/min·mg·protein)，37℃，反應(yīng)20h后100℃加熱5min終止反應(yīng)。

實施例4 CSC的制備

以發(fā)酵得到的軟骨素為原料，反應(yīng)液包括20mM Tris-HCl(pH7.0)，3mM PNPS，20μMPAP，10mgASST IV，5mg/mL軟骨素及20μg C6ST(酶活單位0.1-100pmol/min·mg·protein)，37℃，反應(yīng)20h后100℃加熱5min終止反應(yīng)。

實施例5 CSA、CSC的檢測

以CSA、CSC的制備液為底物，加入軟骨素酶，37℃，反應(yīng)5-20h后100℃加熱5min終止反應(yīng)，透過0.22μm的濾膜后進行LC-MS檢測。LC的檢測條件如下：流動相A(8mM乙酸)，流動相B(8mM乙酸，70％甲醇/水溶液)，柱子：C18Reverse phase column，0.3mm*250mm，洗脫條件見表1。MS的條件如下：霧化載氣速度0.75L/min，霧化溫度140℃，干燥載氣N₂速度1.2L/min，陰離子模式掃描M/Z范圍40-2000，得到特征峰M/Z 397、458(圖5)。

表1

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準。