本發明涉及一種利用直鏈麥芽低聚糖生成酶制備直鏈麥芽六糖的方法，屬于功能糖生產技術領域。

背景技術：

直鏈麥芽低聚糖通常是指由3-10個α-D-吡喃葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵組成的功能性低聚糖。其具有良好的加工適應性和獨特的生理功效，在食品、醫藥、紡織、造紙等多種領域的應用越來越廣泛。直鏈麥芽低聚糖的甜度較低，可作為口感柔和的甜度劑；其持水力強而吸濕性小，可調節烘焙、膨化食品中的水分調節劑；其黏度為蔗糖的2-5倍，可提高冰淇淋的膨脹率或作為某些流質食品的增稠劑；能有效地抑制晶體結晶，抑制巧克力“返砂”；此外，直鏈麥芽低聚糖還能改善冷飲的抗融性能、延緩速凍食品的蛋白質變性和淀粉老化進程。

值得注意的是，直鏈麥芽低聚糖還具有獨特的生理功能，它們可以不經胃的消化直接進入小腸，被小腸上皮細胞的α-葡萄糖苷酶水解，而進入血液后能迅速合成糖原，加速肝糖原和肌糖原的恢復，所以引起的胰島素反應和血糖反應比葡萄糖平穩，能長時間地為人體提供能量，同時也能防止運動時大量乳酸的形成，因此對于運動員和一些胰臟切除病人、腎病患者來說是一種理想的能量補充來源。直鏈麥芽低聚糖還具其它生理特點：(1)可以促使人體更好地吸收Ca²⁺，有效預防中老年人骨質疏松；(2)不易被細菌發酵利用，有利于預防齲齒；(3)能選擇性抑制腸道腐敗菌的生長地而促進益生菌增殖，從而維護腸道內環境的健康。(4)提供信號促進雙糖酶的成熟和轉運為有利于其后續的消化，同時誘導小腸上皮細胞分化。

現有技術中報道的生產直鏈麥芽六糖的方法通常需要直鏈麥芽低聚糖生酶與脫支酶進行協同作用，并添加鈣離子，才能獲得60％以上的轉化率。且目前國內外對直鏈麥芽低聚糖生產六糖的研究停留在實驗室水平，其使用的底物濃度較低，一般為0.5％～5％，無法直接擴大并應用于工業化生產。工業上酶法工藝生產直鏈麥芽低聚糖，是通過直鏈麥芽低聚糖生成酶從淀粉非還原末端切下多個葡萄糖單元而成。在日本、美國等發達國家已開始批量生產直鏈麥芽低聚糖，而國內尚未有直鏈麥芽低聚糖的生產。隨著直鏈麥芽低聚糖在各個領域中的應用前景越來越廣泛，在國內開發具有工業應用價值的直鏈麥芽低聚糖勢在必行。

技術實現要素：

本發明的第一個目的是提供一種制備直鏈麥芽六糖的方法，所述方法是以2～10U/g底物的添加量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶，水解淀粉或麥芽糊精生成含直鏈麥芽六糖的低聚糖漿。

在本發明的一種實施方式中，所述直鏈麥芽低聚糖生成酶的GenBank登錄號為AIV43245.1。

在本發明的一種實施方式中，所述直鏈麥芽低聚糖生成酶由表達GenBank中的編號為AIV43245.1的酶的基因工程菌發酵獲得。

在本發明的一種實施方式中，所述基因工程菌包括以Bacillus subtilis WB 600為宿主，以pST為載體，表達GenBank登錄號為AIV43245.1的酶。

在本發明的一種實施方式中，所述淀粉包括玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、蠟質玉米淀粉、木薯淀粉。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是以所述直鏈麥芽低聚糖生成酶為催化劑，以pH6.5～7.5的淀粉溶液或麥芽糊精溶液為底物，按2～10U/g底物的加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶，在60～80℃下反應24～72小時。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是以2U/g底物的加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶，在pH 7.0～7.5，60～80℃下反應24～72小時。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是以5U/g底物的加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶，在pH 7.0～7.5，60℃下反應24～72小時。

在本發明的一種實施方式中，所述方法是以10U/g底物的加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶，在pH 7.0～7.5，60℃下反應24～48小時。

本發明的第二個目的是提供一種含30％以上麥芽六糖的低聚糖漿，是由所述方法制備獲得的。

本發明還提供所述方法在制備含低聚糖的產品中的應用。

在本發明的一種實施方式中，所述應用包括制備含所述低聚糖的飲品、保健品。

本發明的有益效果在于：

1)本發明所用的直鏈麥芽低聚糖生成酶由食品級枯草芽孢桿菌表達，安全性好。該酶比酶活高，熱穩定性好，可以水解麥芽糊精生成麥芽六糖含量達到30％以上的直鏈麥芽低聚糖漿，且即使延長反應時間葡萄糖的含量也很低。可用于生產功能性飲料及流質食品或生產高純度的直鏈麥芽六糖，避免了直鏈麥芽低聚糖漿中葡萄糖對生產加工的影響，有利于直鏈麥芽低聚糖漿的深加工，從而更具有市場競爭力；

2)本發明所提供的生產直鏈麥芽六糖糖漿的方法，和其他生產淀粉糖的方法相比，不需要在生產過程中調節溫度和pH、不需要普魯蘭酶、異淀粉酶等其他協同酶制劑，因此工藝更為簡單、便捷，生產成本更低廉。

3)本發明的直鏈麥芽低聚糖生成酶對底物的轉化率和產物純度較高，分別達到75％和30％以上，可以有效降低高純度直鏈麥芽低聚糖漿的生產加工成本，更具有工業應用價值。

附圖說明

圖1為采用實施例1的方法制備的糖漿產品的HPAEC-PAD曲線(稀釋1000倍)；G1～G7分別代表葡萄糖、麥芽糖、直鏈麥芽三糖、直鏈麥芽四糖、直鏈麥芽五糖、直鏈麥芽六糖、直鏈麥芽七糖；

圖2為采用實施例1的方法制備的糖漿產品中樣品組分及相對含量；G1～G7分別代表葡萄糖、麥芽糖、直鏈麥芽三糖、直鏈麥芽四糖、直鏈麥芽五糖、直鏈麥芽六糖、直鏈麥芽七糖；

圖3為采用實施例2的方法制備的糖漿產品中樣品組分及相對含量；G1～G7分別代表葡萄糖、麥芽糖、直鏈麥芽三糖、直鏈麥芽四糖、直鏈麥芽五糖、直鏈麥芽六糖、直鏈麥芽七糖。

具體實施方式

實施例1

配制10％的麥芽糊精(DE＝4)溶液為底物，調節pH 7.0，按2U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的編號為AIV43245.1)，在60℃下反應72h，反應結束后沸水浴滅酶，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)測定樣品的譜圖如圖1所示。樣品中各組分相對含量如圖2所示，此時糖漿中主產物直鏈麥芽六糖含量為32.3％，底物轉化率達75.5％，而葡萄糖含量極低，無DP值大于等于8的直鏈低聚糖檢出，說明反應體系中未被轉化的底物可能以大分子的形式存在，分離較容易。

實施例2

配制30％的麥芽糊精(DE＝4)溶液為底物，調節pH 7.0，按2U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的編號為AIV43245.1)，在80℃下反應48h，反應結束后沸水浴滅酶，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)測定樣品的組分與含量結果如圖3所示，此時糖漿中主產物直鏈麥芽六糖含量為32.8％，底物轉化率達76.2％。

實施例3

配制10％的馬鈴薯淀粉溶液為底物，調節pH 7.5，按2U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的編號為AIV43245.1)，在60℃下反應72h，反應結束后沸水浴滅酶，糖漿中主產物麥芽六糖含量為31.5％，底物轉化率達76.8％。

實施例4

采用實施例3的方法，將馬鈴薯淀粉替換為玉米淀粉、蠟質玉米淀粉或木薯淀粉，主產物直鏈麥芽六糖含量均在30％以上，底物轉化率均在75％以上。

實施例5

配制10％的蠟質玉米淀粉溶液為底物，調節pH 7.0，按5U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的編號為AIV43245.1)，分別在60℃下反應24，48h，72h，反應結束后沸水浴滅酶，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)測定樣品的組分與含量結果如表1所示，此時糖漿中主產物直鏈麥芽六糖含量為35.0％～37.7％，底物轉化率達75.％以上。

表1不同反應時間對糖漿產品中樣品組分及相對含量的影響。

實施例6

配制10％的麥芽糊精(DE＝4)溶液為底物，調節pH 7.0，分別按2U/g、5U/g、10U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的編號為AIV43245.1)，在60℃下反應48h，反應結束后沸水浴滅酶，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)測定樣品的組分與含量結果如表2所示，此時糖漿中主產物麥芽六糖含量為30.02～33.9％，底物轉化率達75％以上。

表2不同加酶量對糖漿產品中樣品組分及相對含量的影響

實施例7

配制30％的麥芽糊精(DE＝4)溶液為底物，調節pH 6.5，按5U/g加酶量加入直鏈麥芽低聚糖生成酶(氨基酸序列在GenBank中的編號為AIV43245.1)，分別在60～80℃下反應24h，反應結束后沸水浴滅酶，采用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)測定樣品的組分與含量結果如表3所示，此時糖漿中主產物直鏈麥芽六糖含量為31.67～35.15％，底物轉化率達75％以上。

表3不同反應溫度對糖漿產品中樣品組分及相對含量的影響。

實施例8

按實施例1的方法制備糖漿，區別在于分別采用GenBank中的編號為AAS99099.1、CAA39096.1和CAL64397.1的酶進行酶解反應，對反應結束后的糖漿中低聚糖產品的組分和含量進行測定，結果顯示，采用GenBank中編號為AAS99099.1的直鏈麥芽六糖生成酶，底物轉化率為51.24％，主產物直鏈麥芽六糖的比例為31.72％；采用GenBank中編號為CAA39096.1的直鏈麥芽六糖生成酶，底物轉化率為57.12％，主產物直鏈麥芽六糖的比例為26.74％；采用GenBank中編號為CAL64397.1的直鏈麥芽低聚糖生成酶，底物轉化率為60.34％，主產物直鏈麥芽六糖的比例為30.14％。

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。