本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種胱天蛋白酶募集域蛋白6(caspase recruitment domain-containing protein 6,CARD6)作為靶基因在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中應(yīng)用。

背景技術(shù)：

脂肪肝包括酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病，兩者都是全球常見的慢性肝病。隨著生活方式的和飲食結(jié)構(gòu)的影響，非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病率逐年增加，已成為危害人類健康的三大肝病之一。非酒精性脂肪性肝是遺傳、環(huán)境、代謝應(yīng)激等多因素影響造成的疾病，而肥胖、高脂血癥、糖尿病、高胰島素血癥和收縮壓升高是其高危因素。

糖尿病是一種常見的有遺傳傾向的內(nèi)分泌代謝病。隨著人們生活方式的改變，尤其是高能量食品的攝入過多及體力活動減少，糖尿病的發(fā)病率大幅上升，已嚴重危害到人們身體的健康，其中以Ⅱ型糖尿病患者居多。Ⅱ型糖尿病約占糖尿病患者的90％，多發(fā)于40歲以上的成年人或老年人，是由于體內(nèi)胰島素分泌相對不足、靶細胞對胰島素敏感性降低，導(dǎo)致機體內(nèi)糖、脂肪、蛋白質(zhì)、水和電解質(zhì)的代謝紊亂型疾病。長期存在的高血糖，會導(dǎo)致多種并發(fā)癥的發(fā)生。對身體的各種組織產(chǎn)生損害，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)的慢性損害以及功能障礙。

糖尿病人群發(fā)生非酒精性脂肪肝的機制可能為糖尿病患者存在胰島素抵抗和胰島素絕對或相對不足，胰島素抑制脂肪酶活性下降，外周脂肪組織分解增多，游離脂肪酸增多，肝臟對游離脂肪酸氧化和利用不足，脂化形成甘油三酯增加，大量甘油三酯生成超過肝臟運轉(zhuǎn)的能力，在肝細胞內(nèi)聚集，引起肝細胞變性、腫大，形成脂肪肝。故糖尿病患者更易發(fā)生脂肪肝，早期干預(yù)尤為重要。非酒精性脂肪肝性肝病不僅可導(dǎo)致轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)異常、失代償期肝硬化、肝功能衰竭等嚴重肝病，也與心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、代謝綜合征的發(fā)生存在密切聯(lián)系，嚴重威脅著人們的健康。因此，非酒精性脂肪性肝合并Ⅱ型糖尿病的治療越來越受到重視。

胱天蛋白酶募集域蛋白6是CARDs家族的重要成員之一，目前已發(fā)現(xiàn)人類28個CARDs和小鼠21個CARDs相關(guān)蛋白，廣泛存在于哺乳動物的各個組織器官中[1]。人類CARD6基因定位于5號同源染色體上，且人類CARD6的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在絕大多數(shù)組織器官中表達，而小鼠的CARD6的mRNA高表達于脾臟、肝臟等組織中。此外，CARD6編碼的序列有1037個氨基酸殘基，其中包括有4個關(guān)鍵功能結(jié)構(gòu)域，N-末端包含的一個CARD結(jié)構(gòu)域，同時連接著一個富含谷氨酸的結(jié)構(gòu)域(GARR)和一個核心氨基酸結(jié)構(gòu)域，C-末端包含一個富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域(PRR)，且人類與小鼠在氨基酸序列上的一致性高達53.2％[2]。CARD6可與蛋白激酶RIP家族成員形成復(fù)合體，是NOD樣受體(NOD-like receptors,NLRs)及TLR樣受體(Toll-like receptors,TLRs)通路的重要媒介物，在機體先天性及后天性免疫反應(yīng)和炎癥應(yīng)答等各方面起重要調(diào)控作用[3-5]。

參考文獻：

[1].Inohara,N.,et al.,Nod1,an Apaf-1-like activator of caspase-9 and nuclear factor-kappaB.J Biol Chem,1999.274(21):p.14560-7.

[2].Werts,C.,S.E.Girardin and D.J.Philpott,TIR,CARD and PYRIN:three domains for an antimicrobial triad.Cell Death Differ,2006.13(5):p.798-815.

[3].Bouchier-Hayes,L.and S.J.Martin,CARD games in apoptosis and immunity.EMBO Rep,2002.3(7):p.616-21.

[4].Stehlik,C.,et al.,CARD6 is a modulator of NF-kappa B activation by Nod1-and Cardiak-mediated pathways.J Biol Chem,2003.278(34):p.31941-9.

[5].Dufner,A.,S.Pownall and T.W.Mak,Caspase recruitment domain protein 6 is a microtubule-interacting protein that positively modulates NF-kappaB activation.Proc Natl Acad Sci U S A,2006.103(4):p.988-93.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種CARD6基因的表達與脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之間的相互關(guān)系，提供一個用于治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的靶基因CARD6的新用途，進而把CARD6基因應(yīng)用于脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的治療。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

本發(fā)明以野生型C57小鼠、構(gòu)建條件性敲除的CARD6蛋白正常表達的CARD6 Flox小鼠與肝細胞特異性CARD6基因敲除(CARD6 KO)小鼠為實驗對象，通過高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究CARD6基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與CARD6 Flox小鼠對比，CARD6基因敲除小鼠表現(xiàn)出肥胖，其體重明顯高于同種飼料飼養(yǎng)的CARD6 Flox小鼠，空腹血糖水平高于對照組CARD6 Flox小鼠。進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗發(fā)現(xiàn)CARD6基因敲除小鼠對葡萄糖的耐受能力明顯減弱。從小鼠肝臟重量及肝臟/體重比以及脂質(zhì)成分病理染色結(jié)果等均說明HFD組(High fat diet，高脂飲食)的CARD6 KO小鼠脂肪肝病變明顯嚴重，脂質(zhì)蓄積顯著增加。這表明CARD6基因敲除會加劇脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，CARD6基因能夠改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生。

本發(fā)明人的研究證明了：在高脂誘導(dǎo)的脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型中，CARD6具有抑制肥胖，降低血糖，減少肝臟脂質(zhì)蓄積，保護肝功能，特別是改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的作用。

針對CARD6的上述功能，提供CARD6作為藥物靶標在篩選保護肝臟及維持糖代謝穩(wěn)態(tài)的藥物中的應(yīng)用。

針對CARD6的上述功能，提供CARD6作為藥物靶標在篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。

以上藥物是指能夠促進CARD6基因表達的藥物。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果：

(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)CARD6基因的新功能，即CARD6基因具有能夠保護脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病的作用。

(2)基于CARD6在保護脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。

附圖說明

圖1是肝細胞特異性CARD6基因敲除小鼠的構(gòu)建策略圖

圖2是CARD6 Flox和CARD6 KO小鼠的體重、空腹血糖結(jié)果圖；

A為小鼠體重結(jié)果圖，B為空腹血糖水平統(tǒng)計圖(*：p＜0.05 vs Flox NC組，#：p＜0.05 vs Flox HFD組)。

圖3是CARD6 Flox和CARD6 KO小鼠通過腹腔注射葡萄糖耐量結(jié)果圖；

A為通過腹腔注射葡萄糖后不同時間點小鼠血糖水平統(tǒng)計圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積(area under the curve，AUC)比較圖(*：p＜0.05 vs Flox NC組，#：p＜0.05 vs Flox HFD組)。

圖4是CARD6 Flox和CARD6 KO小鼠的肝臟重量結(jié)果圖；

A為肝臟重量統(tǒng)計柱狀圖，B為肝臟重量與小鼠本身體重比值統(tǒng)計柱狀圖(*：p＜0.05 vs Flox NC組，#：p＜0.05 vs Flox HFD組)。

圖5是CARD6 Flox和CARD6 KO小鼠的HE和油紅O染色圖。

具體實施方式

通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

實驗用動物及飼養(yǎng)：

實驗動物種屬，性別，周齡及來源：選用8-10周齡、體重在24g-27g，背景為雄性C57BL/6品系的野生型小鼠(WT，購自北京華阜康生物科技有限公司)、CARD6蛋白正常表達的CARD6 Flox小鼠(由武漢大學(xué)動物實驗中心李紅良老師實驗室構(gòu)建)以及肝細胞特異性CARD6基因敲除(CARD6 KO)小鼠(由CARD6 Flox小鼠與肝臟特異性Alb-Cre(購自The Jackson Laboratory，貨號003574)轉(zhuǎn)基因小鼠交配得到)為實驗對象。

肝細胞特異性CARD6基因敲除小鼠的構(gòu)建(構(gòu)建策略見圖1)：

根據(jù)CARD6基因信息，利用CRISPR Design(網(wǎng)址http://crispr.mit.edu/)分別在內(nèi)含子3和外顯子4的非編碼區(qū)中各設(shè)計一個CRISPR的打靶位點。靶序列分別為：

CARD6-sgRNA1：GgAGAGTAGGCAACATGACT TGG

CARD6-sgRNA 2：gGTGAAAGCAGTTATCAGTA GGG

此外還設(shè)計了一個用于同源修復(fù)的供體質(zhì)粒(Donor Vector)pBluescript SK(+)-2loxp，它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子4以及兩個同向的loxp序列。

①打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4 DNA連接酶連入經(jīng)過限制性內(nèi)切酶BsaI處理過的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個T7啟動子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實驗。

②供體載體(Donor Vector)的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計原則，設(shè)計如下引物(表1)用于擴增供體載體的左右同源臂以及中間的外顯子部分。擴增得到的產(chǎn)物連入經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切的條件性敲除骨架載體中，得到Donor Vector。

表1用于擴增供體載體的左右同源臂以及中間的外顯子部分的引物

③打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個部分(負責切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點的gRNA)分別進行轉(zhuǎn)錄。對于Cas9蛋白，將其表達載體(pST1374-Cas9)用PmeI進行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7 mMESSAGE mMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對于sgRNA，使用MEGAshortscript^TM Kit(AM1354，Ambion公司)進行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiagen，217084)進行純化。

④CARD6 Flox條件性敲除小鼠的制作

將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體質(zhì)粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進行培育。得到的小鼠進行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過PCR方法篩選陽性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機挑選一只作為F0代進行后續(xù)的繁殖，最終獲得CARD6 Flox純合小鼠。

⑤肝細胞特異性CARD6基因敲除小鼠的制作

將上述CARD6 Flox小鼠與肝臟特異性Alb-Cre(購自The Jackson Laboratory，貨號003574)轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到CARD6f^lox/flox/Alb-Cre小鼠，待該小鼠長至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導(dǎo)Cre酶的表達，Cre酶特異性的識別兩個同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個loxp，最后得到肝臟細胞特異性CARD6基因敲除小鼠。

實驗動物飼料配方：高脂飼料(HFD)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12942)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，總的熱量質(zhì)量比:5.24kcal/g。低脂飼料(NC)(購自北京華阜康生物科技有限公司，貨號D12450B)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，總的熱量質(zhì)量比:3.85kcal/g。

動物飼養(yǎng)及環(huán)境條件：所有的實驗小鼠均飼養(yǎng)在武漢大學(xué)SPF級動物房。每12小時交替照明，溫度24±2℃，濕度40％-70％，小鼠自由飲水進食。

【實施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型(diet induced obesity，DIO)獲得

(1)實驗動物分組：選用8周齡，雄性，CARD6 Flox小鼠和CARD6 KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即Flox NC組，KO NC組，F(xiàn)lox HFD組，KO HFD組共4個組別。

(2)模型通過高脂飼料誘導(dǎo)操作流程：

采用Flox與KO小鼠，建立DIO模型，進行表型相關(guān)分析，明確CARD6基因?qū)χ靖?、Ⅱ型糖尿病發(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，CARD6 Flox小鼠和CARD6 KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfat diet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即Flox NC組，KO NC組，F(xiàn)lox HFD組，KO HFD組共4個組別。小鼠空腹體重和空腹血糖每隔4周檢測1次。實驗第22周，進行腹腔注射葡萄糖實驗(IPGTT)，以評價小鼠機體對葡萄糖耐受能力。第24周終末取材，取出小鼠肝臟拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰凍切片包埋劑(Tissue Freezing Medium)包埋作為病理分析用。

【實施例2】小鼠體重、血糖水平測定

(1)小鼠空腹體重檢測

1)體重檢測。

①禁食：上午8:00將待實驗小鼠禁食(不禁水)，下午2:00開始實驗操作。

②稱重：分別在第0周、4周、8周、12周、16周、20周、24周稱重，將一塑料小桶放在動態(tài)電子天平上，抓起小鼠，放入稱量小桶中，測量體重記錄數(shù)據(jù)。

(2)空腹血糖水平檢測實驗

將所有待實驗的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食(不禁水)，即禁食6小時后開始實驗操作。

①血糖儀準備：檢查血糖儀(美國強生公司，ONETOUCH)電池，按右側(cè)開關(guān)，將試紙正確放入左側(cè)插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應(yīng)代碼的數(shù)字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖儀進入待測狀態(tài)。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對折，用拇指和食指捏住毛巾對折處，將鼠頭部和身體包入手掌內(nèi)的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。

③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。

④血糖檢測：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計時5秒顯示讀數(shù)。

Ⅱ型糖尿病損傷嚴重程度的評估指標主要包括體重、血糖等水平，體重、血糖變化結(jié)果如圖2所示，F(xiàn)lox小鼠在給與HFD飼料飼養(yǎng)后，從第4周開始體重明顯高于其NC飼料組，給與CARD6 KO小鼠24周的HFD飼料和NC飼料飼養(yǎng)后，從第4周開始HFD組的CARD6 KO小鼠體重明顯高于HFD組的CARD6 Flox小鼠體重，一直持續(xù)到第24周(見圖2A)；經(jīng)空腹血糖檢測發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠從第4周、8周、12周、16周、20周、24周的空腹血糖水平明顯較相應(yīng)NC對照組升高，HFD組的CARD6 KO小鼠空腹血糖水平也明顯高于CARD6 Flox組小鼠空腹血糖水平(見圖2B)。表明CARD6基因敲除后顯著影響了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝穩(wěn)態(tài)，CARD6基因能顯著提高小鼠的糖代謝能力，表明CARD6基因在高脂誘導(dǎo)引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要作用。

【實施例3】葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)

實驗第22周，進行腹腔注射葡萄糖實驗(IPGTT)，以評價小鼠機體對糖耐受能力。

(1)在測血糖之前，先測量小鼠的空腹體重，根據(jù)10μL/g計算葡萄糖的注射體積。

(2)先檢測葡糖糖注射前即0分鐘時空腹血糖，在檢測完畢后迅速經(jīng)腹腔注射葡萄糖液。

(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進針定位及注射：從腹部一側(cè)進針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進針，回抽，注射時針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過腹中線后在腹部另一側(cè)進入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。

(4)分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時間點剪尾測小鼠血糖值，并記錄血糖數(shù)值和檢測時間。

進一步通過腹腔注射葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerancetests，IPGTT)來評估各組小鼠對葡萄糖的處理能力，在實驗第22周，通過注射1.0g/kg體重的葡萄糖后，HFD組的CARD6 Flox小鼠和CARD6-KO小鼠血糖水平在15分鐘時間點劇增達到峰值，隨著時間推移至注射后60分鐘，兩組小鼠血糖水平稍微下降，但仍處于高于空腹血糖水平(0分鐘時血糖)，在2小時時恢復(fù)至空腹血糖水平，且CARD6-KO小鼠血糖水平從0分鐘至2小時一直處于高于CARD6 Flox小鼠的血糖水平(圖3A)。比較各組小鼠血糖曲線下面積(area under the curve，AUC)，發(fā)現(xiàn)CARD6 Flox小鼠HFD組的AUC顯著高于NC組，CARD6 KO HFD組的AUC顯著大于CARD6 Flox HFD組的AUC(圖3B)，表明CARD6對維持糖代謝穩(wěn)態(tài)具有強大的調(diào)控能力。

【實施例4】肝臟大體外觀及肝臟組織脂質(zhì)成分測定

(1)終末肝臟組織取材

1)小鼠稱重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤濕。

2)用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開皮膚至劍突下，向尾端剪開皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開腹腔，充分暴露各臟器。

3)迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無菌培養(yǎng)皿中，迅速稱重。

4)石蠟標本：切取部分肝臟置于10％中性福爾馬林中固定。冰凍標本：切取部分肝臟，置于有OCT的錫紙模具中包埋，放在干冰上冰凍固定。

2.肝臟組織處理及病理染色相關(guān)實驗

1)肝臟脫水，透明，浸蠟

切取10％中性福爾馬林中固定好的部分肝葉組織于標記的包埋框內(nèi)，在小流量流水沖洗30分鐘以上。按照以下流程在機器上設(shè)置以下程序，①脫水：75％酒精(45分鐘)→75％酒精(45分鐘)→85％酒精(45分鐘)→85％酒精(45分鐘)→95％酒精(45分鐘)→95％酒精(45分鐘)→無水酒精(1小時)→無水酒精(1小時)；②透明：二甲苯(1小時)→二甲苯(1小時)；③浸臘(65℃)：石蠟(1小時)→石蠟(1小時)。待組織沖洗完畢后，將包含組織的包埋框裝進機器籃筐內(nèi)，啟動上述程序。上述程序完成后，取出組織包埋框送病理室包埋組織，同時清洗機器備用。

2)肝臟組織切片

使用切片機切片(切片厚度5μm)。

3)肝臟組織蘇木精-伊紅(HE)染色

將肝臟組織石蠟切片放入65℃烘箱(30分鐘)→二甲苯中(5分鐘×3次)→100％酒精(1分鐘)→90％酒精(1分鐘)→70％酒精(1分鐘)→蒸餾水洗→蘇木素(5分鐘)→自來水洗去切片上的浮色→1％鹽酸酒精(1至3秒)→自來水洗數(shù)下→Scott促藍液(碳酸氫鈉0.35g，硫酸鎂2g，蒸餾水100mL)(1分鐘)→自來水洗數(shù)下→伊紅(1分鐘)→蒸餾水洗去切片上的浮色→70％酒精一下→90％酒精一下→100％酒精(30秒×3次)→二甲苯(2分鐘×3次)→在二甲苯未干時封片，拍照。

4)肝臟組織油紅O染色

①將冰凍肝臟組織切片在通風櫥中風干30分鐘，4％多聚甲醛固定10分鐘。置于雙蒸水中稍洗10分鐘，以除去組織表明的多聚甲醛。

②以60％異丙醇處理1分鐘。

③用油紅O(公司sigma，貨號O0625，濃度0.5克/100mL 100％異丙醇)染色30分鐘。

④之后以60％異丙醇漂洗1分鐘×3次，直至背景干凈。

⑤用Mayer’s蘇木素染液(5滴)淡染細胞核。

⑥水漂洗，稀碳酸鋰水溶液中促藍，充分水洗，水洗至細胞核藍化。

⑦用甘油明膠封片，拍照。

肝臟重量統(tǒng)計結(jié)果如圖4所示，在HFD組的CARD6 KO小鼠無論肝臟重量還是肝臟重量與小鼠本身體重比值均較HFD組的CARD6 Flox小鼠高。進一步通過組織切片，進行HE和油紅O染色，顯微鏡下觀察各組小鼠肝臟組織在高脂飲食飼養(yǎng)條件下發(fā)生了顯著的病理改變。通過肝臟HE染色，可以觀察到在HFD飼養(yǎng)條件下，CARD6 Flox小鼠和CARD6 KO小鼠肝臟組織均有脂肪沉積，可以看到CARD6 Flox組小鼠的肝細胞發(fā)生脂肪變性、空泡化且融合連成片狀，肝臟細胞形態(tài)已幾乎完全破壞，而CARD6-KO組小鼠的肝細胞形態(tài)變化更為嚴重(如圖5上)。通過肝臟油紅O染色來檢測肝組織中脂質(zhì)，可以發(fā)現(xiàn)在HFD組的CARD6 Flox小鼠的肝門靜脈周圍呈大片紅色，提示有大量的脂質(zhì)沉積，而在HFD組的CARD6 KO小鼠的肝門靜脈周圍的脂質(zhì)沉積更顯著(如圖5下)。這些結(jié)果說明CARD6基因敲除小鼠的脂肪肝明顯惡化。

上述結(jié)果顯示CARD6 KO小鼠在HFD的誘導(dǎo)下發(fā)生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病變顯著加重。這些結(jié)果表明CARD6基因?qū)Ω纳脾蛐吞悄虿『椭靖尉哂酗@著的作用。本發(fā)明結(jié)果說明CARD6基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有著重要的保護作用。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢大學(xué)

<120> 胱天蛋白酶募集域蛋白6在治療脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應(yīng)用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> CARD6-sgRNA1

<400> 1

ggagagtagg caacatgact tgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> CARD6-sgRNA 2

<400> 2

ggtgaaagca gttatcagta ggg 23

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> loxp1-F

<400> 3

agcttgacgt cataacttcg tatagcatac attatagcaa tttataccgg tgat 54

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> loxp1-R

<400> 4

atcaccggta taaattgcta taatgtatgc tatacgaagt tatgacgtca 50

<210> 5

<211> 52

<212> DNA

<213> loxp2-F

<400> 5

gatcccttaa gataacttcg tatagcatac attatagcaa tttatacgcg ta 52

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> loxp2-R

<400> 6

ctagtacgcg tataaattgc tataatgtat gctatacgaa gttatcttaa gg 52

<210> 7

<211> 104

<212> DNA

<213> CARD6-F

<400> 7

ggggtaccgt atagatttgt taaaaatgaa agtagagtag gcaacatgat aacttcgtat 60

agcatacatt atagcaattt atacttggag tgaaccaact cttg 104

<210> 8

<211> 112

<212> DNA

<213> CARD6-R

<400> 8

ataagaatgc ggccgcaccc tgtaggtgtg tgccaccttg cccagccaga ccctacataa 60

attgctataa tgtatgctat acgaagttat tgataactgc tttcacagtt cc 112