本發(fā)明涉及核酸檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：人類獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS，英文全稱：acquiredimmunodeficiencysyndrome)，又稱艾滋病，其病原是人類免疫缺陷病毒(HIV，英文全稱：humanimmunodeficiencyvirus)，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)的慢病毒亞科(Lentivirinae)。根據(jù)其基因型差異分為HIV-1和HIV-2兩個大型，各大型包括多種亞型。目前世界上大部分地區(qū)流行的是HIV-1，而HIV-2只在西非、西歐區(qū)域性流行。HIV基因組由兩條單鏈正鏈RNA組成，包含gag、pol、env三個結(jié)構(gòu)基因，以及tat、rev、nef、vif、vpu、vpr、vpx等調(diào)控基因，并在基因組的5′端和3′端各含長末端重復(fù)序列(LTR，英文全稱：longterminalrepeat)。HIV的LTR區(qū)含順式調(diào)控序列，包含啟動子和增強子并含負調(diào)控區(qū)，控制病毒基因的表達。各基因的功能如下：(1)gag基因能編碼約500個氨基酸組成的聚合前體蛋白(P55)，經(jīng)蛋白酶水解形成P17，P24核蛋白，使RNA不受外界核酸酶破壞。(2)pol基因編碼聚合酶前體蛋白(P34)，經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H，均為病毒增殖所必需。(3)env基因編碼約863個氨基酸的前體蛋白并糖基化成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原決定簇，已證明HIV中和抗原表位，在gp120V3環(huán)上，V3環(huán)區(qū)是包膜蛋白的重要功能區(qū)，在病毒與細胞融合中起重要作用。gp120與跨膜蛋白gp41以非共價鍵相連。gp41與靶細胞融合，促使病毒進入細胞內(nèi)。實驗表明gp41亦有較強抗原性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。(4)tat基因編碼蛋白(P14)可與LTR結(jié)合，以增加病毒所有基因轉(zhuǎn)錄率，也能在轉(zhuǎn)錄后促進病毒mRNA的翻譯。(5)rev基因產(chǎn)物是一種順式激活因子，能對env和gag中順式作用抑制序列(Crs，英文全稱：Cis-Actingrepressionsequance)去抑制作用，增強gag和env基因的表達，以合成相應(yīng)的病毒結(jié)構(gòu)蛋白。(6)nef基因編碼蛋白P27對HIV基因的表達有負調(diào)控作用，以推遲病毒復(fù)制。該蛋白作用于HIVcDNA的LTR，抑制整合的病毒轉(zhuǎn)錄。可能是HIV在體內(nèi)維持持續(xù)感染所必需。(7)vif基因?qū)IV并非必不可少，但可能影響游離HIV感染性、病毒體的產(chǎn)生和體內(nèi)傳播。(8)vpu基因為HIV-1所特有，對HIV的有效復(fù)制及病毒體的裝配與成熟不可少。(9)vpr基因編碼蛋白是一種弱的轉(zhuǎn)錄激活物，在體內(nèi)繁殖周期中起一定作用。HIV-2基因結(jié)構(gòu)與HIV-1存在有差別，兩者之間同源性僅為40～60％，HIV-2不含vpu基因，但有一功能不明vpx基因。HIV因為其反轉(zhuǎn)錄酶無校正功能，錯配性高，導(dǎo)致基因變異性很強，尤以env基因變異率最高。根據(jù)env基因區(qū)的突變，HIV-2又可分為7個亞型。熒光定量PCR(聚合酶鏈式反應(yīng)，英文全稱：PolymeraseChainReaction)是在普通PCR的基礎(chǔ)上在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，在把序列擴增過程中，隨著PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積,熒光信號強度也等比例增加，熒光信號不斷增強，并逐漸累積形成一條擴增曲線，通過熒光積累曲線實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定性及定量分析的方法。目前real-timeQ-PCR所使用的熒光化學(xué)方法主要有五種，分別是：DNA結(jié)合染色，水解探針，分子信標，熒光標記引物，雜交探針。它們又可分為擴增序列特異和非特異的檢測兩大類。(1)擴增序列非特異性檢測。此方法基于與DNA結(jié)合的熒光分子，如SYBRgreen1等熒光染料。通過在PCR反應(yīng)體系中加入過量SYBRgreen1熒光染料，此染料能滲入DNA雙鏈，并發(fā)出熒光信號，但不能與單鏈DNA或RNA結(jié)合。在模板擴增過程中，隨著雙鏈DNA數(shù)量的積累，熒光信號強度也等比增強。熒光染料的優(yōu)勢在于它能監(jiān)測任何dsDNA序列的擴增，不需要探針的設(shè)計，使檢測方法變得簡便，同時也降低了檢測的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA(如引物二聚體)結(jié)合，使實驗容易產(chǎn)生假陽性信號。引物二聚體的問題目前可以用帶有熔解曲線分析的軟件加以解決。(2)擴增序列特異性檢測。上世紀90年代，TaqDNA多聚酶的5’核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)和雙熒光標記探針的運用使得在一密閉PCR反應(yīng)管中間接地檢測PCR產(chǎn)物成為可能，此后，相應(yīng)的儀器和試劑的商品化發(fā)展導(dǎo)致real-timeQ-PCR方法在研究工作中正式投入使用。擴增序列特異性檢測又分為直接法和間接法。直接的方法指的是標記熒光的探針與擴增產(chǎn)物結(jié)合后即直接產(chǎn)生熒光，如分子信標、熒光標記引物及分子探針探針。分子信標探針是一種標記熒光的發(fā)夾探針，當探針分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，結(jié)合在其兩端的熒光基團距離上接近，使得產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，而不發(fā)生熒光。當有與環(huán)序列互補的模板存序列存在時，環(huán)序列將與模板配對，分子信標將成鏈狀，熒光基團與淬滅劑分開，發(fā)出熒光信號。熒光標記引物是從分子信標的概念變化而產(chǎn)生的一種聯(lián)合分子探針系統(tǒng)，它把熒光基團標記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列直接與PCR引物相結(jié)合，從而使熒光標記基團直接摻入PCR擴增產(chǎn)物中。目前主要有兩種：日出引物和蝎子引物。雜交探針使用兩個特異的探針，其中上游的探針的3′端標記有供體熒光素，而下游的探針的5′端標記有受體熒光素。在PCR中模板退火階段，兩探針同時與擴增產(chǎn)物雜交，并形成頭尾結(jié)合的形式，使供體和受體熒光素距離非常接近，兩者產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET，此作用與上述水解探針的方式相反)，使得受體熒光基團發(fā)出熒光；當兩探針處于游離狀態(tài)時，無熒光產(chǎn)生。由于反應(yīng)中運用了兩個探針，因此增加了方法的特異性，另外也可利用熒光寡核苷酸熔解曲線對與寡核苷酸探針結(jié)合的序列進行分析，從中獲取有用的信息。間接的方法就是利用水解探針的策略。目前在real-timeQ-PCR中最廣泛使用的TaqMan系統(tǒng)就是運用了這個原理。PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團，此時5′端熒光基團吸收能量后將能量轉(zhuǎn)移給臨近的3′端熒光淬滅基團(發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，F(xiàn)RET)，因此探針完整時，檢測不到該探針5′端熒光基團發(fā)出的熒光。但在PCR擴增中，溶液中的模板變性后低溫退火時，引物與探針同時與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換，Taq酶的5′-3′外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)將探針5′端連接的熒光基團從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3′端熒光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。HIV-2雖然只是區(qū)域性感染，以西非和西歐地區(qū)為主，但近年來隨著人口流動加強，在其它地區(qū)亦出現(xiàn)了感染病例。HIV-2攻擊性與HIV-1相比較弱，發(fā)展為艾滋病的潛伏期較長，但后期癥狀類似，危害性相當。傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測如ELISA法，免疫熒光法，凝集試驗，免疫印跡法(WB，英文全稱：Westernblot)并不能在感染窗口期檢測出HIV-2，且HIV-2與HIV-1在血清學(xué)上存在一定的交叉反應(yīng)，易造成漏檢或誤檢，給后期治療和用藥帶來不便。而普通PCR雖然耗時較少，但由于HIV-2變異性強，亞型較多，導(dǎo)致特異性較差，且其后期的結(jié)果分析需開蓋進行，易造成污染和非特異性擴增造成假陽性，增加了檢測的難度。因此，亟需一種靈敏度高，特異性強，覆蓋面廣，檢測窗口期短的HIV-2檢測方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒，以解決現(xiàn)有技術(shù)中試劑盒靈敏度低，特異性差的技術(shù)問題。本發(fā)明提供一種人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒，所述人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒包括：人類免疫性缺陷病毒2型核酸PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴增的上下游引物以及用于靶多核苷酸檢測的探針，其中，所述用于靶多核苷酸檢測的探針序列為SEQIDNO：3。優(yōu)選的，所述用于靶多核苷酸擴增的上下游引物的序列分別為SEQIDNO：1和2。優(yōu)選的，所述人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒還包括內(nèi)標，所述內(nèi)標的序列為SEQIDNO：7。優(yōu)選的，所述人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒還包括：用于內(nèi)標片段擴增的上下游引物和用于檢測內(nèi)標的探針，所述探針的序列為SEQIDNO：6。優(yōu)選的，所述用于內(nèi)標片段擴增的上下游引物序列分別為SEQIDNO：4和5。優(yōu)選的，所述檢測試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。優(yōu)選的，所述檢測試劑盒中還包括酶混合液，所述酶混合液中包括耐熱DNA聚合酶和尿嘧啶DNA糖基化酶，同時在所述PCR反應(yīng)液中還包括dUTP。本發(fā)明中的核苷酸序列如表1所示：本發(fā)明的實施例提供的技術(shù)方案可以包括以下有益效果：本發(fā)明提供一種人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒，包括：人類免疫性缺陷病毒2型核酸PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、用于靶多核苷酸擴增的上下游引物以及用于靶多核苷酸檢測的探針，其中，所述用于靶多核苷酸檢測的探針序列為SEQIDNO：3。本發(fā)明提供一種操作快速、方法簡便、檢測特異性好、靈敏度高、檢測范圍寬的人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒，本試劑盒提供的用于靶多核苷酸檢測的探針特異性較高，應(yīng)用該試劑盒，可以對未知樣本中的人類免疫性缺陷病毒2型核酸進行快速檢測，為診斷人類免疫性缺陷病毒2型核酸提供可靠的實驗依據(jù)，可以解決現(xiàn)有技術(shù)中試劑盒檢測效率低、特異性差以及靈敏度低的問題。應(yīng)當理解的是，以上的一般描述和后文的細節(jié)描述僅是示例性和解釋性的，并不能限制本發(fā)明。具體實施方式本說明書中的各個實施例均采用遞進的方式描述，各個實施例之間相同相似的部分互相參見即可，每個實施例重點說明的都是與其它實施例的不同之處。實施例一本發(fā)明提供一種人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒，所述人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒包括：人類免疫性缺陷病毒2型核酸PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括：30μl反應(yīng)緩沖液、100mM的脫氧核糖核苷三磷酸1.5μl、0.5μl用于靶多核苷酸檢測的探針，其核苷酸序列為SEQIDNO：3以及用于靶多核苷酸擴增的上下游引物，其核苷酸序列分別為SEQIDNO：1和2。HIV-2與HIV-1的基因組同源性較低，僅為40％-60％，且突變性強。針對HIV-2基因組5’和3’的LTR基因高保守區(qū)設(shè)計一對上下游引物及TaqMan探針(SEQIDNO:1、2、3)，探針5’和3’分別標記FAM和BHQ1，能實現(xiàn)對HIV-2各亞型的高覆蓋面檢測，同時能將其和HIV-1及其它病毒區(qū)分開來，具有較高的特異性。本發(fā)明提供一種操作快速、方法簡便、檢測特異性好、靈敏度高、檢測范圍寬的人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒，本試劑盒提供的用于靶多核苷酸檢測的探針特異性較高，應(yīng)用該試劑盒，可以對未知樣本中的人類免疫性缺陷病毒2型核酸進行快速檢測，為診斷人類免疫性缺陷病毒2型核酸提供可靠的實驗依據(jù)，可以解決現(xiàn)有技術(shù)中試劑盒檢測效率低、特異性差以及靈敏度低的問題。實施例二本發(fā)明提供一種人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒，所述人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒包括：人類免疫性缺陷病毒2型核酸PCR反應(yīng)液，所述PCR反應(yīng)液包括：30μl反應(yīng)緩沖液、100mM的脫氧核糖核苷三磷酸1.5μl、0.5μl用于靶多核苷酸檢測的探針，其核苷酸序列為SEQIDNO：3、用于靶多核苷酸擴增的上下游引物，其核苷酸序列分別為SEQIDNO：1和2、內(nèi)標，其序列為SEQIDNO：7、用于內(nèi)標片段擴增的上下游引物和用于檢測內(nèi)標的探針，其序列分別為SEQIDNO：4、5和6。設(shè)計一種人工合成的由外殼蛋白包裹的含特定RNA序列(SEQIDNO：7)的慢病毒作為內(nèi)標質(zhì)控，另設(shè)計一對檢測內(nèi)標質(zhì)控序列的引物(SEQIDNO：4、5)及一條TaqMan探針(SEQIDNO：6)，探針5’和3’分別標記HEX和BHQ1，對靶序列的提取及擴增過程進行監(jiān)控，避免假陰性。此外，本實施例中還包括Tth酶、Taq酶以及催化DNA聚合酶所需要的金屬陽離子，本實施例中PCR反應(yīng)體系的配比如表2所示：表2：PCR反應(yīng)體系的配比組份每一個反應(yīng)中的體積反應(yīng)緩沖液30uldNTPs(100mM)1.5μlTth酶(5U/μl)2.0μlTaq酶(5U/μl)2.0μlMn(OAc)2(30mM)1.5μlSEQIDNO:10.5μlSEQIDNO:20.5μlSEQIDNO:30.25μlSEQIDNO:40.3μlSEQIDNO:50.3μlSEQIDNO:60.15μl滅菌純化水Upto50μl此外，本發(fā)明其他實施例中，還包括陰性對照和陽性對照。本發(fā)明采用陰性血清作為陰性對照，采用人工合成的一定濃度(1×103copies/ml)的假病毒作為陽性對照。本發(fā)明中所提供的方法為一種實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR(RealtimeRT-PCR)，更具體地說為一種擴增序列特異性檢測的實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR。在普通PCR體系中引入了一段兩端帶有熒光化學(xué)基團(報告熒光基團和淬滅熒光基團)的與核酸模板互補的TaqMan探針。本發(fā)明檢測HIV-2所用的引物為用作HIV-2核酸序列中核酸合成起始點的寡核苷酸(SEQIDNO:1、2)。檢測HIV-2內(nèi)標質(zhì)控所用的引物為能用作內(nèi)標質(zhì)控核酸序列中核酸合成起始點的寡核苷酸(SEQIDNO:4、5)。可利用常規(guī)方法從限制性消化物中純化得到上述引物，或者可通過合成方法生產(chǎn)上述引物。引物優(yōu)選為在擴增中效率最高的單鏈，但引物也可以是雙鏈。雙鏈引物首先被變性(如采用加熱方法使其變性)，即處理以分離各鏈。在本發(fā)明中，針對HIV-2靶核苷酸和內(nèi)標RNA各設(shè)計了一條熒光標記的TaqMan探針(SEQIDNO：3、6)，其中，寡核苷酸探針SEQIDNO：3兩端均分別標記為FAM和BHQ1，寡核苷酸探針SEQIDNO：6兩端分別標記為HEX和BHQ1。擴增開始時，探針與HIV-2靶核酸序列互補性決定的特定位置或內(nèi)標質(zhì)控核酸序列互補性決定的特定位置上與模板序列雜交，在聚合酶5’-3’外切酶活性下被水解，釋放出熒光信號。首先，HIV-2核酸序列經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶的催化，完成RNA指導(dǎo)下的cDNA合成，隨后DNA經(jīng)過加熱變性(變性溫度一般范圍約為90-105℃，時間一般進行約30秒或更久)成為cDNA。在擴增開始時，探針與模板結(jié)合，隨后，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號。隨著反應(yīng)的進行，反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，得到一條熒光擴增曲線圖。熒光擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別，指數(shù)期時，產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，因此可以在反應(yīng)處于指數(shù)期的某一點上來檢測產(chǎn)物的量，并且由此來推斷模板最初的含量。本發(fā)明的檢測方法為RealtimeRT-PCR，將RNA逆轉(zhuǎn)錄和DNA擴增結(jié)合起來。一般的RealtimeRT-PCR反應(yīng)過程為：1)cDNA合成；2)cDNA預(yù)變性，時間和長度取決于靶核苷酸長度及堿基組成，預(yù)變性的溫度一般為90℃-105℃，時間一般為1-10min，預(yù)變性的目的為使雙鏈核苷酸序列徹底分離為單鏈；3)變性，溫度一般為90℃-105℃，時間一般為10s-30s；4)退火，使各引物退火至HIV-2或內(nèi)標質(zhì)控核酸的靶序列上。退火的溫度通常為40℃-60℃，退火的時間可以是10s-60s；5)延伸，引物與模板結(jié)合，開始合成新的雙鏈DNA，延伸溫度一般為40℃-80℃，延伸時間可以是10s-5min。熒光檢測通道選擇：1)選擇FAM通道(Reporter:FAM,Quencher:none)檢測人類免疫性缺陷病毒2型核酸；2)選擇HEX通道(Reporter:ROX,Quencher:none)檢測內(nèi)標；4)參比熒光(PassiveReference)設(shè)置為none。熒光定量實時PCR反應(yīng)條件如表3所示。表3：熒光定量實時PCR反應(yīng)條件結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后，儀器自動保存結(jié)果，可以利用儀器自帶的軟件進行自動分析(也可以手動調(diào)節(jié)基線的開始值、結(jié)束值以及閾值線值進行分析)，然后記錄樣本Ct值和定值結(jié)果。擴增曲線與閾值線的交點，稱為Ct(即cyclethreshold，指PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)值)。具體測試結(jié)果分析如下：1)當FAM通道無CT值，且HEX通道CT值≦40(一般為28-32)時，可報告檢測結(jié)果為陰性；2)當FAM通道CT值≦40，且HEX通道CT值≦40，可報告檢測結(jié)果為陽性；3)當FAM通道CT值≧40，且HEX通道CT值≦40，可報告樣本濃度低于檢測下線，結(jié)果僅供參考；4)當HEX通道CT值≧40，該檢測結(jié)果無效，應(yīng)查找并排除原因，并重復(fù)試驗；5)當出現(xiàn)陰性對照有CT值或呈典型S型擴增曲線、陽性對照無CT值或無擴增曲線兩種情況中的任一種時，該檢測結(jié)果無效，應(yīng)查找并排除原因，并重復(fù)試驗。為證明該發(fā)明方法的可行性，進行如下測試：(1)最低檢測限(LOD)試驗通過對各濃度梯度的樣本進行檢測，表明本檢測方法的檢測靈敏度(LOD)為15IU/mL。(2)特異性實驗—與其它疾病的交叉反應(yīng)情況通過用本發(fā)明中的檢測方法對HIV-2以外的其它病原體進行檢測，結(jié)果表明本發(fā)明中的方法對HIV-1的O、M、N3個組型、HBVA-H8型、HCV1-6型、EB病毒等病原體感染樣本無交叉反應(yīng)，表明其具有高特意性。(3)對潛在內(nèi)源物質(zhì)的抗干擾性試驗表明，當血漿樣本中甘油三脂≦3000mg/dL、非結(jié)合性膽紅素≦40mg/dL、血紅蛋白≦500mg/dL、血蛋白≦9g/dL時，本檢測方法的靈敏度不受干擾。當血漿樣本中血細胞體積比≧2.5時，可能會出現(xiàn)內(nèi)標失敗的現(xiàn)象。(4)對潛在外源物質(zhì)的抗干擾性試驗表明，當樣本中含有齊多夫定、替諾福韋、拉米夫定、洛匹那韋立托那韋、阿德福韋酯，替比夫定，恩替卡韋，替諾福韋酯、撲熱息痛、扎那米韋(200μg/ml)等常見的抗病毒藥物時，對本試劑盒的檢測靈敏度不會受到明顯干擾。本發(fā)明中的檢測方法基于實時熒光逆轉(zhuǎn)錄PCR，把PCR、熒光探針融為一體，使PCR擴增和產(chǎn)物分析的全過程均在單管封閉條件下進行，能對反應(yīng)過程進行實時監(jiān)測。實時熒光定量技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一種核酸檢測技術(shù)，使用一種帶有熒光檢測裝置的擴增儀，熒光檢測裝置能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信號，通過檢測熒光信號的動態(tài)變化實時反映的每個循環(huán)的擴增水平，根據(jù)擴增曲線及CT值可以判斷檢測結(jié)果的陰陽性。同時，通過設(shè)計不同濃度的假陽性樣本作為定量參考品，可通過標準曲線計算出樣本的絕對濃度。本發(fā)明中的用實時熒光PCR技術(shù)檢測HIV-2與其它檢測技術(shù)相比具有以下優(yōu)勢：(1)采用實時熒光PCR技術(shù)檢測HIV-2與傳統(tǒng)的血清免疫學(xué)檢測比較，具有更高的靈敏度，從理論上講只要有一個基因拷貝就可以檢測出來，同時避免了交叉反應(yīng)，縮短了檢測窗口期。(2)根據(jù)HIV-2基因組獨特的保守基因序列設(shè)計引物和探針，能夠保證PCR反應(yīng)的高度特異性。HIV-2與HIV-1的基因組同源性較低，僅為40％-60％，且突變性強，而位于基因組中間區(qū)域的env基因更甚。本發(fā)明在引物設(shè)計上避開高突變區(qū)域，針對HIV-2基因組的5’LTR及3’LTR高保守區(qū)設(shè)計一對引物探針，能實現(xiàn)對HIV-2各亞型的高覆蓋面檢測，同時能將其和HIV-1及其它病毒區(qū)分開來，具有較高的特異性。(3)采用人工合成的慢病毒作為內(nèi)標質(zhì)控，確保檢測結(jié)果的準確度。本發(fā)明中采用一種由蛋白質(zhì)外殼包裹的，含特定RNA序列的慢病毒顆粒作為內(nèi)標質(zhì)控，內(nèi)標質(zhì)控可參與HIV-2核酸的提取和PCR反應(yīng)，監(jiān)控實驗操作過程和PCR反應(yīng)過程，避免出現(xiàn)假陰性，增加了檢測結(jié)果的可信度。(4)集PCR的高靈敏性與TaqMan探針的高特異性兩大優(yōu)點于一身，在很大程度上改變了傳統(tǒng)PCR的缺陷，縮短了檢測時間，簡化檢測步驟，提高了檢測效率。(5)檢測全過程均在單管封閉條件下進行，避免了由于樣本間交叉引起的假陽性和環(huán)境污染。(6)可連續(xù)不斷的檢測PCR過程中實時信號的變化，避免了傳統(tǒng)PCR的“平臺期效應(yīng)”，并且模板的定量不通過終產(chǎn)物，而由Ct值算出，準確性和靈敏性都有提高。以上所述的本發(fā)明實施方式，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護范圍的限定。任何在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。以上所述僅是本發(fā)明的具體實施方式，使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解或?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。SEQUENCELISTING<110>湖南圣湘生物科技有限公司<120>一種人類免疫性缺陷病毒2型核酸檢測試劑盒<130>2016<160>7<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>引物<400>1gcaggtagagcctgggtgttc21<210>2<211>22<212>DNA<213>引物<400>2gaagagggctttaagcaagcaa22<210>3<211>27<212>DNA<213>探針<400>3tgctagactctcaccagyrcttggccg27<210>4<211>22<212>DNA<213>引物<400>4taggaggtagagcctgggtgtt22<210>5<211>17<212>DNA<213>引物<400>5ccagcaccggccaagtg17<210>6<211>28<212>DNA<213>探針<400>6agcctgggtgttccctgctagactctca28<210>7<211>154<212>DNA<213>內(nèi)標<400>7tagattaggaggtagagcctgggtgttgtcacaacatttgtgttgtaagtgtaataatca60acttcagctagtagtagaaacctcgcaagacagcctgggtgttccctgctagactctcat120ggacacactacacttggccggtgctggtgtgttt154當前第1頁1 2 3