本發明屬于生物
技術領域：
，尤其涉及一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料、其制備方法及應用。
背景技術：
：隨著生物科學技術的不斷進步，基因治療將在人類攻克癌癥及遺傳疾病等頑癥的過程中占據重要地位，并將逐步成為一種常見的有效手段(參見JeongJH,KimSW,ParkTG.Park.Moleculardesignoffunctionalpolymersforgenetherapy.Prog.Polym.Sci.2007；32(11):1239-1274.)?；蛑委熓侵笇⑷说恼；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫學新技術。成功的基因治療依賴于有效的基因載體，常見的載體分為病毒類載體和非病毒載體。病毒類載體包括逆轉錄病毒、腺病毒(AV)、腺相關病毒(AAV)、單純皰疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等，但是病毒類載體在臨床應用中存在著很大的安全隱患，在基因治療歷史上首例患者死亡事件以及著名的法國“氣泡嬰兒”事件，在很大程度上都是由病毒類基因載體的不安全性造成的。非病毒載體多為高分子陽離子聚合物，因其安全、有效、無免疫原性等優點，已成為病毒類載體最有希望的替代者(參見GodbeyWT,WuKK,MikosAG.Poly(ethylenimine)anditsroleingenedelivery.J.ControlRelease.1999Aug5；60(2-3):149-160.RemyJS,AbdallahB,ZantaMA,BoussifO,BehrJP,DemeneixB.Genetransferwithliposperminesandpolyethylenimines.Adv.DrugDeliver.Rev1998Mar2；30(1-3):85-95.)。其中，陽離子聚合物如聚乙烯亞胺(PEI)是常用的一個非病毒類載體，它已經在體外和體內的轉染實驗中得到應用，但由于其毒性高、轉染效率低、在體內運輸過程的非特異性吸附以及沒有靶向性的缺點，阻礙了它的進一步發展(參見LungwitzU,BreunigM,BlunkT,GopferichA.Polyethylenimine-basednon-viralgenedeliverysystems.Eur.J.Pharm.Biopharm2005；60(2):247-266.)。理想的基因治療過程是，載有質粒DNA的基因載體在血液中循環，到達腫瘤組織后被腫瘤細胞內吞并完成轉染治療。但實際過程中有很多因素阻礙了載體體系到達腫瘤組織。首先血液中含有很多帶負電的蛋白類物質，可與帶正電的載體體系吸附凝聚成大顆粒沉淀或被清除掉(參見Liu,Y.,andReineke,T.M.Poly(glycoamidoamine)sforgenedelivery.Structuraleffectsoncellularinternalization,bufferingcapacity,andgeneexpression.BioconjugateChem.2007；18,19-30.)；其次，由于正常體液環境中，細胞表面帶負電荷，帶正電的載體體系也容易接近正常細胞，被正常細胞內吞，細胞內吞陽離子復合物顆粒的重要機理就是首先通過靜電作用吸附復合物顆粒，然后復合物顆粒進入細胞。這些都最終影響了轉染效率，因此開發體內應用的基因載體，就要增加基因載體體系進入目標組織細胞的效率，降低其被非目標組織吸附的幾率。為了提高基因載體體系進入目標組織細胞的效率，常用的方法是引入生物相容性的聚乙二醇(PEG)來降低在血液運輸過程中的非特異性吸附。然而單純的遮蔽體系會影響載體體系與細胞的結合效率，從而降低細胞轉染效率。技術實現要素：有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料、其制備方法及應用，該改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料可作為遮蔽體系降低血液運輸過程中的非特異性吸附。本發明提供了一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料，包括改性聚乙二醇與生長在改性聚乙二醇上的納米碳酸鈣；所述改性聚乙二醇由聚乙二醇接枝聚合物得到；所述聚合物為聚氨基酸和/或聚丙烯酸。優選的，所述聚乙二醇的分子量為5000～30000。優選的，所述聚乙二醇與聚合物的摩爾比為(3～10)：1。優選的，所述聚氨基酸為聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。本發明還提供了一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料的制備方法，包括以下步驟：將改性聚乙二醇與可溶性鈣鹽在水中混合，然后加入可溶性碳酸鹽混合攪拌，離心后將上層溶液透析，冷凍干燥后得到改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料；所述改性聚乙二醇由聚乙二醇接枝聚合物得到；所述聚合物為聚氨基酸和/或聚丙烯酸。優選的，所述可溶性鈣鹽為氯化鈣；所述可溶性碳酸鹽為堿金屬碳酸鹽。優選的，所述改性聚乙二醇與可溶性鈣鹽的摩爾比為1：(20～100)。優選的，所述混合攪拌的時間為8～20h。本發明還提供了上述改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料作為基因載體遮蔽材料的應用。優選的，所述基因載體為聚乙烯亞胺。本發明提供了一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料、其制備方法及應用，該改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料包括改性聚乙二醇與生長在改性聚乙二醇上的納米碳酸鈣；所述改性聚乙二醇由聚乙二醇接枝聚氨基酸和/或聚丙烯酸得到。與現有技術相比，本發明以改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料作為基因載體遮蔽材料，其不僅可降低血液運輸過程中的非特異性吸附還可有效提高基因載體對基因物質的傳輸能力，進而提高了基因載體的細胞轉染效率，同時該復合材料還具有較好的生物相容性。附圖說明圖1為本發明實施例1中得到的改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料的掃描電鏡照片；圖2為本發明實施例1中得到的改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料的細胞毒性實驗結果曲線圖。具體實施方式下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。本發明提供了一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料，包括改性聚乙二醇與生長在改性聚乙二醇上的納米碳酸鈣；所述改性聚乙二醇由聚乙二醇接枝聚氨基酸和/或聚丙烯酸得到。按照本發明，所述改性聚乙二醇由聚乙二醇接枝聚氨基酸和/或聚丙烯酸得到；所述聚乙二醇為本領域技術人員熟知的聚乙二醇即可，并無特殊的限制，本發明中所述聚乙二醇的分子量優選為5000～30000；所述聚氨基酸為本領域技術人員熟知的聚氨基酸即可，并無特殊的限制，本發明中優選為聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸；所述聚氨基酸的分子量優選為5000～50000；所述聚丙烯酸的分子量優選為5000～50000；所述聚乙二醇與接枝物的摩爾比優選為(3～10)：1，更優選為(3～9)：1；所述接枝物為聚氨基酸和/或聚丙烯酸。本發明提供的復合材料在所述改性聚乙二醇上生長有納米碳酸鈣；所述納米碳酸鈣與改性聚乙二醇的摩爾比優選為(20～100)：1，更優選為(40～100)：1，再優選為(60～80)：1，最優選為80:1。本發明以改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料作為基因載體遮蔽材料，其不僅可降低血液運輸過程中的非特異性吸附還可有效提高基因載體對基因物質的傳輸能力，進而提高了基因載體的細胞轉染效率，同時該復合材料還具有較好的生物相容性。本發明還提供了一種上述改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料的制備方法，包括以下步驟：將改性聚乙二醇與可溶性鈣鹽在水中混合，然后加入可溶性碳酸鹽混合攪拌，離心后將上層溶液透析，冷凍干燥后得到改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料；所述改性聚乙二醇由聚乙二醇接枝聚合物得到；所述聚合物為聚氨基酸和/或聚丙烯酸。其中，所述聚乙二醇與聚合物均同上所述，在此不再贅述。按照本發明，優選將改性聚乙二醇溶于水中，并調節pH值至弱堿性，更優選調節pH值為7.5～8.5，再優選調節pH值為8；所述改性聚乙二醇與水的質量體積比優選為5～30毫克/毫升，更優選為10～20毫克/毫升，再優選為10毫克/毫升。調節pH值后優選攪拌10～40min，更優選攪拌20～30min，再優選攪拌20min，再加入可溶性鈣鹽；所述可溶性鈣鹽為本領域技術人員熟知的可溶于水的鈣鹽即可，并無特殊的限制，本發明中優選為氯化鈣；所述改性聚乙二醇與可溶性鈣鹽的摩爾比優選為1：(20～100)，更優選為1：(40～100)，再優選為1：(60～80)，最優選為1：80。加入可溶性鈣鹽后，優選混合攪拌20～50min，更優選混合攪拌25～40min，再優選混合攪拌30～35min，最優選混合攪拌30min，然后加入可溶性碳酸鹽；所述可溶性碳酸鹽為本領域技術人員熟知的水溶性碳酸鹽即可，并無特殊的限制，本發明中優選為堿金屬碳酸鹽，更優選為碳酸鈉；所述可溶性碳酸鈉與可溶性鈣鹽的摩爾比優選為1:1；所述可溶性碳酸鹽優選以溶液的形式緩慢滴加，邊滴加邊攪拌；所述滴加的速度優選為2毫升/分鐘。加入可溶性碳酸鹽后，混合攪拌；所述混合攪拌的時間優選為8～20h，更優選為10～16h，再優選為12～14h，最優選為12h。混合攪拌后離心；所述離心的速率優選為6000～8000轉/分；所述離心的時間優選為2～10min，更優選為3～8min，再優選為4～6min，最優選為5min。離心后，取上層溶液透析；所述透析的時間優選為40～120h，更優選為50～100h，再優選為60～90h，再優選為70～80h，最優選為72h；透析期間，優選換水4～6次。透析結束后，冷凍干燥，得到改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料。本發明還提供了一種上述的改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料作為基因載體遮蔽材料的應用；其中所述基因載體為本領域技術人員熟知的基因載體即可，并無特殊的限制，本發明中優選為聚乙烯亞胺；所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料與基因載體的質量比優選為1：(0.5～5)，更優選為1：(0.5～3)，再優選為1：(1～2)，最優選為1：1。按照本發明，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料作為基因載體遮蔽材料，可用于遮蔽基因載體與質粒DNA體系，作為質粒DNA的載體體系；此時，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料與質粒DNA的質量比優選為(10～1)：1，更優選為(5～1)：1，再優選為(3～2)：1，最優選為2.5:1；所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料作為質粒DNA的載體體系可適用于目前各種細胞系，如HeLa，293T，293F，293S，BE(2)C，CHO，CHO-S，COS7，COS-7L，CV-1，HEK-293，HT-1080，MDCK，NIH-3T3，SKBR3，Vero等細胞系；其作為質粒DNA的載體體系時的用法為本領域技術人員熟知的用法即可，并無特殊的限制，本發明中優選按照以下步驟進行：1)細胞培養；所述細胞培養的方法為本領域技術人員熟知的方法即可，并無特殊的限制，本發明中優選將細胞置于胎牛血清的培養液中進行培養；所述培養液中胎牛血清的體積分數優選為10％；所述培養條件優選為37℃含體積分數為5％二氧化碳的孵箱中連續培養。2)體外轉染；轉染前24小時內，取對數生長期細胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾培養基稀釋，按每孔1×104細胞的密度接種于96孔培養板，置于37℃含體積分數為5％二氧化碳的孵箱中繼續培養至匯合度達到80％～90％；轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板中的培養液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料、基因載體與質粒DNA以及含有體積分數為10％胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養基(改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料、基因載體與質粒DNA混合物的體積應不超過培養液體積的1/10)混合至終體積200μL，繼續培養24小時。3)體外轉染效率的測定：a)綠色熒光蛋白(GFP)表達：用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號。陽性細胞發出明亮的綠色熒光，而陰性細胞則無。用流式細胞儀檢測陽性細胞的百分率。b)熒光素酶活性檢測：取出培養板，吸去培養液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入細胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計測定轉染效率。c)β-半乳糖苷酶染色：細胞用0.01mol/L的PBS洗滌，用0.4％多聚甲醛固定5min，PBS沖洗后加入5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方為0.04％X-gal,5mmol/L亞鐵氰化鉀，5mmol/L高鐵氰化鉀和2mmol/LMgCl2),放置37℃，5％CO2孵育3h。陽性細胞呈深藍色，計算陽性細胞的百分率。4)細胞毒性測試：采用噻唑藍比色法比較評價基因載體材料的細胞毒性。實驗前24小時內，取對數生長期細胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾培養基稀釋，按每孔1×104細胞的密度接種于96孔培養板，置于37℃含體積分數為5％二氧化碳的孵箱中繼續培養至匯合度達到80％～90％。將不同濃度的材料與細胞共同培養24小時后，每孔分別加入20μl含質量分數為0.5％噻唑藍的磷酸鹽緩沖液。混合物在37℃繼續作用4小時，加入200μl二甲基亞砜溶解噻唑藍甲臢結晶10分鐘。然后用酶標儀測試每孔的吸收，測試波長選用492nm。細胞存活率按下公式計算：細胞存活率(％)＝(Asample/Acontrol)×100Asample是轉染后的細胞樣品孔的吸收，Acontrol是不與改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料、基因載體與質粒DNA混合物作用的細胞樣品孔的吸收，每組實驗重復三次。按照本發明，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料作為基因載體遮蔽材料可用于遮蔽基因載體與質粒siRNA體系，作為質粒siRNA的載體體系；此時，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料與質粒siRNA的質量比優選為(10～1)：1，更優選為(5～1)：1，再優選為(3～2)：1，最優選為2.5:1；所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料作為質粒siRNA載體可適用于目前各種細胞系，如HeLa，293T，293F，293S，BE(2)C，CHO，CHO-S，COS7，COS-7L，CV-1，HEK-293，HT-1080，MDCK，NIH-3T3，SKBR3，Vero等細胞系；所述作為載體時轉染的方法為本領域技術人員熟知的方法即可，本發明中優選按照以下步驟進行：1)用常規方法合成siRNA：所述的siRNA為本領域技術人員熟知的siRNA即可，并無特殊的限制，在本發明實施例中優選以沉默熒光素酶的LucsiRNA為例，其序列為5′-CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT-3′。2)細胞的培養：細胞置于含體積分數為10％胎牛血清的培養液中，在37℃含體積分數為5％二氧化碳的孵箱中連續培養。3)體外轉染轉染前24小時內，取對數生長期細胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾培養基稀釋，按每孔1×104細胞的密度接種于96孔培養板，置于37℃含體積分數為5％二氧化碳的孵箱中繼續培養至匯合度達到80％～90％。轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板中的培養液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，加入改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料、基因載體與質粒siRNA混合物以及含有體積分數為10％胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養基(改性聚乙烯亞胺與質粒siRNA混合物的體積應不超過培養液體積的1/10)至終體積200μL，繼續培養24小時。4)體外轉染效率的測定取出培養板，吸去培養液，用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，加入細胞裂解液裂解，然后加入熒光素酶底物，用照度計測定轉染效率。按照本發明，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料作為基因載體遮蔽材料，可用于pDNA轉染。其中，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料與基因的質量比優選為(10～1)：1，更優選為(5～1)：1，再優選為(3～2)：1，最優選為2.5:1；所述體內pDNA轉染的方法為本領域技術人員熟知的方法即可，并無特殊的限制，本發明中優選按照以下步驟進行：1)CT26細胞的培養取小鼠結腸癌CT26細胞，在含有10％(質量/體積百分數)的牛血清的培養液中，在含5％(體積百分數)CO2、溫度為37℃的孵箱中培養。2)腫瘤接種購買重量在20g的Balb/C小鼠，腫瘤接種前，取對數生長期的CT26細胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103轉/min離心5min，PBS洗滌三次后，用PBS重懸細胞，按每只小鼠2×106細胞的密度接種于腋下，10天后，瘤徑長大至10mm時進行體內轉染。3)體內轉染基因組轉染的復合物顆粒(改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料、基因載體與轉染基因混合物)在含有5％(質量/體積百分數)的葡萄糖溶液(復合物顆粒的體積所占總體積的比例應低于10％)中至終體積0.5mL，尾靜脈注射。4)體內轉染效率的測定體內轉染48h后，處死小鼠，取出腫瘤，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，勻漿，然后加入熒光素底物，測定轉染效率。按照本發明，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料作為基因載體遮蔽材料，還可用于體內siRNA轉染。其中，所述改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料與基因的質量比優選為(10～1)：1，更優選為(5～1)：1，再優選為(3～2)：1，最優選為2.5:1；所述體內siRNA轉染的方法為本領域技術人員熟知的方法即可，并無特殊的限制，本發明中優選按照以下步驟進行：1)CT26細胞的培養取小鼠結腸癌CT26細胞，在含有10％(質量/體積百分數)的牛血清的培養液中，在含5％(體積百分數)CO2、溫度為37℃的孵箱中培養。2)腫瘤接種購買重量在20g的Balb/C小鼠，腫瘤接種前，取對數生長期的CT26細胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103轉/min離心5min，PBS洗滌三次后，用PBS重懸細胞，按每只小鼠2×106細胞的密度接種于腋下，8天后，瘤徑長大至7mm時進行體內siRNA的轉染。3)體內轉染基因物質選用沉默血管內皮生長因子的VEGFsiRNA，通過抑制VEGF的表達實現抑制腫瘤生長的目的，基因組轉染的復合物顆粒(改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料、基因載體與轉染基因混合物)在含有5％(質量/體積百分數)的葡萄糖溶液中至終體積50μL，尾靜脈注射給藥。4)體內腫瘤生長的測定從第一次給藥開始測量瘤徑大小，實驗共14天。本發明提供的改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料用于提高聚乙烯亞胺的基因轉染效率并做為陽離子載體的遮蔽材料，一方面增加生物相容性，另一方面提高陽離子載體的細胞轉染效率，其是新型載體遮蔽材料。以商業化分子量為25000Da的聚乙烯亞胺(PEI25K)為例，PEI25K在細胞水平有較高的轉染效率，但用于體內動物實驗，容易與血液中負電物質結合，降低其轉染效率。引入遮蔽體系PGlu-g-PEG(聚谷氨酸接枝改性的聚乙二醇，PEG可以有效防止PEI與血液中負電物質作用)可以降低體PEI體內應用時的負面作用，然而PEG會嚴重影響載體的轉染效率。采用PGlu-g-PEG&CaCO3(聚谷氨酸接枝改性的聚乙二醇/碳酸鈣復合材料)作為遮蔽，可以有效克服PEG對轉染帶來的負面影響，并提高原有載體的轉染效率。如在同等條件下對HeLa和MCF7細胞介導熒光素酶質粒的轉染時，PGlu-g-PEG&CaCO3遮蔽PEI(pDNA/PEI/PGlu-g-PEG&CaCO3)的轉染效率是pDNA/PEI的5～7倍，是pDNA/PEI/PGlu-g-PEG的1000～2000倍。在最佳轉染比例范圍內，pDNA/PEI/PGlu-g-PEG&CaCO3可以有效降低細胞毒性，細胞存活率在90％以上；其基因沉默效率高，對恒定表達熒光素酶的Huh7以及CT26細胞的最高基因沉默效率均可達到80％以上，該復合體系相對于商業轉染試劑PEI25K有較高基因沉默效率和較小的細胞毒性，并適合于體內應用，有廣泛的應用前景。為了進一步說明本發明，以下結合實施例對本發明提供的一種改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料、其制備方法及應用進行詳細描述。以下實施例中所用的試劑均為市售。實施例1改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料(PGlu-g-PEG&CaCO3)的制備室溫，一定量聚谷氨酸接枝聚乙二醇(PGlu-PEG)溶解于去離子水中，并調節pH值至8.0，攪拌20分鐘；向PGlu-PEG溶液中加入一定量溶解好的氯化鈣，攪拌30分鐘；然后將一定量碳酸鈉溶液緩慢滴加到上述溶液中，邊加邊攪，加完再攪拌12小時。把反應完的溶液轉入離心管6000～8000轉/分，離心5分鐘，取上層溶液轉入透析帶透析72小時，期間換水4～6次，冷凍干燥，得到PGlu-g-PEG&CaCO3。PGlu-g-PEG的組成及其與碳酸鈣(CaCO3)的摩爾比對應關系列于表1。作為對比相應的PGlu-g-PEG的組成對應關系列于表2。利用掃描電子顯微鏡對實施例1中得到的改性聚乙二醇/碳酸鈣復合材料PGlu-g-PEG&CaCO3進行分析，得到其掃描電鏡照片，如圖1所示。表1原料的摩爾比對應關系產品編號PGlu-PEG、氯化鈣與碳酸鈉的摩爾比例PGlu、PEG及CaCO3的摩爾比例PPCa11:80:801:3:80PPCa21:80:801:6:80PPCa31:80:801:9:80表2PGlu-g-PEG的組成產品編號PGlu、PEG的摩爾比例PP11:3:PP21:6:PP31:9:實施例2以HeLa細胞為例，利用PGlu-g-PEG&CaCO3、PEI載體體系介導pGL3(熒光素酶質粒)、pEGFPN1(綠色熒光蛋白質粒)、pCMV-lacZ(β-半乳糖苷酶質粒)對HeLa細胞的體外轉染HeLa細胞的培養(1)取人宮頸癌細胞(HeLa細胞)，在含有10％小牛血清的培養液中連續培養(5％CO2、37℃孵箱)。(2)體外轉染轉染前24小時內，取對數生長期細胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾培養基稀釋，按每孔1×104細胞的密度接種于96孔培養板，置于37℃含體積分數為5％二氧化碳的孵箱中繼續培養至匯合度達到80～90％。轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板中的培養液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，基因組轉染的復合物顆粒(PGlu-g-PEG&CaCO3、PEI載體體系與質?；旌衔?以及含有體積分數為10％胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養基至終體積200μL，繼續培養24小時。(3)體外轉染效率的測定取出培養板，吸去培養液，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，然后加入熒光素底物，用光度計測定轉染效率。表3給出了熒光素酶質粒的復合物的組成及其轉染效率。綠色熒光蛋白(GFP)表達用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白信號。陽性細胞發出明亮的綠色熒光，而陰性細胞則無。用流式細胞儀檢測陽性細胞的百分率。表4給出了綠色熒光蛋白質粒的復合物的組成及其轉染效率。β-半乳糖苷酶染色細胞用0.01mol/L的PBS洗滌，用0.4％多聚甲醛固定5min，PBS沖洗后加入5-溴-4-氫-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)染色液(配方為0.04％X-gal，5mmol/L亞鐵氰化鉀，5mmol/L高鐵氰化鉀和2mmol/LMgCl2),放置于37℃，5％CO2孵育3h。陽性細胞呈深藍色，計算陽性細胞的百分率。表5給出了β-半乳糖苷酶質粒的復合物的組成及其轉染效率。表3熒光素酶質粒的體外轉染效率其中P25K為商業化分子量為25000Da的聚乙烯亞胺；載體為聚乙烯亞胺。表4綠色熒光蛋白質粒的體外轉染效率表5β-半乳糖苷酶質粒的體外轉染效率4)細胞毒性測試：采用噻唑藍比色法比較評價基因載體材料的細胞毒性。細胞毒性測試結果如圖2所示，其中，PEI25K為商業化分子量為25000Da的聚乙烯亞胺；PGlu-g-PEG&CaCO3中PGlu-g-PEG與CaCO3的摩爾比為1：80；PGlu-g-PEG&CaCO3/PEI中PGlu-g-PEG&CaCO3與PEI的質量比為1:1。實施例3以Huh7細胞為例，利用PGlu-g-PEG&CaCO3、PEI載體體系介導沉默熒光素酶的LucsiRNA在Huh7細胞系中的轉染(1)Huh7細胞的培養：取Huh7細胞，在含有10％小牛血清的培養液中連續培養(5％CO2、37℃孵箱)。(2)體外轉染轉染前24小時內，取對數生長期細胞，胰酶消化后用達爾伯克改良伊格爾培養基稀釋，按每孔1×104細胞的密度接種于96孔培養板，置于37℃含體積分數為5％二氧化碳的孵箱中繼續培養至匯合度達到80～90％。轉染時，吸棄前一天加注的細胞培養板中的培養液，用磷酸鹽緩沖液洗滌兩次后，基因組轉染的復合物顆粒以及含有體積分數為10％胎牛血清的達爾伯克改良伊格爾培養基至終體積200μL，繼續培養24小時。(3)體外轉染效率的測定取出培養板，吸去培養液，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，然后加入熒光素底物，用光度計測定轉染效率。表6給出了熒光素酶沉默效率。表6LucsiRNA體外轉染效率實施例4以MCF7細胞為例，PGlu-g-PEG&CaCO3、PEI載體體系在體內pDNA轉染中的應用(1)MCF7細胞的培養取MCF7細胞，在含有10％(質量/體積百分數)的牛血清的培養液中，在含5％(體積百分數)CO2、溫度為37℃的孵箱中培養；(2)腫瘤接種購買重量在20g的Balb/C小鼠，腫瘤接種前，取對數生長期的MCF7細胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103轉/min離心5min，PBS洗滌三次后，用PBS重懸細胞，按每只小鼠2×106細胞的密度接種于腋下，10天后，瘤徑長大至直徑10mm時進行體內轉染。(3)體內轉染基因組轉染的復合物顆粒在含有5％(質量/體積百分數)的葡萄糖溶液中至終體積0.5mL，尾靜脈注射。(4)體內轉染效率的測定體內轉染48h后，處死小鼠，取出腫瘤，PBS洗滌2次，加入裂解液裂解，勻漿，然后加入熒光素底物，測定轉染效率。表7給出了體內實驗熒光素酶質粒的復合物的轉染效率。表7熒光素酶質粒體內轉染效率實施例5以CT26細胞為例，PGlu-g-PEG&CaCO3、PEI載體體系在體內siRNA轉染中的應用(1)CT26細胞的培養取小鼠結腸癌CT26細胞，在含有10％(質量/體積百分數)的牛血清的培養液中，在含5％(體積百分數)CO2、溫度為37℃的孵箱中培養。(2)腫瘤接種購買重量在20g的Balb/C小鼠，腫瘤接種前，取對數生長期的CT26細胞，胰酶消化后用DMEM中和胰酶，1×103轉/min離心5min，PBS洗滌三次后，用PBS重懸細胞，按每只小鼠2×106細胞的密度接種于腋下，8天后，瘤徑長大至7mm時進行體內siRNA的轉染。(3)體內轉染基因物質選用沉默血管內皮生長因子的VEGFsiRNA，通過抑制VEGF的表達實現抑制腫瘤生長的目的，基因組轉染的復合物顆粒在含有5％(質量/體積百分數)的葡萄糖溶液中至終體積50μL，尾靜脈注射給藥。(4)體內腫瘤生長的測定從第一次給藥開始測量瘤徑大小，實驗共14天。表8給出了體內實驗VEGFsiRNA的復合物對腫瘤抑制14天后的瘤徑。表8VEGFsiRNA體內轉染后瘤徑大小本發明提供的PGlu-g-PEG&CaCO3作為遮蔽體系遮蔽PEI，轉染效率高，其在同等條件下對HeLa細胞介導熒光素酶質粒的轉染效率最高為商業化PEI25K的5～7倍，在最佳轉染比例范圍內，細胞存活率在90％以上；其基因沉默效率高，對恒定表達熒光素酶的Huh7細胞的最高基因沉默效率為82.5％，該聚合物相對于商業轉染試劑PEI25K有較高基因沉默效率和較小的細胞毒性。當前第1頁1 2 3