本發明涉及病毒檢測
技術領域：
，更具體地，涉及一種豬H1N1亞型流感病毒血凝素重組蛋白的制備方法及該病毒抗體的液相芯片檢測試劑盒。
背景技術：
：豬流感(SwineInfluenza，SI)是豬流感病毒(SwineInfluenzavirus，SIV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性呼吸道傳染病，臨床上以突發、咳嗽、高熱、呼吸困難、精神沉郁、高發病率、低病死率為特征。目前，全球豬群中以經典豬流感H1N1和類人H3N2亞型為主廣泛流行，盡管豬流感死亡率低，但是其可造成其他病原的繼發感染，對養殖業造成巨大的經濟損失。豬是人、禽流感病毒的易感宿主，是流感病毒跨種傳播的中間宿主，是流感病毒基因重組的“混合器”，是引起流感大爆發的重要原因。2009年，甲型H1N1流感病毒(pdm2009)在墨西哥、美國相繼爆發，該流行毒株是由人流感、豬流感和禽流感病毒基因自然重組而形成的一種新型流感病毒。該毒株的PB1基因來于H3N2人流感，PA和PB2基因來自于北美禽流感，NA和M基因來自歐亞類禽豬流感，HA、NP和NS基因來自經典豬流感。該毒株能通過抗原的變異逃避機體的免疫系統，短時間內迅速蔓延至全球，造成流感的大流行，而引起人們的關注。在豬場內進行定期的SIV抗體監測對于預防其它疾病的出現，以及在人群中流行具有重要的公共衛生學意義。液相芯片技術又稱為Luminex技術、xMAP技術，是美國Luminex公司于20世紀90年代中期開發的一種多功能液相生物芯片檢測技術。該技術集流式細胞技術、熒光技術、激光技術、傳統的化學技術和計算機處理系統為一體新型多通道高通量生物芯片檢測體系，具有高通量、重復性好、快速準確的特點。目前，液相芯片檢測技術已被廣泛應用于食品生產、醫療保健、環境衛生等領域的微生物檢測，在呼吸道、蟲媒介等病毒檢測、細菌檢測、基因檢測、藥物殘留、細胞因子檢測等方面廣泛應用。2001年12月，美國食品與藥物管理局(FDA)批準了用于臨床診斷的液相芯片檢測技術，該技術是唯一一個被FDA認證了的診斷技術。目前，豬流感病毒抗體診斷方法主要為血凝抑制試驗(hemagglutinationinhibitiontest，HI)和微量中和試驗(Microtitreneutralizationtest，MIVN)。其中，HI檢測方法簡單、易操作，但敏感性較差；MIVN檢測方法敏感性和特異性好，但操作繁瑣、周期長。鑒于此，需要建立一種操作簡便、敏感性高、特異性強的方法，對目前進行補充和校對。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是克服現有技術存在的上述缺陷，首先提供一種豬流感病毒的血凝素重組蛋白的制備方法。本發明的第二個目的是提供上述方法制備得到的豬流感病毒的血凝素重組蛋白。本發明的第三個目的是提供所述豬流感病毒的血凝素重組蛋白作為免疫原在制備檢測豬流感病毒的試劑中的應用。本發明的第四個目的是提供一種檢測豬流感病毒的試劑盒。本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的：一種豬流感病毒的血凝素重組蛋白的制備方法，包括以下步驟：S1.去除表達HA基因的信號肽的基因序列，利用HA-F和HA-R引物擴增HA基因；其中，HA-F和HA-R引物的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示；S2.連接pMAL-c5X載體，獲得pMAL-cHA重組質粒，轉入原核表達菌誘導表達即可。SIV的血凝素蛋白(HA)頭部包含5個抗原決定簇，是流感病毒的主要表面抗原，可刺激機體產生中和抗體，從而起到保護機體的作用。同時血凝素是流感病毒亞型分類的依據，因此，HA蛋白是開發流感病毒疫苗以及檢測方法的首選生物材料。本研究應用生物學軟件SignalPV2.0.b2對HA基因進行信號肽分析，去除HA的信號肽。根據HA序列設計一對帶有His標簽的引物，構建了帶有6*His-麥芽糖結合蛋白(MBP)組合標簽的原核表達質粒。MBP標簽由大腸桿菌K12的malE基因編碼，大小約為40KD，在大腸桿菌表達系統中可增加目的蛋白的可溶性；同時，His標簽便于重組蛋白的純化，易于進行之后的實驗。前期研究中發現，若去除HA基因的跨膜區，容易影響HA基因表達的抗原的完整性，影響其免疫原性。保留跨膜區也是為了保留HA基因的抗體完整性及其天然構象。使用pMAL-c5X載體的目的是增加目的重組蛋白的可溶性，借以保持其天然空間結構及抗原性。但用于純化含有MBP標簽重組蛋白的Amylose樹脂純化效率較低(即重組蛋白的純化效率和純化度低)，因此在上述pMAL-c5X重組質粒的基礎上，在HA基因下游引入6*His標簽基因。其目的是在后期純化過程中使用Ni2+純化填料，提高目的蛋白的純化效率。最終，本研究構建了帶有6*His-MBP組合標簽的原核表達質粒pMAL-cHA，成功獲得以可溶形式表達的HA重組蛋白。該蛋白能夠與H1N1亞型豬流感病毒HA鼠源抗體發生反應，說明了HA重組蛋白具有良好的抗原性，為H1亞型SIV抗體檢測方法的建立奠定了基礎。優選地，S2所述誘導表達的條件為IPTG0.3mM，溫度37℃，時間2小時。因此，本發明還提供所述方法獲得的豬流感病毒的血凝素重組蛋白。本發明還提供所述豬流感病毒的血凝素重組蛋白作為免疫原在制備檢測豬流感病毒的試劑中的應用。本發明以液相芯片技術為基礎，以SIVH1N1HA重組蛋白為抗原，建立一種豬流感病毒抗體檢測新方法。因此，本發明還提供一種檢測豬流感病毒的羧基化熒光微球46-HA，是將所述豬流感病毒的血凝素重組蛋白與羧基化熒光微球046(即第46號羧基化熒光微球)偶聯獲得。具體地，所述的檢測豬流感病毒的羧基化熒光微球46-HA的制備方法，包括以下步驟：S1.羧基化熒光微球的活化：將清洗后的羧基化熒光微球046分別依次重懸于磷酸氫二鈉緩沖液、Sulfo-NHS溶液和EDC溶液中進行活化；S2.活化后的羧基化熒光微球046懸液中加入豬流感病毒的血凝素重組蛋白進行孵育，并用PBS-TBN重懸即得。本發明還提供一種檢測豬流感病毒的試劑盒，所述試劑盒含有所述的豬流感病毒的血凝素重組蛋白，該豬流感病毒的血凝素重組蛋白可用于基于抗原抗體反應原理的免疫反應。優選地，所述試劑盒含有上述羧基化熒光微球46-HA，將偶聯好的微球避光保存于4℃，3個月時間內仍然具有很好的穩定性。具體地，針對利用羧基化熒光微球46-HA進行液相芯片檢測的技術，所述試劑盒還含有生物標記的雞抗鼠IgG抗體或者兔抗豬IgG抗體、鏈霉素-棗紅蛋白。更優選地，所述生物標記的雞抗鼠IgG抗體的稀釋度為1：1000，兔抗豬IgG抗體的稀釋度為1：5000，鏈霉素-藻紅蛋白的稀釋度為1：1000。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：本發明首先提供了豬流感病毒的血凝素重組蛋白的制備方法，通過去除HA的信號肽。根據HA序列設計一對帶有HIS標簽的引物，構建了帶有6*His-麥芽糖結合蛋白(MBP)組合標簽的原核表達質粒。在大腸桿菌表達系統中成功獲得以可溶形式表達的HA重組蛋白。該蛋白能夠與H1N1亞型豬流感病毒HA鼠源抗體發生反應，說明了HA重組蛋白具有良好的抗原性，利用該凝素重組蛋白建立液相芯片檢測技術，靈敏度比ELISA高，該方法的建立，將為開展豬流感病毒抗體的檢測提供必要的技術補充，為其它疫病抗體液相芯片檢測技術的研究奠定技術基礎，為多種豬病抗體多重液相芯片檢測技術的建立提供試驗依據。附圖說明圖1為HA基因的PCR擴增結果，其中，M：DL-2000標準分子量；1：樣品的PCR擴增產物。圖2為重組質粒pMAL-cHA酶切鑒定，其中，M：DL-2000標準分子量；1為重組質粒雙酶切PCR擴增產物。圖3為HA重組蛋白表達結果，其中，M：DL-2000標準分子量；1：pMAL-c5X空載體誘導前；2：pMAL-c5X空載體誘導后；3：重組質粒pMAL-cHA誘導前；4.重組質粒pMAL-cHA誘導后。圖4為HA重組蛋白可溶性分析結果，其中，M：DL-2000標準分子量；1：pMAL-c5X空載體誘導后；2：重組質粒pMAL-cHA誘導前；3：重組質粒pMAL-cHA誘導后；4：菌液超聲破碎上清；5：菌液超聲破碎沉淀。圖5為HA重組蛋白的WesternBlot分析，其中，M：DL-2000標準分子量；1：Rosetta-pMAL-cHA誘導后；2：Rosetta-pMAL-cHA誘導前。圖6為HA蛋白的純化SDS-PAGE分析，其中，M：DL-2000標準分子量；1：Rosetta-pMAL-cHA純化前；2：Rosetta-pMAL-cHA純化后。圖7為偶聯和檢測方法可行性的驗證結果。圖8為單抗稀釋梯度的檢測結果。圖9為血清稀釋梯度檢測結果。圖10為檢測方法的特異性分析。具體實施方式下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發明的范圍；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1表達質粒的構建一、流感病毒總RNA的抽提與cDNA的合成參考RNA抽提試劑盒說明書進行病毒總RNA的提取。獲得總RNA后參照寶生物工程(大連)有限公司的M-MLV反轉錄酶的使用說明書進行反轉錄操作，反應體系如表1。表1反轉錄體系試劑名稱體積RNA9.5μL5×MLVBuffer4.0μLMLV反轉錄酶1.0μLdNTPs(2.5mmoleach)4.0μLRNaseInhibitor(20U/μL)0.5μL反轉錄引物1.0μL總計20μL表1中的各試劑加入后充分混勻，于42℃水浴鍋中放置1h，獲得cDNA產物置于-20℃凍存備用。二、SIVH1N1HA基因的擴增應用Oligo7.0生物學軟件，根據SIVH1N1HA基因序列(GenBank：JN375120.1，去除表達信號肽部分的核苷酸序列)設計一對特異性引物，由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，上、下游引物加入酶切位點，且下游引物加入His標簽，引物序列為：HA-F：5’-TTGCGGCCGCGACACATTATGTATAGG-3’(NotI)；HA-R：5’-GCGTCGACATGATGATGATGATGATGAATACATATTCTACACTG-3’(SalI)；下劃線部分為引物的限制性酶切位點，限制性酶切位點名稱在引物后括號內顯示；下游引物中斜體部分為表達6×His基因序列；HA基因擴增片段長度為1,683bp。SIVH1N1HA基因的擴增反應體系如下：10×TaqBuffer2.5μL、ExTaqDNA聚合酶0.25μL、HA-F0.5μL、HA-R0.5μL、模板1μL、ddH2O20.25μL；反應條件如下：94℃預變性5min；94℃變性1min，退火溫度為55℃30s，72℃延伸2min，共30個循環，72℃終延伸7min，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，結果如圖1，HA基因片段大小與預期相符，目的片段長度為1683bp。(圖1)。三、連接、轉化與鑒定應用DNA膠回收試劑盒對首輪PCR產物進行回收，連接pMD-18T載體，轉化感受態細胞，挑取單克隆菌落培養過夜，抽提質粒并進行PCR的初步鑒定，將陽性質粒送至上海生工進行測序鑒定，陽性質粒命名為pMD-SIVHA。將重組質粒pMD-SIVHA進行NotI和SalI限制性內切酶的雙酶切，回收目的基因片段；同時對pMAL-c5X載體進行NotI和SalI雙酶切，回收酶切載體片段。利用T4連接酶將HA與pMAL-c5X載體雙酶切片段進行連接，經轉化，鑒定結果如圖2，重組質粒pMAL-cHA測序結果與目的基因的序列一致，證明重組質粒構建成功，即獲得pMAL-cHA重組質粒。實施例2重組蛋白的表達、純化與鑒定將含有重組質粒pMAL-cHA的Rosetta(DE3)大腸桿菌接種至Luria-Bertani(LB)液體培養液中，培養物OD值達0.6時加入終濃度為0.3mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃培養2小時后，收集產物進行SDS-PAGE檢測；應用Westernblot方法，以抗SIVHA單抗為一抗，對表達產物進行檢測。同時離心收集菌體，冰浴超聲破碎，再次離心后，沉淀物和上清液分別進行SDS-PAGE檢測，分析表達產物的溶解性。HA目的蛋白大小與預期相符，在約100KD處有一條目的條帶(圖3)，且目的蛋白在上清和沉淀中均有表達，說明該蛋白具有可溶性(圖4)。IPTG誘導表達后的菌液經SDS-PAGE電泳后轉至NC膜上，HA蛋白分別與各自單抗孵育，進行Western-blot分析，結果顯示HA蛋白與其單抗均可發生特異性反應，產生單一條帶(圖5)。說明了表達的目的蛋白具有抗原性，可用于基于抗原抗體反應的檢測技術的建立。一、重組蛋白的純化超聲破碎后的上清液經濾器(0.45μm)過濾，用GE填料填充的Ni2+親和層析柱過柱純化。主要操作步驟如下：放掉純化柱中20％乙醇溶液，用6倍柱體積的去離子水沖洗層析柱；用5～10倍柱體積的20mM咪唑緩沖液過柱，流速保持為每滴6s，平衡柱子；將上清液過柱，保持流速每滴6s，上清液重復過柱3遍；用10倍柱體積的20mM、80mM咪唑緩沖液洗脫雜蛋白，保持流速每滴6s；最后用500mM咪唑洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，保持流速每滴6s，每管收集1mL洗脫液。用分光光度計測定分段收集的目的蛋白的濃度并做SDS-PAGE進行純度分析，純化后的HA蛋白經SDS-PAGE分析結果如圖6。實施例3應用Rosetta-pMAL-cHA建立液相芯片檢測方法一、抗原與微球的偶聯參照Luminex公司的技術大全，兩步酰胺反應：首先磷酸化微球經磷酸氫二鈉緩沖液、Sulfo-NHS和EDC溶液成為活化狀態，其次利用實施例2制備得到的HA重組蛋白作為抗原與微球形成共價酰胺鍵，偶聯上抗原的微球用PBS-TBN溶液重懸于4℃避光保存。具體操作步驟如下：(1)漩渦儀振蕩微球懸液1min，使微球均勻散開；(2)取微球100μL轉移到1.5mL離心管中，8000g/min，2min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清(不要吸走微球)；(3)加入100μLddH2O，渦旋1min，再8000g/min，2min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清(不要吸走微球)；(4)加入80μL100mM、pH＝6.2的磷酸二氫鈉鹽溶液(NaH2PO4)，渦旋1min，重懸微球；(5)加入10μL、50mg/mL的N-羥基硫代琥珀酰亞胺(N-Hydroxysulfosuccinimiesodiumsalt-Sulfo-NHS，N-Sulfo-NHS)，和10μL50mg/mL1-乙基-3[3-(二甲氨基)丙基]碳二亞胺[1-thyl-3-(3-Dimethylaminoproy)carbodimideHydrochloride，EDC]，渦旋1min。(6)室溫孵育20min(每隔10min用漩渦儀輕振)，8000g/min，2min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清；(7)加入250μL50mM、pH＝5.0的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(2-(N-Moropholino)ethanesulfonicacid，MES)，渦旋1min，并放于磁力架上，輕輕移走上清；(8)重復步驟(7)一次；(9)將上述活化后的微球中加入100μL50mM、pH＝5.0的MES，渦旋1min，在混勻的磁珠中加入10μg的HA重組蛋白抗原，再用MES定容至500μL，渦旋1min；(10)在室溫下放在搖床上孵育2h，8000g/min，2～3min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清；(11)渦旋1min，再在搖床上孵育30min，8000g/min，2～3min離心，并放于磁力架上，輕輕移走上清；(12)再加入1mLPBS-TBN，8000g/min，2～3min離心，沉淀微球，棄上清，再重復一次；(13)加入1mLPBS-TBN，重懸微球，即得偶聯抗原的微球：46-HA(即第46號微球與HA重組蛋白偶聯)，并4℃避光保存。二、樣品上機檢測參照Luminex公司的技術大全，具體步驟如下：(1)每孔加入50μL(2500個)偶聯有抗原的微球和50μL待檢測樣品(單抗或血清)，室溫震蕩(500r/min)避光孵育1h，用PBST洗滌2次，200μL/孔；(2)加入生物素標記的雞抗鼠(1：1000)或兔抗豬(1：5000)IgG抗體100μL/孔，室溫震蕩(500r/min)避光孵育1h，用PBST洗滌2次，200μL/孔；(3)加入1：1000稀釋的鏈霉素-藻紅蛋白(SA-PE)100μL/孔，室溫震蕩(500r/min)避光孵育0.5h，用PBST洗滌2次，200μL/孔；(4)每孔加入125μL鞘液重懸，于Flex3D液相芯片檢測系統讀取中位數熒光強度(MFI)。三、偶聯效率的評價HA蛋白與46號微球偶聯，用偶聯有抗原的微球對SIV陽性血清、SIV陰性血清、PBS進行檢測，結果表明陽性血清的MFI(meanfluorescenceintensities)大于10000，且大于5倍陰性對照的MFI，空白對照的MFI小于100(圖7)，且大于5倍陰性對照的MFI，空白對照的MFI小于100(圖7)，說明該偶聯方法和檢測方法是可行的。將HA單抗從初始濃度14.6ug/mL進行2倍梯度稀釋，用液相蛋白芯片檢測方法檢測，MFI值采用SPSS軟件進行擬合三次方程。結果表明，SIV液相蛋白芯片檢測方法的相關系數(R2)為0.997，說明了曲線相關性好(圖8)。同時，當單抗濃度低至1ng/mL時，該方法仍具有高靈敏度(圖8)。四、血清稀最佳釋度的確定SIV陽性血清、SIV陰性血清用PBS-1％BSA進行梯度稀釋：1：50、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400、1：12800、1：25600，每個稀釋度3個重復，以確定血清最佳稀釋倍數。檢測結果顯示血清的最佳稀釋倍數為1：200，當血清稀釋至1：1600時，陽性血清的MFI大于臨界值，仍可檢測出陽性(圖9)。本研究建立的液相蛋白芯片檢測方法具有較高的靈敏度，當血清稀釋至1：1600，檢測結果仍為陽性。此外，MFI值隨著血清濃度稀釋呈先升高后降低的趨勢。五、特異性試驗利用上述液相蛋白技術芯片檢測方法對豬常見疾病PRRSV、SIV、HEV、CSFV、PCV-2、PRV、FMDV陽性血清進行檢測，以驗證該檢測方法的特異性。結果顯示：應用SIV液相蛋白檢測方法時，只有SIV陽性血清檢測結果為陽性，其他疾病陽性血清檢測結果為陰性(圖10)。說明本研究建立的液相蛋白芯片檢測方法特異性好，與其它病毒陽性血清無交叉反應。六、重復性試驗批內重復：取HEV4份陽性血清、1份陰性血清，每份血清10個重復，通過計算其變異系數以評價該方法的批內精密度。批間重復：取HEV11份陽性血清、1份陰性血清，每份血清3個重復，不同時間做3次，通過計算變異系數以評價該方法的批間精密度。SIV液相蛋白芯片檢測方法的批內變異系數(CV)為4.4～7.8％(表2)，批間變異系數為：2～10.6％(表3)。其平均批內變異系數為：6.2％，平均批間變異系數為：6.5％(表4)；符合Luminex精密度的要求：批內CV為不大于10％，批間CV不大于20％，說明該檢測方法具有良好的重復性。表2SIV液相蛋白芯片檢測方法批內重復試驗表3SIV液相蛋白芯片檢測方法批間重復試驗表4平均批內、批間變異系數批內(CV％)批間(CV％)SIV4.4～7.8(6.2)2～10.6(6.5)七、液相蛋白芯片與ELISA的比較采用上述液相芯片檢測方法和ELISA同時檢測臨床血清，SIV110份，通過MedCalc軟件進行ROC分析，確定最優臨界值、靈敏度、特異性。同時通過配對卡方檢驗(關聯卡方檢驗，優勢卡方檢驗)評價其符合率。結果顯示，SIV液相蛋白芯片檢測技術的靈敏度為96.6％，特異性為93.8％，臨界值為6511(表5)。表5液相蛋白芯片檢測方法ROC分析結果靈敏度(％)特異性(％)臨界值SIV96.693.86511關聯性卡方檢驗結果：SIV液相蛋白芯片法與ELISA檢測結果差異不顯著，具有一致性，能反映同一指標(表6)，液相蛋白芯片和ELISA試劑盒對110份臨床血清樣品的檢測SIV陽性率分別為30.9％、26.4％，液相蛋白芯片檢測方法的靈敏度比ELISA高，與預期相符。表6MFIA與ELISA關聯卡方檢驗結果SEQUENCELISTING<110>華南農業大學<120>一種豬H1N1的血凝素重組蛋白的制備方法及其血凝素重組蛋白和檢測試劑盒<130><160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>27<212>DNA<213>HA-F<400>1ttgcggccgcgacacattatgtatagg27<210>2<211>44<212>DNA<213>HA-R<400>2gcgtcgacatgatgatgatgatgatgaatacatattctacactg44當前第1頁1 2 3