本申請涉及禽流感病毒檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：禽流感(avianinfluenza,ai)是由正黏病毒科a型流感病毒屬中的禽流感病毒引起的發(fā)生于各種家禽和野禽的病毒性傳染病。該病于1978年在意大利雞群中首次暴發(fā)，現(xiàn)已遍布世界許多國家。由于不同禽流感病毒的ha和na有不同的抗原性，目前已發(fā)現(xiàn)有16個ha亞型和9個na亞型，此外，還從蝙蝠體內(nèi)分離到了兩種新的a型流感病毒亞型，h17n10和h18n11。根據(jù)禽流感病毒對人工感染雞的致病性，可將其分為高致病性禽流感(縮寫hpaiv)和低致病力禽流感(縮寫lpaiv)，病毒ha裂解位點的分子標(biāo)準也可作為致病性的補充依據(jù)。目前所有的高致病性禽流感病毒都屬于h5或h7亞型，低致病性禽流感病毒以h9n2亞型居多。h7n9亞型禽流感病毒是一種新型禽流感病毒，可感染禽和人。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)報告統(tǒng)計，自2013年3月中國首次報道人感染h7n9亞型禽流感以來，截止到2017年2月14日，共有1223例人感染h7n9亞型禽流感實驗室確診病例，包括至少380名死亡病例。2016年入冬以來，我國出現(xiàn)人感染該亞型病毒病例數(shù)直線上升的情況，特別是2016年12月的最后兩周，全國新增人間病例92例，死亡10例，這說明該亞型病毒對人的健康威脅仍然很大?；钋萘闶凼袌霏h(huán)境污染率與人感染病例數(shù)在時空維度表現(xiàn)一致，即隨著污染水平升高，人的感染風(fēng)險也增加。值得關(guān)注的是，2015年-2016年間報告人感染病例數(shù)位居前列的廣東、浙江、江蘇、福建等省份市也已在養(yǎng)雞場中發(fā)現(xiàn)h7n9亞型禽流感病毒。雖然目前只是散發(fā)，但對其流行態(tài)勢要高度關(guān)注。重組酶聚合酶核酸擴增技術(shù)rpa(recombinasepolymeraseamplification，rpa)被稱為是可以替代pcr的核酸檢測技術(shù)，rpa能夠在15分鐘內(nèi)進行37℃-42℃常溫下的單分子核酸檢測。rpa技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈dna結(jié)合蛋白(ssb)和鏈置換dna聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，其擴增原理是：重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-dna復(fù)合物，能在雙鏈dna中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動dna合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進行指數(shù)式擴增。被替換的dna鏈與ssb結(jié)合，防止進一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一個合成事件。整個過程進行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物。目前尚沒有h7亞型禽流感病毒的rpa檢測研究和報道。技術(shù)實現(xiàn)要素：本申請的目的是提供一種用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法和應(yīng)用。本申請采用了以下技術(shù)方案：本申請的一方面公開了一種用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑，該試劑包括引物對和探針，引物對的上游引物為seqidno.1所示序列，引物對的下游引物為seqidno.2所示序列，探針為seqidno.3所示序列或者seqidno.3所示序列的反向互補序列；seqidno.1：5’-gcaacagggatgaagaatgttcctgagattc-3’seqidno.2：5’-gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatc-3’seqidno.3：5’-gggaagaggcctatttggtgctatagcgggtttcattgaaaatggatgggaa-3’seqidno.3所示序列的探針中，第32個堿基修飾bhq1-dt、第36個堿基修飾6-fam-dt、第34個堿基替換為dspacer、3’端修飾c3spacer。需要說明的是，在熒光檢測中，探針是特異性的結(jié)合到雙鏈的其中一條鏈的，只要pcr擴增的時候，將結(jié)合的探針破壞，即可產(chǎn)生熒光信號，因此，可以采用seqidno.3所示序列的探針結(jié)合到其中一條鏈上，也可以采用seqidno.3所示序列的反向互補序列作為探針結(jié)合到另一條鏈上，探針的修飾方式不變。還需要說明的是，本申請的引物對和探針，是特別針對h7亞型禽流感病毒的rpa檢測而設(shè)計的，不同于常規(guī)pcr引物或一般的實時熒光pcr探針。此外，本申請的引物對和探針能夠特異性的檢測h7亞型禽流感病毒，而不是僅僅針對h7n9毒株設(shè)計的引物探針；也就是說，本申請的檢測試劑和方法，能夠特異性的對包括h7n9毒株在內(nèi)的所有h7亞型禽流感病毒進行檢測，即便其na基因發(fā)生變異，也不會影響本申請的檢測特異性和靈敏度。本申請的試劑包括引物對和探針，其中，探針是為了方便對rpa產(chǎn)物進行熒光檢測，可以理解，如果不是采用熒光檢測對rpa產(chǎn)物進行檢測，則整個試劑可以不包含探針，只要一對引物即可完成rpa擴增。本申請的另一面公開了本申請的用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑在h7亞型禽流感病毒檢測中的應(yīng)用。本申請的另一面公開了本申請的用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑在制備h7亞型禽流感病毒檢測試劑盒或設(shè)備中的應(yīng)用?？梢岳斫猓旧暾埖脑噭?，實際上就針對h7亞型禽流感病毒設(shè)計的特異性探針和引物對，當(dāng)然可以用于h7亞型禽流感病毒的檢測，或者用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑盒或設(shè)備。本申請的再一面公開了一種用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑盒，該試劑盒中含有本申請的用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑。本申請的再一面公開了一種用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑盒，該試劑盒中含有至少一組混合試劑，每組混合試劑由rt-rpa反應(yīng)緩沖液29.5μl、10μm的上游引物2.1μl、10μm的下游引物2.1μl和10μm的探針0.6μl組成；上游引物為seqidno.1所示序列，下游引物為seqidno.2所示序列，探針為seqidno.3所示序列或者seqidno.3所示序列的反向互補序列，并且，no.3所示序列的探針中，第27個堿基修飾bhq1-dt，第30個堿基修飾6-fam-dt，第28個堿基替換為dspacer，3’端修飾c3spacer。需要說明的是，本申請的試劑實際上是針對h7亞型禽流感病毒的rpa檢測而設(shè)計的，為了方便使用，本申請將反應(yīng)體系中使用的反應(yīng)緩沖液、引物和探針統(tǒng)一配制成混合試劑，每一組混合試劑就是一個反應(yīng)體系，直接向其中加入rna樣品、水和/或添加劑就可以進行檢測，使用簡單方便，不僅避免了配制反應(yīng)體系的繁瑣步驟，而且避免了配制反應(yīng)體系過程造成的污染。本申請試劑盒的混合試劑中，各組分的用量是在本申請的試驗條件和環(huán)境下，根據(jù)本申請的優(yōu)選實施方式而得出的，可以理解，根據(jù)不同的試驗環(huán)境，混合試劑中各組分的用量可以進行適當(dāng)調(diào)整，在此不做具體限定。本申請的再一面公開了一種用于h7亞型禽流感病毒的檢測方法，包括以下步驟：(1)提取待測樣品的核酸；(2)采用本申請的試劑盒，向試劑盒的混合試劑中加入步驟(1)提取的核酸，再加入depc水和醋酸鎂，配制成反應(yīng)溶液；(3)將步驟(2)配制的反應(yīng)溶液，在41℃恒溫反應(yīng)，整個反應(yīng)過程采集熒光信號。需要說明的是，本申請的試劑盒或者本申請的試劑，其關(guān)鍵就是針對h7亞型禽流感病毒設(shè)計的特異性的rpa檢測引物和探針，試劑盒的混合試劑，實際上就是本申請的rpa檢測反應(yīng)體系。優(yōu)選的，41℃恒溫反應(yīng)具體包括，先將步驟(2)配制的反應(yīng)溶液，在41℃保溫5min，然后取出裝反應(yīng)溶液的pcr管上下輕輕顛倒數(shù)次，瞬時離心，再繼續(xù)41℃下反應(yīng)15min，整個反應(yīng)過程采集熒光信號。需要說明的是，反應(yīng)5min后取出混勻，目的是使反應(yīng)能夠更均勻的進行。優(yōu)選的，采集熒光信號的過程中，fam熒光通道光源強度設(shè)置為28％。優(yōu)選的，本申請的檢測方法還包括，采集41℃恒溫反應(yīng)前5min各點熒光值，計算其平均值，作為第一熒光值；采集41℃恒溫反應(yīng)5min后任意時間點的熒光值，作為第二熒光值；根據(jù)熒光增量判斷待測樣品為陽性或陰性，具體的，熒光增量大于55％，且持續(xù)的時間超過2分鐘，判為陽性，否則判為陰性；熒光增量＝[(第二熒光值-第一熒光值)/第一熒光值]×100％。優(yōu)選的，步驟(1)提取待測樣品的核酸，采用magmaxtm-96viralrnaisolationkit磁珠提取試劑盒，或者trizol核酸抽提法。本申請的有益效果在于：本申請的用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑，對禽流感h7亞型具有很強的特異性，能夠準確靈敏的從眾多禽流感病毒中特異性的檢測出h7亞型，并且可以同時檢出h7亞型中的各個毒株，為h7亞型禽病毒的預(yù)防和監(jiān)控提供了一種有效的方法和途徑。并且，基于本申請的試劑或試劑盒的h7亞型禽流感病毒檢測方法，耗時短、靈敏度高、對硬件設(shè)備要求低，不需要復(fù)雜的樣本處理，特別適合于現(xiàn)場快速檢測，這對于控制流感的流行，減少經(jīng)濟損失，最大限度的保護全社會人群的健康和生命安全具有重大意義。附圖說明圖1是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應(yīng)溫度為38℃時的擴增曲線；圖2是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應(yīng)溫度為39℃時的擴增曲線；圖3是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應(yīng)溫度為40℃時的擴增曲線；圖4是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應(yīng)溫度為41℃時的擴增曲線；圖5是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應(yīng)溫度為42℃時的擴增曲線；圖6是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法fam通道的熒光強度設(shè)置為12％時的擴增曲線；圖7是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法fam通道的熒光強度設(shè)置為16％時的擴增曲線；圖8是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法fam通道的熒光強度設(shè)置為20％時的擴增曲線；圖9是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法fam通道的熒光強度設(shè)置為24％時的擴增曲線；圖10是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法fam通道的熒光強度設(shè)置為28％時的擴增曲線；圖11是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法fam通道的熒光強度設(shè)置為32％時的擴增曲線；圖12是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法的特異性檢測結(jié)果；圖13是本申請實施例中h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法的靈敏度檢測結(jié)果；圖14是本申請實施例中作為對比的h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法的靈敏度檢測結(jié)果。圖1-圖5中，1為h7亞型禽流感病毒核酸濃度0.523μg/ml的檢測曲線、2為h7亞型0.0523μg/ml的檢測曲線、3為h7亞型5.23ng/ml的檢測曲線、4為h7亞型0.523ng/ml的檢測曲線、5為h7亞型0.0523ng/ml的檢測曲線、6為h7亞型0.00523ng/ml的檢測曲線、7為h5亞型禽流感病毒核酸濃度0.262μg/ml的檢測曲線；圖6-圖11中，1為h7亞型0.0523μg/ml的檢測曲線、2為h7亞型5.23ng/ml的檢測曲線、3為h7亞型0.523ng/ml的檢測曲線、4為h7亞型0.0523ng/ml的檢測曲線、5為h7亞型0.00523ng/ml的檢測曲線、6為h7亞型0.523pg/ml的檢測曲線、7為h5亞型禽流感病毒核酸濃度0.262μg/ml的檢測曲線；圖12中，具有熒光信號的曲線由上到下依序為低致病性的h7亞型禽流感病毒核酸的檢測曲線和高致病性的h7亞型禽流感病毒核酸的檢測曲線；圖13中，1為h7亞型禽流感病毒核酸濃度0.523μg/ml的檢測曲線、2為h7亞型0.0523μg/ml的檢測曲線、3為h7亞型5.23ng/ml的檢測曲線、4為h7亞型0.523ng/ml的檢測曲線、5為h7亞型0.0523ng/ml的檢測曲線、6為h7亞型5.23pg/ml的檢測曲線、7為h5亞型禽流感病毒核酸濃度0.262μg/ml的檢測曲線；圖14中，1為h7亞型禽流感病毒核酸濃度0.523μg/ml的檢測曲線、2為h7亞型0.0523μg/ml的檢測曲線、3為h7亞型5.23ng/ml的檢測曲線、4為h7亞型0.523ng/ml的檢測曲線、5為h7亞型0.0523ng/ml的檢測曲線、6為h7亞型5.23pg/ml的檢測曲線、7為h7亞型0.523pg/ml的檢測曲線、8為h7亞型0.0523pg/ml的檢測曲線。具體實施方式下面通過具體實施例對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅對本申請進行進一步說明，不應(yīng)理解為對本申請的限制。實施例一、材料1.病毒rna本例分別采用了禽流感h3n2、h4n9、h5n1、h6n2、低致病性h7n9、高致病性h7n9、h9n2、h11n9和h1n1亞型和新城疫病毒的rna進行試驗。2.rt-rpa和qrt-pcr試劑twistamptmexolyophilizedkit(twistdx,cambridge,uk)；agpath-idtmone-steprt-pcrreagents；magmaxtm-96viralrnaisolationkit(thremofisherscientific,usa)；rpa試驗用引物及探針、實時熒光rt-pcr試驗用引物及探針均由上海生工生物工程有限公司合成。3.主要儀器設(shè)備便攜式等溫擴增熒光檢測儀(t16-iso)，購置于英國twistdx公司；abi7500-fast實時熒光pcr檢測儀，購置于美國ab公司；超微量核酸檢測儀；離心機；微量移液器。二、方法1.引物探針的設(shè)計選取禽流感h基因作為靶標(biāo)基因，采用dnastar軟件對10株h7亞型禽流感病毒株及其它亞型禽流感病毒株，包括h1、h3、h4、h5、h6、h9和h11，的h基因核苷酸全序列進行序列比對。選擇h7亞型禽流感特異性序列來設(shè)計引物和探針，并與ncbi數(shù)據(jù)庫核苷酸序列進行blast比對，確定其序列的特異性。為建立快速敏感的rpa檢測方法需要選擇合適的擴增引物，而目前無法跟實時熒光pcr方法一樣可利用商業(yè)軟件來設(shè)計并預(yù)測擴增性能。因此本例自行設(shè)計了一系列候選引物及探針，用于試驗篩選，如表1所示。此外，本例還采用了實時熒光pcr檢測作為對照，實時熒光pcr的引物和探針為oie推薦用引物與探針，如表1所示。oie為officeinternationaldesepizooties縮寫，即世界動物衛(wèi)生組織。表1引物和探針序列名稱序列(5’→3’)seqidno.h7-1026-p-1gggaagaggcctatttggtgctatagcgggtttcattgaaaatggatgggaa3h7-991-f-1gcaacagggatgaagaatgttcctgagattc1h7-1119-r1-1gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatcaattagg4h7-1119-r2-1gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatc2h7-501-f-2gtcaaacacagataatgctgcattcccgcagatg5h7-536-p-2ctaagtcatataaaaatacaagaaaaagcccagctataatagtatgggggatcc6h7-658-r1-2cccaactgtcaccagtttgtttccactcccatatag7h7-658-r2-2cccaactgtcaccagtttgtttccactccc8aiv-h7-fggcaatgcaaaatagaatacagattg9aiv-h7-pfam-cccagtcaaactaagcagcggc-bhq110aiv-h7-rccccgaagctaaaccaaagtatc11注：h7-1026-p-1探針標(biāo)記與修飾為：第32個堿基修飾bhq1-dt、第36個堿基修飾6-fam-dt、第34個堿基替換為dspacer、3’端修飾c3spacer。h7-536-p-2探針標(biāo)記與修飾為：第35個堿基修飾bhq1-dt、第37個堿基修飾6-fam-dt、第36個堿基替換為dspacer、3’端修飾c3spacer。2.病毒核酸的提取采用magmaxtm-96viralrnaisolationkit磁珠提取試劑盒提取上述病毒核酸，并用超微量核酸檢測儀測定核酸濃度，作為rpa試驗用樣品模板。3.引物和探針篩選以提取的低致病性h7n9和高致病性h7n9病毒的核酸作為模板，將設(shè)計好的引物，從h7-991-f-1和h7-501-f-2中任選一個作為上游引物，從h7-1119-r1-1、h7-1119-r2-1、h7-658-r1-2和h7-658-r2-2中任選一個作為下游引物，上游引物和下游引物兩兩配對，再分別配以h7-1026-p-1探針、h7-536-p-2探針，進行rt-rpa反應(yīng)，篩選快速敏感的最佳引物對和探針。rt-rpa反應(yīng)體系為：反應(yīng)緩沖液(即rehydrationbuffer)29.5μl，然后加入10μm濃度的上、下游引物各2.1μl，10μm濃度的探針0.6μl，再加入模板及depc水13.2μl，共47.5μl，混勻，加入280mm醋酸鎂2.5μl，反應(yīng)體系共計50μl。反應(yīng)條件為：在38℃保溫5min，然后取出裝反應(yīng)溶液的pcr管上下輕輕顛倒數(shù)次，瞬時離心，再繼續(xù)38℃下反應(yīng)15min，整個反應(yīng)過程采集熒光信號。fam通道的熒光強度設(shè)置為20％。4.rt-rpa反應(yīng)體系與條件的優(yōu)化(1)rt-rpa反應(yīng)體系的配置取出twistamptmexolyophilizedkit試劑盒反應(yīng)管并置于冰上，里面含有白色固體小顆粒，為凍干混合酶，包括能結(jié)合單鏈核酸即寡核苷酸引物的重組酶、單鏈dna結(jié)合蛋白(縮寫ssb)和鏈置換dna聚合酶，加入試劑盒中的反應(yīng)緩沖液(即rehydrationbuffer)29.5μl，然后加入10μm濃度的上、下游引物各2.1μl，10μm濃度的探針0.6μl，再加入模板及depc水13.2μl，共47.5μl，混勻，加入280mm醋酸鎂2.5μl，反應(yīng)體系共計50μl，混勻后放入t16-iso儀器后開始試驗。(2)rt-rpa反應(yīng)條件的基本設(shè)置將配置好的反應(yīng)混合液置于t16-iso儀器中，設(shè)置反應(yīng)程序，38-42℃反應(yīng)5min，然后從儀器中取出pcr管上下輕輕顛倒數(shù)次，迅速置于離心機上2000rpm/min，離心30s，放入t-16中繼續(xù)在38-42℃下反應(yīng)15min。設(shè)置熒光通道光源強度，并在整個反應(yīng)過程收集fam熒光信號。rt-rpa反應(yīng)條件的優(yōu)化具體如下：本例將提取到的低致病性h7亞型禽流感病毒核酸作6個10倍系列稀釋，再加上陰性對照的h5亞型禽流感病毒核酸，共計7個樣品模板，采用優(yōu)化好的引物對與探針組合，配置反應(yīng)體系。其中，h7亞型禽流感病毒核酸的6個10倍系列稀釋的濃度分別為，0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml、0.00523ng/ml；h5亞型禽流感病毒核酸的濃度為0.262μg/ml。反應(yīng)程序的優(yōu)化具體如下：將配置好的反應(yīng)管放入t-16儀器中，在38℃反應(yīng)5min，然后從儀器中取出pcr管上下輕輕顛倒數(shù)次，迅速置于離心機上2000rpm/min，離心30s，再放入t-16中繼續(xù)反應(yīng)15min，整個反應(yīng)過程全程收集fam熒光。取同樣的反應(yīng)體系和樣品數(shù)量，將反應(yīng)溫度分別設(shè)置為38℃、39℃、40℃、41℃和42℃，其它條件均不變，篩選出最優(yōu)的反應(yīng)溫度。fam通道的熒光強度的優(yōu)化具體如下：采用優(yōu)化的反應(yīng)溫度，并取同樣的反應(yīng)體系和樣品數(shù)量，設(shè)置led燈fam通道的熒光強度，分別設(shè)置為12％、16％、20％、24％、28％和32％六個不同的熒光強度進行檢測，篩選出最優(yōu)的led燈fam通道的熒光強度值。5.rt-rpa方法判定標(biāo)準的設(shè)定將上述各樣品的反應(yīng)結(jié)果按下列公式進行計算：首先，采集恒溫反應(yīng)前5min各點熒光值，計算其平均值，作為第一熒光值；然后采集5min后任意時間點的熒光值，作為第二熒光值。檢測各時間點熒光強度增加百分數(shù)，即熒光增量＝[(第二熒光值-第一熒光值)/第一熒光值]×100％。分析各稀釋度樣品的熒光強度增加值，以及陰性樣品的熒光強度增加值，選取合適的熒光強度增加值作為臨界閾值，設(shè)定本例檢測方法的判定標(biāo)準。6.rt-rpa方法特異性試驗以提取的h3n2、h4n9、h5n1、h6n2、低致病性h7n9、高致病性h7n9、h9n2、h11n9和h1n1亞型和新城疫病毒的rna為模板，采用篩選的引物對和探針，以及優(yōu)化的反應(yīng)條件進行h7亞型禽流感病毒rpa特異性檢測。7.rt-rpa方法靈敏性試驗本例將提取到的低致病性h7亞型禽流感病毒核酸作8個10倍系列稀釋，再加上陰性對照的h5亞型禽流感病毒核酸，共計9個樣品模板，采用優(yōu)化好的引物對與探針組合，配置反應(yīng)體系，并按照優(yōu)化的反應(yīng)條件進行h7亞型禽流感病毒rpa靈敏度檢測。其中，h7亞型禽流感病毒核酸的8個10倍系列稀釋的濃度分別為，0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml、0.00523ng/ml、0.523pg/ml、0.0523pg/ml；h5亞型禽流感病毒核酸的濃度為0.262μg/ml。同時，采用相同的9份核酸樣品作為模板，以oie推薦用引物與探針，按照其方法進行實時熒光檢測，比較本例的rpa方法和現(xiàn)有的實時熒光rt-pcr方法兩者的檢測靈敏度。8.rt-rpa方法的初步應(yīng)用采集來自多地養(yǎng)殖場、活禽交易市場的雞泄殖腔拭子和咽拭子30份，以及標(biāo)準毒株5份，分別采用oie推薦用引物與探針，和本例的rpa檢測方法，對采集的樣品進行檢測，比較兩者的符合性。三、結(jié)果1.引物對和探針的篩選將設(shè)計好的引物采取兩兩搭配的方式組合，篩選出快速敏感的最佳引物對和探針，本例的篩選結(jié)果顯示，在相同的條件下，h7-991-f-1和h7-1119-r2-1引物對，配合h7-1026-p-1探針，其敏感度最高，即在相同的時間點，熒光增量更大。2.最佳反應(yīng)條件的確定(1)不同反應(yīng)溫度rpa試驗結(jié)果反應(yīng)溫度設(shè)置為38℃時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量，即熒光增量；qrt-rpa試驗具體結(jié)果見表2，擴增曲線結(jié)果見圖1。表2h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應(yīng)溫度為38℃時的熒光值結(jié)果表2中，熒光值1為相應(yīng)時間下h7亞型禽流感病毒核酸濃度為0.523μg/ml時檢測的熒光值，熒光值1后面對應(yīng)的熒光增量，即在相應(yīng)時間下，熒光值1相對于恒溫反應(yīng)前5min各點熒光值的平均值的增量。熒光值2、3、4、5依序為h7亞型禽流感病毒核酸濃度為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml的熒光值。以下表3至表6都與表2相同。反應(yīng)溫度設(shè)置為39℃時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量，即熒光增量；qrt-rpa試驗具體結(jié)果見表3，擴增曲線結(jié)果見圖2。表3h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應(yīng)溫度為39℃時的熒光值結(jié)果反應(yīng)溫度設(shè)置為40℃時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結(jié)果見表4，擴增曲線結(jié)果見圖3。表4h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應(yīng)溫度為40℃時的熒光值結(jié)果反應(yīng)溫度設(shè)置為41℃時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結(jié)果見表5，擴增曲線結(jié)果見圖4。表5h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應(yīng)溫度為41℃時的熒光值結(jié)果反應(yīng)溫度設(shè)置為42℃時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.523μg/ml、0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml和0.0523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結(jié)果見表6，擴增曲線結(jié)果見圖5。表6h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法反應(yīng)溫度為42℃時的熒光值結(jié)果本例選取0.0523ng/ml濃度陽性樣品的擴增效率來選擇最優(yōu)的反應(yīng)溫度，從實驗結(jié)果來看，0.0523ng/ml濃度的h7亞型禽流感病毒核酸樣品在反應(yīng)溫度設(shè)置為41℃時，其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加百分數(shù)更大。因此，本例建立的檢測h7亞型禽流感病毒qrt-rpa方法的最佳反應(yīng)程序為：將配置好的反應(yīng)體系放入溫度設(shè)置為41℃的t-16儀器中反應(yīng)5min，然后從儀器中取出pcr管上下輕輕顛倒數(shù)次，迅速置于離心機上2000rpm/min，離心30s，再放入t-16儀器中，繼續(xù)在41℃下反應(yīng)15min。整個反應(yīng)過程全程收集fam熒光。(2)不同光源強度下的rpa試驗結(jié)果本例將led燈fam通道的熒光強度設(shè)置為12％時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量，即熒光增量；qrt-rpa試驗具體結(jié)果見表7，擴增曲線結(jié)果見圖6。表7h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法熒光強度為12％時的熒光值結(jié)果表7中，熒光值1為相應(yīng)時間下h7亞型禽流感病毒核酸濃度為0.0523μg/ml時檢測的熒光值，熒光值1后面對應(yīng)的熒光增量，即在相應(yīng)時間下，熒光值1相對于恒溫反應(yīng)前5min各點熒光值的平均值的增量。熒光值2、3、4、5依序為h7亞型禽流感病毒核酸濃度為5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml的熒光值。以下表8至表12都與表7相同。將led燈fam通道的熒光強度設(shè)置為16％時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結(jié)果見表8，擴增曲線結(jié)果見圖7。表8h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法熒光強度為16％時的熒光值結(jié)果將led燈fam通道的熒光強度設(shè)置為20％時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結(jié)果見表9，擴增曲線結(jié)果見圖8。表9h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法熒光強度為20％時的熒光值結(jié)果將led燈fam通道的熒光強度設(shè)置為24％時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結(jié)果見表10，擴增曲線結(jié)果見圖9。表10h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法熒光強度為24％時的熒光值結(jié)果將led燈fam通道的熒光強度設(shè)置為28％時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結(jié)果見表11，擴增曲線結(jié)果見圖10。表11h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法熒光強度為28％時的熒光值結(jié)果將led燈fam通道的熒光強度設(shè)置為32％時，核酸模板為h7亞型禽流感病毒核酸，其濃度分別為0.0523μg/ml、5.23ng/ml、0.523ng/ml、0.0523ng/ml和0.00523ng/ml時的實時熒光值，以及5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加量。qrt-rpa試驗具體結(jié)果見表12，擴增曲線結(jié)果見圖11。表12h7亞型禽流感病毒qrt-rpa檢測方法熒光強度為32％時的熒光值結(jié)果本文選取0.0523ng/ml和0.00523ng/ml濃度陽性樣品的擴增效率來綜合分析fam熒光通道光源強度的最優(yōu)設(shè)置，從實驗結(jié)果來看，0.0523ng/ml濃度樣品在熒光強度設(shè)置時，fam通道強度占led光源強度的28％時，其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加百分數(shù)更大；而0.00523ng/ml濃度樣品在熒光強度設(shè)置時，fam通道強度占led光源強度的32％時，其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加百分數(shù)更大，但0.0523ng/ml濃度樣品在熒光強度設(shè)置時，fam通道強度占led光源強度的32％時，其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加百分數(shù)出現(xiàn)降低。綜合分析，本文在建立檢測h7亞型禽流感病毒qrt-rpa方法時，fam熒光通道光源強度設(shè)置成28％為最佳。3.結(jié)果判定標(biāo)準的設(shè)置根據(jù)上述實驗結(jié)果選取最佳反應(yīng)條件及設(shè)置，其中最佳反應(yīng)溫度為41℃，fam通道強度設(shè)置為占led光源強度28％時，按熒光增量＝[(第二熒光值-第一熒光值)/第一熒光值]×100％計算出圖4和圖10中最低濃度陽性樣品的最大熒光增加值為63％和53％，其中圖4增加值超過55％時持續(xù)時間為2分鐘。另外，在后續(xù)的應(yīng)用試驗中，本例采集的30份陰性雞咽拭子樣品，提取核酸后按最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行試驗，結(jié)果其5分鐘后的熒光值與前5分鐘的熒光平均值之比的增加值均低于15％，因此本例將試驗結(jié)果判定標(biāo)準設(shè)定為：試驗5分鐘后的采集點熒光值與前5分鐘采集到的各點熒光值的平均值之比，即熒光增量大于55％，且持續(xù)的時間超過2分鐘，則判為陽性；否則判為陰性。4.rt-rpa方法特異性試驗結(jié)果本例qrt-rpa試驗特異性檢測結(jié)果見圖12，結(jié)果顯示，只有高致病性h7亞型禽流感病毒和低致病性h7亞型禽流感病毒出現(xiàn)了擴增，其他亞型h1、h3、h4、h5、h6、h9和h11亞型流感病毒、新城疫病毒樣品未見有擴增。5.rt-rpa方法靈敏性試驗結(jié)果本例qrt-rpa試驗靈敏性檢測結(jié)果見圖13，結(jié)果顯示，本例建立的檢測h7亞型禽流感病毒qrt-rpa方法的檢測靈敏度可達0.00523ng/ml。取相同的9個核酸樣品，采用oie推薦用引物、探針和實時熒光pcr方法檢測，結(jié)果見圖14，結(jié)果顯示，oie推薦的實時熒光pcr檢測方法靈敏度可達0.00523ng/ml?？梢姡纠挠糜趆7亞型禽流感病毒檢測的引物對和探針，及rpa檢測方法，與目前使用的oie推薦的實時熒光pcr方法相比，靈敏度相當(dāng)，而本例的rpa檢測方法所用的時間大大縮短，所需設(shè)備也簡便，適合于野外現(xiàn)場檢測。6.rt-rpa檢測方法田間樣本應(yīng)用本例對采集的30份雞泄殖腔拭子和咽拭子，以及5份標(biāo)準毒株，分別采用oie推薦的引物與探針，和本例的rpa檢測方法，進行檢測。結(jié)果顯示，兩個檢測方法的結(jié)果一致，30份雞泄殖腔拭子和咽拭子為陰性，5份標(biāo)準毒株為陽性?？梢姡纠膔pa檢測方法可以替代現(xiàn)有的實時熒光pcr檢測方法。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本申請所作的進一步詳細說明，不能認定本申請的具體實施只局限于這些說明。對于本申請所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本申請構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本申請的保護范圍。sequencelisting<110>深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心華南農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>用于h7亞型禽流感病毒檢測的試劑、檢測方法和應(yīng)用<130>17i24394<160>11<170>patentinversion3.3<210>1<211>31<212>dna<213>人工序列<400>1gcaacagggatgaagaatgttcctgagattc31<210>2<211>32<212>dna<213>人工序列<400>2gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatc32<210>3<211>52<212>dna<213>人工序列<400>3gggaagaggcctatttggtgctatagcgggtttcattgaaaatggatgggaa52<210>4<211>39<212>dna<213>人工序列<400>4gcattctggtgtctgaaaccataccaaccatcaattagg39<210>5<211>34<212>dna<213>人工序列<400>5gtcaaacacagataatgctgcattcccgcagatg34<210>6<211>54<212>dna<213>人工序列<400>6ctaagtcatataaaaatacaagaaaaagcccagctataatagtatgggggatcc54<210>7<211>36<212>dna<213>人工序列<400>7cccaactgtcaccagtttgtttccactcccatatag36<210>8<211>30<212>dna<213>人工序列<400>8cccaactgtcaccagtttgtttccactccc30<210>9<211>26<212>dna<213>人工序列<400>9ggcaatgcaaaatagaatacagattg26<210>10<211>22<212>dna<213>人工序列<400>10cccagtcaaactaagcagcggc22<210>11<211>23<212>dna<213>人工序列<400>11ccccgaagctaaaccaaagtatc23當(dāng)前第1頁12