本發明涉及一種細菌基因指紋圖譜的制備方法，具體的說涉及一種應用LH-PCR技術制備細菌性陰道病的細菌基因指紋圖譜的方法。

背景技術：

細菌性陰道病(Bacterial Vaginosis，BV)是由細菌引起的陰道感染，是育齡期女性常見的下生殖道感染性疾病，其可引發多種不良妊娠結局，如自然流產、早產、羊水感染、產后子宮內膜炎和剖腹產切口感染及圍產兒并發癥等。近年來的研究發現，細菌性陰道病的復發和持續感染還能增加滴蟲性陰道炎、白假絲酵母菌性陰道炎、宮頸癌和人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)的風險。

目前對細菌性陰道病的病因，特別是對細菌性陰道病患者的陰道菌群構成的差異，缺乏深入研究。以往使用的培養法并不能全面地反映陰道菌群的構成，導致對細菌性陰道病患者的病原菌研究受到局限，有時患者臨床評價雖已是治愈狀態，但其陰道菌群構成卻還沒有恢復到正常狀態，致病菌仍存在，此時如僅通過臨床評價停止治療，則會導致細菌性陰道病復發，耽誤疾病治療，增加疾病的復發率。

隨著近20年來分子生物學技術的快速發展，使用分子生物學方法研究細菌性陰道病復發的機理和細化診斷臨床不同細菌性陰道病亞型成為一種趨勢，人們對細菌性陰道病的菌群結構研究也在不斷深入。長度多態片段PCR(length heterogeneity PCR，LH-PCR)是運用熒光標記的探針來決定來源于不同微生物擴增序列的相對數量，帶標記的片段通過毛細管電泳被分離出來，而后被一個帶有熒光性的自動基因序列分析儀所監測到。LH-PCR是一種分析微生物結構的方法，其原理是由于基因或基因操縱子的插入或剪切造成某些特定基因固有長度呈現多態性。因此，可以利用這種多態性來確定微生物的種群信息。LH-PCR測定的超變量區域主要存在于核糖體的小亞基(rrn)。

LH-PCR作為一種基于PCR的分子指紋圖譜技術，其與高通量測序技術相比具有技術操作靈敏，快速簡單，成分低廉等的優點。但是，目前尚未有將該技術應用于醫學領域，尤其是將其作為一種疾病的診斷技術的報道。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種應用LH-PCR技術，制備細菌性陰道病的細菌基因指紋圖譜的方法，以及應用該細菌基因指紋圖譜精確判斷樣品中是否存在細菌性陰道病致病菌群的用途。本發明所述的細菌基因指紋圖譜能用于細菌性陰道病的臨床快速診斷，避免傳統的細菌分離培養的診斷不準確、操作繁瑣、耗時長、工作量大以及高通量測序價格昂貴等缺點，能夠準確、快速有效地檢測陰道內的菌群分布狀況。

為達到上述目的，本發明提供一種細菌性陰道病的LH-PCR細菌基因指紋圖譜的制備方法，其中所述細菌為陰道內細菌，所述基因為16S rRNA基因。

進一步的，所述細菌性陰道病的LH-PCR細菌基因指紋圖譜的制備方法，是對擴增片段長度為310-380bp的基因片斷進行分析。

更進一步的，所述細菌性陰道病的LH-PCR細菌基因指紋圖譜的制備方法，其中當片段長度340-374bp中的任何一個片斷的相對峰面積大于10％時，確定為有細菌性陰道病致病菌群存在；當片段長度340-374bp中所有片段的相對峰面積都小于10％，確定為正常菌群，沒有細菌性陰道病致病菌群存在。

優選的，所述細菌性陰道病的LH-PCR細菌基因指紋圖譜的制備方法，其中LH-PCR的引物為：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，其中5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'的5'端用FAM熒光標記。

進一步的，所述細菌性陰道病的LH-PCR細菌基因指紋圖譜的制備方法，包括：

1.提取陰道分泌物的細菌基因組DNA；

2.對細菌基因組DNA中的16S rRNA基因進行PCR擴增：

引物：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，和

5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'，其中5'端用FAM熒光標記；

PCR的反應體系(50μL)：10×緩沖液5μL，dNTPs1μL，引物各1.5μL，DNA聚合酶1μL，BSA2.5μL，模板DNA1μL，ddH₂O補足50μL；同時設置不添加模板的陰性對照；

反應程序：95℃預變性5min，94℃變性45s，55℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環，最后于4℃恒溫保存；

3.毛細管電泳LH-PCR產物：

將所述PCR產物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳進行富集，收集300-400bp的片斷；然后用Qiagen凝膠回收純化，并與Hi-Di甲酰胺及GS500 Liz內部尺寸標準混合，混合物在PCR儀中在95℃下變性5min，再進行毛細管電泳檢測，注射時間為10s，注射和運行電壓為15.0kV，運行溫度為60℃，運行時間為70min；

4.毛細管電泳圖譜的分析

將樣品的指紋電泳圖譜用GeneScan 3.7進行收集，LH-PCR數據運用BioNumerics 6.0軟件進行處理，對擴增片段長度為310-380bp的片斷進行分析。

優選的，所述細菌性陰道病的LH-PCR細菌基因指紋圖譜的制備方法，其中所述細菌的種類選自Mycobacterium、Ureaplasma、Mycoplasma、Sneathia、Corynebacterium、Atopobium、Gardnerella、Mobiluncus、Prevotella、Actinomyces、Staphylococcus、Anaerococcus、Peptoniphilus、Megasphaera、Lactobacillus。

優選的，所述細菌性陰道病的LH-PCR細菌基因指紋圖譜的制備方法，其中所述細菌種類和對應的擴增片段長度為：

本發明還提供了一種應用上述制備方法制備的細菌基因指紋圖譜在診斷細菌性陰道病中的用途。

本發明還提供了一種應用上述制備方法制備的細菌基因指紋圖譜在判斷樣品中是否存在細菌性陰道病致病菌群中的用途。

本發明還提供了一種應用上述制備方法制備的細菌基因指紋圖譜在判斷樣品中是否存在Mycobacterium、Ureaplasma、Mycoplasma、Sneathia、Corynebacterium、Atopobium、Gardnerella、Mobiluncus、Prevotella、Actinomyces、Staphylococcus、Anaerococcus、Peptoniphilus、Megasphaera、Lactobacillus細菌中的應用。

任何的指紋圖譜技術都是為了提供一個菌群的整體情況，而不是區分每個單獨的菌種。因此，其主要是反映出環境中菌群結構的演變或差異，以分析出疾病狀態與菌群結構的相關性。LH-PCR通過分析峰形變化，較容易跟蹤菌群結構的變化，可以精確的分析出陰道分泌物的菌群結構，可對主要致病菌進行分類與鑒定。且該方法操作相對簡單，較少的操作步驟減少了誤差產生概率，因此重現性非常好。此外，LH-PCR與高通量測序及其他指紋圖譜技術如T-RFLP(末端限制性酶切多態性檢測，Terminal restriction fragment length polymorphism)相比，PCR產物不需要進行限制性酶切，可以直接進行基因分析，即可得到微生物種群的構成信息，具有成本低，操作簡便快速的優點，同時相對于Amsel標準和Nugent評分來說又可以精確的分析出陰道分泌物的菌群結構，因此可作為分子生物學技術應用于臨床分析陰道菌群變化，在臨床上可通過構建不同的LH-PCR圖譜對疾病狀態進行分類診斷。

附圖說明

圖1：D0組(0)、SG-D7組(1)、FG-D7組(2)、SG-D30組(3)、FG-D30組(4)5組樣品的LH-PCR特征峰的主成分分析結果(Principal Component Analysis，PCA)。

圖2：D0組(0)、SG-D7組(1)、FG-D7組(2)、SG-D30組(3)、FG-D30組(4)5組樣品的LH-PCR特征峰；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

圖3：實施例2患者1用藥前(D0)的LH-PCR圖譜；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

圖4：實施例2患者1用藥后7天(D7)的LH-PCR圖譜；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

圖5：實施例2患者1用藥后30天(D30)的LH-PCR圖譜；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

圖6：實施例2患者2用藥前(D0)的LH-PCR圖譜；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

圖7：實施例2患者2用藥后7天(D7)的LH-PCR圖譜；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

圖8：實施例2患者2用藥后30天(D30)的LH-PCR圖譜；橫軸為片段長度，縱軸為每一種片段長度的相對峰面積(單位％)。

具體實施方式

下面實施例對本發明進一步詳細說明，本領域技術人員應當意識到在不脫離本發明的范圍和精神的情況下所作的改動，均屬于本發明的范圍。

細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)購自：天根生化科技有限公司。

所有數據均使用SPSS15.0(Chicago，IL，USA)進行分析，如果P<0.05，說明數據存在統計學差異。

實施例1：應用LH-PCR技術制備細菌性陰道病的細菌基因指紋圖譜

1.研究對象及標準：

1.1 研究對象：選取63例診斷為細菌性陰道病的育齡期女性，規范使用甲硝唑凝膠治療5天，并在用藥前(0天)、用藥后7天、用藥后30天取樣。

1.2 入組標準：采用Amsel臨床診斷標準和Nugent實驗室診斷標準診斷細菌性陰道病(Bacterial Vaginosis，BV)。所有的分泌物涂片均由微生態實驗室2名有經驗的微生物專家判讀。

1.3 排除標準：

①妊娠期、哺乳期和絕經期女性

②因其他疾病長期服用激素類藥物者

③服用免疫抑制劑者

④有心、肝、腎、內分泌等內科疾病者(主要通過問診)

⑤患有滴蟲、外陰陰道白假絲酵母菌病等其它陰道感染者

⑥甲硝唑過敏者

⑦依從性差者

1.4 隨訪時間：對入組的BV患者進行兩次隨訪，分別為用藥后7天、用藥后30天。記錄患者每次就診時的癥狀、體征、pH值及Nugent評分。

1.5 治療方法和治愈標準：入組的BV患者使用甲硝唑凝膠(37.5mg，qd，陰道上藥)，連續給藥5天。在用藥后第7天和第30天分別隨訪，評價治療效果。治愈標準：同時滿足微生態評價痊愈標準和臨床評價痊愈標準為治愈。微生態評價痊愈標準：Nugent評分0-3分。臨床痊愈標準：陰道分泌物性狀正常，Whiff試驗陰性，線索細胞消失，陰道分泌物pH值<4.5。

2.樣品制備：

2.1.樣本采集：分別用兩個無菌棉拭子從研究對象陰道側壁上1/3處取得陰道分泌物，一個迅速放入含有1ml PBS(pH:7.4)無菌離心管中，放于-80℃超低溫冰箱以便基因組提取。另一個均勻涂在載玻片上，行革蘭染色，油鏡下觀察，進行Nugent評分。

2.2.細菌基因組DNA的提取(應用天根生化科技有限公司的細菌基因組提取劑盒及其內試劑)：

1)取凍存陰道分泌物，10000rpm(約11500×g)離心1min，盡量吸凈上清。

2)加入180μl緩沖液(20mM Tris，pH 8.0；2mMNa2-EDTA；1.2％Triton)；終濃度為20mg/ml的溶菌酶(溶菌酶用溶菌酶干粉溶解在緩沖液中進行配制)，37℃處理30min以上。

3)向管中加入20μl蛋白酶K溶液，混勻。

4)加入220μl緩沖液GB，振蕩15sec，70℃放置10min，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。

5)加220μl無水乙醇，充分振蕩混勻15sec，出現絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。

6)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm(約13400×g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

7)向吸附柱CB3中加入500μl緩沖液GD(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm(約13400×g)離心30sec，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。

8)向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12000rpm(約13400×g)離心30sec，倒掉廢液，吸附柱CB3放入收集管中。

9)重復操作步驟8。

10)將吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm(約13400×g)離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液(這一步的目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶反應(酶切、PCR等)實驗)。

11)將吸附柱CB3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5min，12000rpm(約13400×g)離心2min，將溶液收集到離心管中。

12)加入4μl RNase A(100mg/ml)溶液，振蕩15sec，室溫放置5min。

2.3. DNA濃度及純度檢測：

分別用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測總基因組DNA的濃度和純度，測得所有樣本DNA在OD260處均有顯著吸收峰，DNA濃度大于10ng/μl，總量大于0.1μg且OD260/OD280比值均在1.8-2.0之間，說明步驟2.1所提取的DNA濃度和純度符合PCR和毛細管電泳的實驗要求。

3.應用LH-PCR技術制備細菌基因指紋圖譜的步驟

3.1.細菌PCR擴增

選用引物

fD1(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和

5'FAM-PRUN518r(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')

擴增細菌16S rRNA基因，其中5'FAM-PRUN518r的5'端用FAM熒光標記。

PCR的反應體系(50μL)：10×緩沖液5μL，dNTPs1μL，引物各1.5μL，DNA聚合酶1μL，BSA2.5μL，模板DNA1μL，ddH₂O補足50μL。

同時設置不添加模板的陰性對照。

反應程序為：95℃預變性5min，94℃變性45s，55℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環，最后于4℃恒溫保存。

3.2.毛細管電泳LH-PCR產物

將步驟3.1的PCR產物用1.0％瓊脂糖凝膠電泳進行富集，收集300-400bp的片斷。然后用Qiagen凝膠純化試劑盒切膠回收純化，并與Hi-Di甲酰胺及GS500Liz內部尺寸標準混合，混合物先放入PCR儀(Peltier Thermal Cycler DNAEngine)，在95℃下變性5min，立刻放入冰盒中。再放入ABI PRISM 310遺傳分析儀(Applied Biosystems，美國)中進行毛細管電泳檢測，注射時間為10s，注射和運行電壓為15.0kV，運行溫度為60℃，運行時間為70min。

3.3.毛細管電泳圖譜的分析

每個樣品的指紋電泳圖譜用GeneScan 3.7進行收集。LH-PCR數據運用BioNumerics 6.0軟件進一步處理。電泳圖譜轉換為BioNumerics曲線格式，并且使用規范化的內部尺寸標準，對擴增片段長度為310-380bp的片斷進行分析。

4.細菌基因指紋圖譜制備

4.1.樣品數據分組：

按步驟1.5對63例研究對象連續給藥5天，在用藥后第7天隨訪，臨床評價均為治愈；在用藥后第30天隨訪，42名治愈未復發，21名復發，治愈率為66.67％。

上述63例研究對象，每例分別在第0天、第7天、第30天取3次樣，共189個樣品。根據上述治療結果，樣品數據共分為5組：

0組：D0組(用藥前患者取樣的樣品，供63例)、

1組：SG-D7組(用藥后30天未復發的患者在7天時取樣的樣品，共42例)、

2組：FG-D7組(用藥后30天復發的患者在7天時取樣的樣品，共21例)、

3組：SG-D30組(用藥后30天未復發的患者在30天時取樣的樣品，共42例)、

4組：FG-D30組(用藥后30天復發的患者在30天時取樣的樣品，共21例)。

4.2. LH-PCR特征峰

通過對189個(63個患者，每個患者取樣3次)陰道分泌物樣本進行LH-PCR擴增片段進行分析，發現LH-PCR的掃描峰主要集中340-375bp，但是不同樣品數據組的LH-PCR特征峰各不相同。

圖1顯示的D0組、SG-D7組、FG-D7組、SG-D30組、FG-D30組這5組樣品的LH-PCR特征峰的主成分分析結果(Principal Component Analysis，PCA)，從圖1中可以看出：

針對D30的樣品，SG-D30組群(實心圓圈)和FG-D30組群(空心圓圈)的陰道微生物群落明顯的分成了兩個集群，說明治愈組(未復發組)和復發組的集落明顯不同；

FG-D30組群(空心圓圈)與D0組(空心方塊)的微生物群落分布相重疊，說明復發組和未治療組的集落具有相似性；

SG-D7組(實心三角)和FG-D7組(空心三角)的樣本分布存在部分重疊，卻又不完全相同，說明即便是第7天時臨床評價同為治愈，后續復發的和未復發的樣品集落在中間狀態中也存在差異。

因此，基于本發明形成的LH-PCR特征峰，可以通過對BV和健康女性陰道內微生物菌群的主成分分析，明顯區分出不同時間點時陰道菌群的差異，能將疾病與健康狀態下的陰道菌群明顯的區分開來。

進一步對LH-PCR特征峰進行Kruskal Wallis Test檢驗，結果見圖2和表1。圖2顯示的是D0組、SG-D7組、FG-D7組、SG-D30組、FG-D30組這5組樣品的LH-PCR特征峰。在每一組峰譜中，縱軸為每一個片段的相對峰面積，橫軸為14個通過Kruskal Wallis Test檢驗后有顯著性差異的片段長度，自左到右依次為340bp、341bp、343bp、344bp、345bp、347bp、349bp、353bp、354bp、356bp、361bp、363bp、368bp、375bp。表1顯示的是這14個片段長度的相對峰面積的四分位數間距。

表1 具有顯著性差異的片段長度的相對峰面積的四分位數間距

從圖2和表1的結果可以計算出，當片段長度340-374bp中的任何一個片斷的相對峰面積(四分位數間距)大于10％時，確定為有細菌性陰道病致病菌群存在；當片段長度340-374bp中所有片段的相對峰面積(四分位數間距)都小于10％，確定為正常菌群，沒有細菌性陰道病致病菌群存在。

為了確定產生顯著性差異的基因片段長度所對應的細菌種類，申請人將LH-PCR的分析結果與高通量測序結果進行了對比比較。

其中高通量測序是使用標準的454/Roche GS-FLX方案完成對16S rRNA基因V1-V3區的測序工作。高通量測序共產生了1,622,359條高質量的reads，每個樣本平均有8071條序列(3424–18517)。所有樣本共檢測到8967個OTU(操作分類單元，operation taxonomy units)，并且每個樣本的OTUs數在54–706之間。在對原始序列進行篩選后，通過比對RDP數據庫完成細菌種類的比較。最終確認差異片段長度所對應的細菌種類為表2所示：

表2 細菌種類和對應的片段長度

實施例2：應用本發明LH-PCR圖譜進行細菌性陰道病診斷

患者1：

用藥前(0天)LH-PCR圖譜(圖3)顯示有343bp、353bp、366bp三處相對峰面積大于10％，因此診斷為患有細菌性陰道病。同時進行微生態評價和臨床標準評價進行驗證，其Nugent評分為9，陰道分泌物稀薄，有魚腥臭味，Whiff試驗陽性，線索細胞陽性，陰道分泌物pH值為5.1，臨床診斷為患有細菌性陰道病，與通過本發明LH-PCR基因指紋圖譜診斷的結果一致。

對該患者規范使用甲硝唑凝膠治療5天，在用藥后7天再對其進行分析，此時該患者的微生態評價和臨床標準評價顯示其BV已治愈，通過LH-PCR圖譜(圖4)分析，顯示片段長度340-374bp中所有片段的相對峰面積<10％，根據實施例1的圖譜分析，說明此時患者已治愈，并且菌群恢復到正常狀態，沒有致病菌存在，預測其沒有復發風險。

在用藥后30天，第3次進行LH-PCR分析，圖譜(圖5)顯示片段長度340-374bp中所有片段的相對峰面積<10％，診斷為其細菌性陰道病未復發，已治愈。同時對30天時的樣品也進行微生態評價和臨床標準評價進行驗證，其Nugent評分為1，陰道分泌物性狀正常，Whiff試驗陰性，線索細胞陰性，陰道分泌物pH值為4.1，臨床診斷為也同樣為治愈未復發，與通過本發明LH-PCR基因指紋圖譜診斷的結果一致，且與用藥后7天的LH-PCR分析預測正確。

患者2：

用藥前(0天)LH-PCR圖譜(圖6)顯示有343bp、353bp兩處相對峰面積大于10％，診斷為患有細菌性陰道病。同時進行微生態評價和臨床標準評價進行驗證，其Nugent評分為9，陰道分泌物性狀稀薄，有魚腥臭味，Whiff試驗陽性，線索細胞陽性，陰道分泌物pH值4.8，臨床診斷為患有細菌性陰道病，與通過本發明LH-PCR基因指紋圖譜診斷的結果一致。

對該患者規范使用甲硝唑凝膠治療5天，在用藥后7天再對其進行分析，此時該患者的微生態評價和臨床標準評價顯示其BV已治愈，但是通過LH-PCR圖譜(圖7)分析，顯示仍有364bp、368bp兩處相對峰面積大于10％，根據實施例1的圖譜分析，此時菌群并沒有恢復到正常，還屬于異常菌群狀態，致病菌仍存在，預測其可能后續有復發風險。

在用藥后30天，第3次進行LH-PCR分析，圖譜(圖8)顯示有353bp、366bp兩處相對峰面積大于10％，診斷為其仍患有細菌性陰道病。同時對30天時的樣品也進行微生態評價和臨床標準評價進行驗證，其Nugent評分為8，陰道分泌物性狀稀薄，有魚腥臭味，Whiff試驗陽性，線索細胞陽性，陰道分泌物pH值5.2，臨床診斷為也同樣為患有細菌性陰道病，與通過本發明LH-PCR基因指紋圖譜診斷的結果一致，且與用藥后7天的LH-PCR分析預測正確。