基因組減少的細菌的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種細菌，所具有的基因組被遺傳改造成比其天然親代菌株基因組小至少2到約20％。具有較小基因組的細菌可更有效生成商業產品。本發明也提供從細菌基因組缺失基因和其它DNA序列的方法。此方法提供精確的缺失且很少引入突變到缺失位置周圍的基因組DNA序列。因此，該方法可用于產生一系列細菌中的突變而不增加基因組內不需要的同源重組的可能性。此外，本發明提供的一些方法也能用于使所需DNA序列取代細菌基因組區域。
【專利說明】基因組減少的細菌
[0001]本申請是申請號為038025450的中國專利申請的分案申請，原申請是國際申請PCT/US2003/001800的中國國家階段申請。
[0002]相關申請的交叉引用
[0003]本專利申請是提交于2002年I月23日的美國專利申請序列號10/057，582和提交于2002年9月6日的美國臨時專利申請序列號60/409，080的后繼部分，它們都全部納入本文供參考。
[0004]關于聯邦贊助研究或發展的聲明
[0005]本發明得到美國政府支持進行，由下列機構授予:NIH GM35682。美國對此發明有一些權利。
【技術領域】
[0006]本發明涉及基因組減少的細菌。
【背景技術】
[0007]細菌用于生成廣泛范圍的商業產品。例如，許多鏈霉菌屬(Streptomyces)菌株和桿菌屬(Bacillus)菌株用于生成抗生素；脫氮假單胞菌(Pseudomonas denitrificans)和許多丙酸菌屬菌株用于生成維生素B12 些其它細菌用于生成維生素核黃素；黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)和谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)分別用于生成賴氨酸和谷氨酸作為食物添加劑；其它細菌用于生成其它氨基酸作為食物添加劑；真養產堿菌(Alcaligenes eutrophas)用于生成可生物降解的微生物塑料；許多醋酸桿菌屬(Acetobacter)和葡萄糖酸菌(Gluconobacter)菌株用于生成醋。近來,細菌如大腸桿菌(E.coli)更常被遺傳改造和用作宿主細胞以在實驗室以及工業設置中生成生物制劑，如蛋白質和核酸。制藥業支持了一些成功產品的例子，它們是在發酵罐中培養的大腸桿菌培養物中產生的人類蛋白質。
[0008]正常細菌蛋白質不利影響所需蛋白產物從工程菌中生成或純化不是不普遍。例如，當大腸桿菌用作宿主細胞以產生大量基因編碼的所需產物，基因通過質粒導入宿主細胞，一些正常大腸桿菌基因產物可干擾質粒DNA的導入和維持。更重要的是，由于細菌產生蛋白質中的細菌培養經濟，通常純化重組蛋白的成本可大于生成成本，細菌宿主生成的一些天然蛋白質對于純化問題敏感。此外，許多細菌菌株產生的毒素必須從正生成的靶蛋白中純化出且一些菌株能同時產生大小與靶蛋白接近的天然蛋白質，從而使大小分離不能用于純化過程。
[0009]然而同樣，發酵罐中用于生成重組蛋白的細菌基因組包括許多不必需基因。在自然環境中生長的細菌有許多條件響應基因以提供機制在溫度、壓力或缺乏食物來源的困難環境條件中生存。發酵罐中生長的細菌沒有這些問題并因而不需要這些條件響應基因。細菌宿主將各增殖循環的代謝能量用于復制這些基因。因此，用于生成重組蛋白的細菌宿主所產生的不必需基因和不需要蛋白導致系統缺乏效率，這可被改進。[0010]使微生物基因組產生缺失不是很困難。可簡單通過缺失基因組區域在生物體中進行隨機缺失研究以確定生物體的什么特性由于缺失基因而失去。然而，基因組DNA特定區域進行靶缺失更困難，如果發明目標之一是缺失后不在生物體留下插入DNA更加困難，這里插入DNA定義為“瘢痕”。如果插入DNA即瘢痕區域在基因組缺失過程后留下，這些區域可作為不需要重組的位置，能切除所需或產生基因組重排的基因組區域。在確立一系列多種缺失時，前面步驟留下的瘢痕可作為隨后缺失步驟的人工靶。當方法重復用于從基因組產生一系列缺失時更是如此。換句話說，如果留下插入DNA，生物體由于缺失過程變成遺傳不穩定。

【發明內容】

[0011]本發明提供方法用于優選減少生物體基因組而不在基因組中留下瘢痕。
[0012]在一個實施方案中，本發明提供一種細菌，所具有的基因組被遺傳改造成比其天然親代菌株基因組小至少百分之二(2% )到百分之二十(20% )。基因組優選比其天然親代基因組小至少百分之七(7%)。基因組更優選比其天然親代菌株基因組小至少百分之十四(14%)到百分之二十(20%)。當用于生成產品時，具較小基因組的細菌可有一個或多個下列優勢。第一，生產過程在資源消耗或生產速度、最終產生百分比或所有三個方面效率更高。第二，可簡化產品純化過程或能產生更純的產物。第三，以前由于天然蛋白質干擾不能生成的產品可被制成。第四，所需產品的每細胞產量可增加。
[0013]本發明也涉及生物體，優選細菌，改造成具有“干凈基因組”即沒有例如遺傳物質如一些細菌生長和代謝不必要的基因、插入序列(轉座因子)、假基因、原噬菌體、內源限制性_修飾基因、致病基因、毒素基因、菌毛基因、周質蛋白基因、侵襲素基因、未知功能序列和相同天然親代細菌屬的2個菌株中沒有共同發現的序列。培養中對細胞生存和一些蛋白質生成不必需的其它DNA序列可被缺失。本發明基因組減少的細菌可看作基本的遺傳構架，可加入多種遺傳元件以表達有用產物以及遺傳控制元件以提供前所未有的機會來精調或最優化所需產物的表達。
[0014]本發明也提供材料和方法用于從細菌基因組中靶缺失基因和其它DNA序列而不從操作中留下任何剩余DNA(無瘢痕缺失)。由于本發明方法很少在缺失位置周圍的基因組DNA序列中引入突變或留下剩余DNA，該方法可用于產生一系列細菌中的突變而不增加基因組內不需要的同源重組的可能性。一些這種方法也用于產生類似缺失，例如在噬菌體、天然質粒等中，以及在高等生物體中如哺乳動物和植物。
[0015]第一種缺失方法是以線性DNA為基礎。為進行此過程，首先，在細菌中提供線性DNA構建且細菌基因組區域通過細菌系統協助的同源重組被線性DNA構建取代，系統能增加同源重組頻率。其次，前面導入細菌的分離基因表達序列特異性核酸酶以在位于線性DNA構建上的獨特識別位置切細菌基因組。隨后，改造DNA序列包含的DNA與線性DNA構建一個末端基因組DNA中的靶同源，此DNA序列用位于線性DNA構建另一個末端的類似基因組DNA序列進行同源重組。凈所得是基因組區域的確切缺失。
[0016]第二種方法也以線性DNA為基礎。兩種DNA序列，一種與待缺失的細菌基因組區域一個末端側翼序列相同而另一種與待缺失的細菌基因組區域另一個末端側翼序列相同，兩種DNA序列改造到載體中，在其中兩種序列彼此相鄰。至少一個序列特異性核酸酶識別位置也改造到載體中，在兩種序列的一側。載體導入細菌且通過在細菌中表達核酸酶來細菌內產生線性DNA，核酸酶識別序列特異性核酸酶識別位置并切割本文的載體。線性DNA與細菌基因組進行同源重組，由細菌系統協助以增加同源重組頻率。因而產生的細菌具有靶缺失且基因組中沒有剩余人為影響。
[0017]上述第二種方法也能用于使所需DNA序列取代細菌基因組的選擇區域。在此情況中，所需DNA序列可與選擇區域進行同源重組并因此取代所選區域，所需DNA序列被改造到載體中。對于缺失靶區域，所有其它方面相同。
[0018]第三種方法以自殺性質粒為基礎。本發明所用特定質粒包含啟動子控制的復制起點和可選擇標記如抗生素抗性基因。為缺失細菌基因組的靶區域，含兩種彼此相鄰DNA序列的DNA插入片段被插到質粒中，兩種DNA序列一種與待缺失的細菌基因組區域一個末端側翼序列相同而另一種與細菌基因組區域另一個末端側翼序列相同。隨后質粒導入細菌并整合到細菌基因組中。其次，活化啟動子以誘導從引入細菌基因組的異位來源復制，從而選擇重組。在許多細菌中，重組導致細菌基因組靶區域的精確缺失且可鑒定這些細菌。另一種選擇重組的方法是將序列特異性核酸酶識別位置改造到特定質粒并在質粒整合到細菌基因組后用序列特異性核酸酶切細菌基因組。[0019]上述以自殺性質粒為基礎的方法也可用于使所需DNA序列取代細菌基因組的選擇區域。在此情況中，DNA插入片段被插到質粒中，DNA插入片段包含的所需DNA序列可與選擇區域進行同源重組并因此取代所選區域。對于缺失靶區域，所有其它方面相同。
[0020]本發明方法用于改造基因組減少的細菌以生成重組基因產物。這種工程菌可改進這些蛋白質生成，通過增加所需基因產物的生成效率和產量以及通過去除不必需細菌基因產物更有效純化產品。本發明優選的基因組減少細菌中缺失一個或多個天然基因，天然基因編碼周質蛋白和/或膜蛋白。
[0021]本發明也涉及DNAs和載體用于完成本發明方法、制備DNAs的方法和含小瓶的試劑盒，小瓶包含一個或多個本發明載體和任選適當的緩沖液、引物、核酸內切酶、核苷酸和
聚合酶。
[0022]本發明也涉及活疫苗，包括本發明基因組減少的細菌或所含本發明基因組減少的細菌中導入DNA編碼致病生物的抗原決定簇，與能表達所述抗原決定簇的表達控制序列可操作相連。同樣在本發明范圍內的活疫苗包括本發明基因組減少的細菌，其中導入DNA獲得自致病生物且任選具有復制起點，所述活疫苗能誘導宿主抗致病生物的免疫應答增強。所述DNA優選在甲基化位點被甲基化。發明也涉及產生自致病生物的活疫苗，這是通過從此生物中缺失用于致病的基因而保持其它抗原決定簇。
[0023]發明的其它目標、特征和優勢通過下列詳細描述而明顯。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1顯示大腸桿菌K-12細菌基因組上候選缺失的基因和其它DNA序列位置，以最外層環上黑色和更淡陰影線盒表示。
[0025]圖2闡述了本發明以線性DNA為基礎的無瘢痕遺傳修飾方法的特定例子。
[0026]圖3闡述了本發明另一個以線性DNA為基礎的方法的特定例子。
[0027]圖4顯示突變質粒，能用于圖3所示以線性DNA為基礎的方法。[0028]圖5A-C闡述了本發明以自殺性質粒為基礎的方法的特定例子。
[0029]圖6顯示3種質粒，能用于圖5A-C所示以自殺性質粒為基礎的方法。
【具體實施方式】
[0030]在其自然環境中的細菌暴露于許多在標準工業或實驗室生長中通常不經歷的條件，因此攜帶大量條件-依賴、壓力-誘導的基因或者在工業或實驗室使用生物中不需的另外非必要基因。本發明一開始意識到細菌菌株基因組中所含的許多遺傳信息能被缺失而不有害影響細菌培養在工業加工中的使用或實驗室重要性。意識到基因組減少的天然菌株可能在許多工業或實驗室應用中相對天然菌株有優勢。例如，基因組減少的細菌至少代謝要求有些降低并因此能更有效生成所需產物。此外，基因組減少可導致天然產物更少和一些天然蛋白水平更低，使從剩余細菌蛋白中純化所需蛋白更簡單。另外，一些細菌遺傳序列與不穩定相關，可干擾標準工業或實驗室實踐，可能涉及昂貴且繁重的質量控制過程。
[0031]本發明也包括一些方法用于從基因組中缺失基因組DNA而不留下任何插入DNA(無瘢痕缺失)。如果從構成細菌基因組的單個DNA分子中進行一些連續缺失，不留下任何插入DNA序列是重要的。這種插入序列如果留下，會是不需要重組的候選位置，不需要重組從細菌剩余基因組中缺失特征未確定且也許重要的部分或引起有不利影響的未預期基因組重排。由于基因組減少努力的目標之一是增加細菌的遺傳穩定性，留下任何插入DNA會與目標相反并應避免。因此，用于從基因組缺失DNA的方法變得重要且復雜。
[0032]一方面，本發明涉及的細菌基因組被遺傳改造成比其天然親代菌株基因組小。為了示范目的，本文所述工作集中在普通實驗室和工業細菌大腸桿菌。本文所述基因組減少工作開始用實驗室大腸桿菌菌株K-12，它在本文所述工作前具有的基因組為4，639，221個核苷酸或堿基對。本發明細菌可具有的基因組比其天然親代菌株基因組小至少百分之二(2% )，優選超過百分之五(5% )，更優選超過百分之七(7%)到百分之八(8%)到百分之十四(14%)到百分之十八(18%)到百分之二十(20%)，到百分之四十(40%)到百分之六十(60%)。術語“天然親代菌株”指在科學界通常理解的自然或天然環境中發現的細菌菌株(或其它生物體)，它們的基因組上可進行一系列缺失以產生基因組較小的細菌菌株。計算一系列缺失后基因組變小的百分比通過將“所有缺失后刪除的堿基對總數”除以“所有缺失前基因組中堿基對總數”再乘以100。
[0033]本發明的另一方面包括基因組較小的細菌，詳細描述了其中約5%到約10%的蛋白質編碼基因。優選約10%到約20%的蛋白質編碼基因被缺失。在發明的另一個實施方案中，約30%到約40 % )到約60%的蛋白質編碼基因被缺失。
[0034]一般說來，可缺失的基因和其它DNA序列類型是其缺失不會不利影響細菌在特定生長條件下生存和增殖的速度。不利效果水平是否可接受取決于特定應用。例如，增殖速度減少30%對于一種應用可接受:但另一種不能。此外，基因組缺失DNA序列的不利效果可通過調節如改變培養條件來降低。這種調節可能使一種不能接受的不利效果轉變成可接受的。增殖速度優選和親代菌株大致相同。然而，比親代菌株低約5 %、10 %、15 %、20 %、30 %、40%到約50%范圍的增殖速度在發明范圍內。更特定的是，本發明細菌的優選倍增時間范圍可從約30分鐘到約3小時。
[0035]本發明細菌可通過本發明方法改造以最優化它們對可用資源(如營養)的使用以生成所需產物。這些產物可以是重組蛋白，非限制例子有胰島素、白介素、細胞因子、生長激素、生長因子、紅細胞生成素、集落刺激因子、干擾素、抗體、抗體片段或任何其它有用的重組蛋白。重組產物可以是治療產品、疫苗成分、診斷產品或研究試劑。細菌也可能用作背景以表達工業有用的產品如商業有用的代謝中間物和末端產品如香草醛、莽草酸、氨基酸、微生物、有機酸等，以及不在細菌中天然產生但通過代謝途徑工程或其它遺傳操作生成的化學化合物-(參見例如美國專利號6，472，16和6，372，476，它們都納入本文供參考)。[0036]下面大腸桿菌用作例子來闡明作為缺失候選的基因和其它DNA序列用于產生能更有效生成所需產物的細菌。所示一般原則和鑒定為缺失候選的基因和其它DNA序列類型可應用于其它細菌屬或菌株。要理解的是下面鑒定為缺失候選的基因和其它DNA序列僅是例子。許多未鑒定的其它大腸桿菌基因和其它DNA序列也可缺失而不影響細胞生存和增殖到不能接受的水平。
[0037]假定在下述分析和方法中，靶細菌菌株噬菌體基因組或天然質粒的至少部分DNA序列可用。優選整個序列可用。這種完整或部分序列可獲得于GenBank數據庫。當然，現在發表了一些大腸桿菌菌株的完整基因組序列(例如Blattner等，Science, 277:1453-74，1997K-12 菌株 MG1655 ;也參見 GenBank 登錄號 U00096 ；Perna 等，Nature, 409,529-533,2001 ；Hayashi 等，DNA Res，8，11-22，2001 和 Welch 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.，USA (2002) 99 (26) 17020-17024和GenBank登錄號AE014075，所有都全部納入本文供參考)，如一些其它實驗室常用細菌的序列。為開始缺失過程，分析細菌基因組以尋找作為好缺失候選的序列。當然，這些技術也可應用于基因組區域中部分測序的基因組，其序列數據可獲得或能確定。
[0038]在大腸桿菌、其它細菌以及高等生物中，可缺失的DNA序列類型包括一般會不利影響生物或此生物基因產物穩定性的類型。這些引起不穩定性的元件包括轉座因子、插入序列、可能在基因組不穩定性中發揮作用的其它“自私DNA”因子。例如，插入序列(IS)元件和它們相關的轉座子通常發現于細菌基因組，因此是缺失的靶。IS序列在大腸桿菌中普遍，它們都可被缺失。為了在此文獻中闡明，我們使用術語IS元件和轉座因子，一般稱為DNA元件，無論完整或缺陷都可從基因組一點移到另一點。IS元件在科學技術中有害效果的另一個例子是它們在用于測序的增殖中從宿主大腸桿菌基因組跳到BAC質粒。許多例子發現于人基因組和其它GenBank數據庫中的序列。此現象可通過從宿主細胞中缺失所有IS元件來防止。對于特定應用，其它與基因組不穩定性相關的特定基因也可被缺失。
[0039]如圖1所示，闡明了在K-12菌株中大腸桿菌基因組天然包括4，639，221個堿基對。圖1顯示內環上大腸桿菌K-12基因組(菌株MG1655)的堿基對位置刻度，沒有缺失(也參見Blattner等，同上)。下一個外面的環顯示K-12基因組區域，在相關菌株0157: H7中沒有或高度改變，因此能從K-12基因組中檢測。下一個外環顯示天然基因組中完整和部分的IS元件位置。其次的外環顯示RHS元件A到E和鞭毛和限制性區域位置，它們是缺失的特別靶。最外的環顯示實際對基因組進行缺失的位置，也列于下表1和2。這些缺失組成原始K-12MG1655基因組中約百分之14的堿基對。使用本發明方法，18%到20%到約40%基因組用本文所述設計范例來缺失。
[0040]另一個能缺失的大腸桿菌基因家族是限制性修飾系統基因和其它內源核酸酶，其產物破壞外源DNA。這些基因對于細菌在培養環境中存活和生長不重要。這些基因也能通過破壞導入細菌的質粒來干擾遺傳工程。限制性修飾系統基因在大腸桿菌基因組圖譜上的位置示于圖1和表1。在發明的一個實施方案中，其它DNA甲基化酶基因可再加入缺失大腸桿菌菌株以最優化菌株用于一些使用，例如真核甲基化酶基因。
[0041]另外一個能缺失的大腸桿菌基因家族是鞭毛基因家族。鞭毛用于細菌運動。在天然環境中，細菌游泳以搜索營養。在培養環境中，細菌運動對細胞存活和生長不重要且游泳行為在代謝上很昂貴，消耗超過I %的細胞能量而沒有益處。因此，可缺失鞭毛基因來產生基因組減小的細菌。鞭毛基因在大腸桿菌基因組圖譜上的位置示于圖1和表1。
[0042]已提及的一類能缺失的大腸桿菌DNA元件是IS元件(或轉座因子)。IS元件對細菌在培養環境中存活和生長不重要且已知干擾基因組穩定性。因此，可缺失IS元件來產生基因組減小的細菌。IS元件在大腸桿菌基因組圖譜上的位置示于圖1和表1。 [0043]另一類能缺失的大腸桿菌DNA元件是Rhs元件。所有Rhs元件共有3.7Kb Rhs核心，這是大同源重復區(在大腸桿菌K-12中有5個拷貝)，提供經同源重組的基因組重排方法。Rhs元件是附加元件，主要在一些其它背景中進化并在大腸桿菌作為屬分化后通過水平交換散布到大腸桿菌。Rhs元件在大腸桿菌基因組圖譜上的位置示于圖1和表1。
[0044]—類能缺失的大腸桿菌基因組區域是非轉錄區，因為它們更不可能對細胞存活和增殖重要。另一類能缺失的大腸桿菌基因組區域是hsd區。hsd區編碼上述主要限制性修飾基因家族。非轉錄區和hsd區在大腸桿菌基因組圖譜上的位置示于圖1和表1。
[0045]在本文所討論的基因選擇范例基礎上，原噬菌體、假基因、毒素基因、致病基因、周質蛋白基因、膜蛋白基因也是能缺失的基因。大腸桿菌K-12序列(參見Blattner等，同上)與其近親0157:H7(參見Perna等，同上)序列比較后，論述22% K-12)和46% (0157:H7)的蛋白質編碼基因位于菌株特異島上，從I到約85kb隨機插入相對恒定的主鏈。
[0046]其它能缺失的基因是編碼噬菌體受體的基因，包括例如ton A(FhuA)和/或其完整操縱子fhu ABC，操縱子編碼裂解性噬菌體Tl的受體。
[0047]鑒定另外基因和DNA序列作為缺失候選的一般方法是比較一個細菌菌株和一個或多個其它菌株的基因組。任何不存在于2或3個菌株的DNA序列是功能必需的可能性更小，因此可用于鑒定缺失候選。在下述例子中，比較2個大腸桿菌菌株0157:H7 EDL933和K-12 MG1655的完整基因組序列。在2個菌株中都沒有發現的DNA序列用于鑒定缺失靶。12個這樣從大腸桿菌菌株MG1655中鑒定的靶被缺失，產生的細菌菌株基因組小約8%。基因組減少的細菌生長速度幾乎與天然親代MG1655菌株相同。
[0048]最近確定引發尿道疾病的大腸桿菌菌株CFT073H7(Welch等，同上)的DNA序列且其序列與K-12(MG1655)和0157:H7比較。結果顯示任意基因組中發現的所有編碼基因中僅約40%存在于所有基因組且CFT073、K-12和0157:H7包括67%、43%和68%菌株特異島基因。在此信息基礎上，多達約60%的蛋白編碼序列可從大腸桿菌中缺失。優選至少5%或約90%或約15%或約21%的蛋白質編碼基因被缺失。更優選約30%的蛋白質編碼基因被缺失。應指出也許有些基因對于一個菌株生長必須而其它菌株生長不需要。在這種情況中，菌株生長必需基因不從此菌株中缺失或者如果缺失，用具互補功能的另一個基因取代以使此菌株能生長。
[0049]在發明的一個特定實施方案中，序列信息用于從大腸桿菌基因組中選擇另外基因(用本發明方法)以產生約3.7兆堿基的基因組(比K-12小約20% )，基因組含73個缺失以去除約100個“島”且當培養于基本培養基時周圍DNAs仍使菌株能適當生長。設計也需要從基因組中完全去除任何剩余轉座因子(IS序列)。
[0050]周質清除和蛋白質表達
[0051]由于本文所討論原因，本領域仍需要生成分泌到細菌周質空間的重組蛋白且本發明方法提供細菌改造以最優化周質表達。
[0052]革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌有2層細胞膜，內細胞膜和外細胞膜。2層膜通過周質空間(PS)分離。有適當信號序列的細菌蛋白經內細胞膜分泌到PS，通過至少2種不同系統 Sec-系統和 Tat-系統。(Danese 等，Annu.Rev.Genet.(1998) 32:59-94 ；Fekes 等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，(1999) 63:161-193 ；Pugsley, Microbiol.Rev.，(1993)57:50-108[sic], Hynds 等，(1998) J.Biol.Chem.273:34868-34874 ；Santini 等，(1998)EMBOJ.17:101-112 ；Sargent 等，EMBO J.H:101_112[TAT]，全部都納入本文供參考。
[0053]Sec-系統識別適當信號肽和運輸蛋白質以未折疊狀態到周質，使用細胞質ATP和電子原動力。切割信號蛋白后，新蛋白通過伴侶肽基-脯氨酰異構酶和硫氧還蛋白相關系統協助折置，系統催化二硫鍵形成。參見例如Hynds等，(1998) J.Biol.Chem.273:34868-34874 ；Santini 等(1998)EMBO J.17:101-112 ；Sargent 等，EMBO J.17:101-112 [TAT]，全部都納入本文供參考。
[0054]與Sec-系統相反，Tat-系統運輸充分折疊構象的大蛋白且在識別適當信號序列中更特異。我們選擇周質，因為(I)它是表達異源重組蛋白的優選位置，(2)對于控制條件中的工業使用，它有許多不需要蛋白，(3)它在許多不必需的適應和控制系統中發揮作用，一些似乎有害。通過從周質中去除天然蛋白質，我們預期能大幅改進生成蛋白質的加工方法。在周質中表達和分泌蛋白質綜述于Hanahan，D.，J.Mol.Biol.，1983，166 (4):557-80頁；Hockney R.C., Trends Biotechnol., 1994,12 (11):456-632 頁；Hannig G.,等，TrendsBiotechnol.，1998，16 (2):54-60頁，全部都納入本文供參考。
[0055]有一些原因說明周質為何是蛋白質生成的優選位置；(I)它能生成氨基末端與天然蛋白相同的重組蛋白，而在細胞質中蛋白質總是以氨基酸甲硫氨酸為起始；(2)許多蛋白質能在周質空間中正確折疊(3)正確的二硫鍵可在周質氧化環境中形成；(4)周質空間所含蛋白質遠少于細胞質，簡化純化(5)蛋白酶少于細胞質，減少蛋白質消化和損失；(6)通過破壞外膜，表達蛋白能和其它周質蛋白容易釋放，幾乎沒有更豐富的細胞質蛋白。周質空間有天然酶系統，經內膜與細胞細胞質代謝相關以承擔這些加工任務，大概因為在此細胞器官中大部分內和外膜蛋白被加工。相反，證明獲得細胞質還原環境中表達的適當折疊重組蛋白鏈很難。通常蛋白質聚集成不溶的“內含體”。初始內含體純化可能較簡單，蛋白質需要再溶解和再折疊，此過程不能預期且難以控制，對于一些蛋白質效率很低從而不能以工業規模生產。
[0056]重組蛋白一般通過表達融合蛋白在周質中生成，其中它們附于導致分泌到周質空間的信號肽。信號肽由特定信號肽酶很精確的切割。第二種重組人生長因子生成由Genentech (Nutropin,所有指定信息)和Pharmacia通過此方法生產。不是所有的蛋白質能通過此途徑成功生成，有證據表明分泌和分泌后加工系統有限制能力。同樣，仍有待處理的蛋白污染物。要注意的是對這種批準產品有警告，它包含痕量大腸桿菌周質蛋白，在一些病人中引起抗體生成(Gonotropin:所有指定信息)。本發明材料和方法可減少或去除此問題。
[0057]本領域需要生成會分泌到PS的重組蛋白。完成此分泌可用Sec-或Tat-系統或各細菌中可用的任何其它分泌病原體。在任一情況中，適當信號肽加入重組蛋白。如果使用Sec-系統，需要下列另外的實驗。由于報導Sec-系統可通過高效表達構建飽和，第I組實驗是發展有最佳重組蛋白表達水平的系統，重組蛋白能在PS中適當運輸和折疊。
[0058]用于在本發明基因組減少細菌中周質表達的重組DNA構建包括編碼信號肽的第一個DNA序列，可操作連接于至少第二個編碼所需異源蛋白的DNA序列，信號肽能調節蛋白質運輸到周質空間。信號序列可以是待表達蛋白固有的。運輸到周質空間的蛋白質優選是生物活性。表達重組DNA構建可在誘導型啟動子或組成型表達于宿主細菌的啟動子控制下。當使用已知可飽和的Sec系統時，使用誘導型啟動子有特定優勢。例如，可使用以Iac-為基礎的啟動子/阻遏物，由非代謝半乳糖衍生物IPTG誘導。這種啟動子可精調經Sec系統的表達和分泌，從而最優化周質表達。
[0059]重組蛋白也可與伴侶/ 二硫鍵形成酶共表達以確保重組蛋白的適當折疊。用于周質表達重組蛋白的DNA序列包括但不限于美國專利號5，747，662 ;5，578，464 ；
6,335, 178 和 6，022，952、Thomas 等，Mol-Micro，(2001)39(1)47-53 ；ffeiner 等，Cell，(1998) 93,93-101 ;《分子生物的當前操作》(Current Protocols in Molecular Biology)(1994) 16.6.1-16.6.14 (John Wiley等和Sons享有版權2000)所述，全部納入本文供參考。
[0060]在本發明的一個實施方案中，9個已知和3個推定周質蛋白基因在構建MDS40中成功缺失，沒有顯著影響生物在基本培養基上生長的能力(見下表4和數據)。這些突變影響一定范圍的功能，包括氨基酸吸收、無機代謝、細胞膜維持、糖代謝和粘附。
[0061]缺失約85個編碼已知或推定膜蛋白的基因，通過它們的信號肽序列鑒定。其中33個參與鞭毛結構或生物合成；9個參與菌毛結構或生物合成；13個參與一般分泌途徑。剩余的具有多種細胞膜中已知或推定功能。認為許多這些蛋白質在周質空間中加工。它們也在構建MDS40中缺失，沒有顯著影響生物在基本培養基上生長的能力。
[0062]通過在注釋MG1655數據庫中搜索信號肽_類似序列，將這些與文獻相互關聯，我們鑒定了 181個蛋白質，大部分被認為是固有(resident)周質蛋白。一些這種蛋白根據功能分成幾組排除:粘附和移動；營養和鹽吸收、痕量因子吸收；環境感覺；防御和保護；周質蛋白分泌和加工。在缺失或待缺失的基因或完全操縱子中，編碼糖和氨基酸運輸蛋白的基因或完全操縱子不可能為了生物制藥生產需要用于成分明確的基本培養基。
[0063]為監控重組蛋白運輸到PS的效率，3種商業購買標記:大腸桿菌堿性磷酸酶、水母(Aequoria)綠色熒光蛋白(GFP)或人生長激素蛋白可根據上述方法使用。人生長激素蛋白目前最優選用于最終證明目的且用于ELISA和以基因芯片為基礎測量重組蛋白定位到PS。
[0064]可測試從基因組缺失一個或幾個基因或其它DNA序列的結果。例如，基因組的一個或幾個基因或其它DNA序列被缺失后，能可測量所得細菌的生存和增殖速度。盡管大部分上面鑒定的基因或其它DNA序列可沒有有害效果地缺失用于生成所需產物，缺失特定基因或其它DNA序列可能有不可接受的后果如細胞死亡或增殖速度減少水平不能接受。由于基因功能冗余和生物途徑間的相互作用，存在此可能性。一些缺失在沒有另外缺失的菌株中可存活，僅在結合其它缺失時會有害。由于用于鑒定缺失候選的一些方法，也存在此可能性。例如，用于鑒定缺失候選的一種方法是比較兩個大腸桿菌菌株并選擇不在兩個菌株中都存在的基因或其它DNA序列。盡管大部分這些基因和其它DNA序列不可能是功能必需，一些可能對獨特菌株重要。另一種用于鑒定缺失候選的方法是鑒定非轉錄區，可能一些非轉錄區對基因組穩定性重要。
[0065]缺失一個或幾個基因或其它DNA序列的測試結果取決于應用目的。例如，當高生成效率是主要關注時，許多應用也確實如此，缺失對增殖速度和培養基消耗速度的效果可以是測試結果。在此情況中，測試結果也可更特異作為特定產物的生成速度量和每細胞產量。當去除天然蛋白污染物是主要關注時，更少的天然蛋白和更低的天然蛋白水平或缺乏特定天然蛋白可以是測試結果。
[0066]當對于基因或其它DNA序列所知甚少時，測試缺失一個基因或其它DNA序列的結果是重要的。盡管艱苦，這是另一種鑒定缺失候選以產生基因組減少細菌的可行方法。當通過其它方法鑒定的候選被缺失且正尋找另外候選時，此方法特別有用。
[0067]當缺失一個基因或其它DNA序列對細菌在一組條件下存活有影響時，一種不缺失特定基因或其它DNA序列的另外選擇是確定是否有調節能減輕有害效果。例如，如果缺失脂多糖(LPS)基因導致存活差，這是由于細胞膜缺乏LPS蛋白的擴膜結構域引起更多孔的細胞膜，可改變培養條件以適應更多孔的細胞膜從而缺乏LPS基因的細菌能和攜帶LPS基因的細菌生存的一樣好。
[0068]從細菌基因組缺失DNA序列的方法對本領域普通技術人員已知，能用于產生基因組減少的細菌。這些方法的例子包括但不限于Posfai，G.等，J.Bacteriol.179:4426-4428 (1997)，Muyrers, J.P.P.等，Nucl.Acids Res.27:1555-1557 (1999)，Datsenko,K.A.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.97:6640-6649 (2000)和 Posfai，G.等，Nucl.Acids Res.27:4409-4415(1999)所述，全部納入本文供參考。基本上，缺失方法可分成以線性DNAs為基礎和以自殺性質粒為基礎。Muyrers, J.P.P.等，Nucl.Acids Res.27:1555-1557 (1999)和Datsenko, K.A.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.97:6640-6649 (2000)所述方法是以線性 DNAs 為基礎的方法且 Posfai，G.等，J.Bacteriol.179:4426-4428(1997) Posfai, G.等，Nucl.Acids Res.27 =4409-4415(1999)所述方法是以自殺性質粒為基礎的方法。
[0069]一些從細菌基因組缺失DNA序列的已知方法在缺失過程中將外源DNA序列導入基因組，因此如果任何方法在細菌中使用超過一次，有產生不需要同源重組的潛在問題。為避免此問題，優選無瘢痕的缺失方法。無瘢痕缺失指DNA從基因組精確缺失而不在缺失位置產生任何其它突變且不在生物基因組留下任何插入DNA。然而由于錯誤如PCR擴增和DNA修復過程中產生的，無瘢痕缺失中可偶爾引入一個或兩個核苷酸變化。下面描述一些新的無瘢痕缺失方法，或以線性DNA為基礎或以自殺性質粒為基礎。這些新方法在下述例子中應用于大腸桿菌菌株。要理解的是例子中用于大腸桿菌菌株的特定載體和條件可由本領域普通技術人員修改用于其它細菌。類似方法和質粒能用于在高等生物中產生類似效果。在一些情況中，更適合修飾現有生產菌株而不是將生產轉移到最小基因組的大腸桿菌菌株。
[0070]本發明方法不限于使用基因組減少的細菌，例如本發明方法可用于從噬菌體中缺失DNA如P1、P2、λ和其它噬菌體。這些方法能改造噬菌體基因組以改進它們的有用性質和/或減少或去除一些有損這種噬菌體用于多種目標的性質。類似的，本發明方法用于修飾細菌中的質粒以從質粒中去除有害因子(如毒性基因)和改進質粒的其它有用性質。
[0071]上述熟知的普遍性轉導噬菌體Pl用于將DNA片段轉導入受體大腸桿菌。然而，一些Pl的基因特征最終限制用于轉導的吸收和包裝基因組DNA的能力。特定的是，Pl包裝位置(pac)位點是GATC豐富區，當通過Pl的dam甲基化酶甲基化時限制基因組DNA進入噬菌體包被的量。然而缺乏dam相關的包裝位置甲基化時，包裝DNA變得“肥大”，即比包裝位置被甲基化時更易包裝基因組DNA部分。因此，用本發明方法改造Pl基因組以去除dam基因有優勢，從而提聞吸收和包裝基因組物質dam的能力。
[0072]另一個與使用Pl轉導相關的缺點是噬菌體攜帶兩個插入序列。在插入序列上發現ISl在Pl基因組的ssb和prt基因座之間。另一個IS5在res基因中。結果，可能當Pl用于轉導時，一個或多個插入序列會最終跳到生物基因座中。因此，用本發明方法改造Pl基因組以缺失IS序列有優勢，從而防止Pl用作轉導子時的基因組污染。
[0073]在上面描述中，本發明結合特定例子描述。要理解的是本發明不限于這些例子，而要構建成在所附權利要求確定的精神和范圍內。
[0074]本發明的一個實施方案是基因組減少的費氏志賀氏菌(Shigella flexner)。最近，確定費氏志賀氏菌2a菌株2457T的完整基因組序列。(測序菌株重保存于美國模式培養物保藏所，登錄號ATCC 700930)。費氏志賀氏菌基因組由4，599，354個堿基對(bp)的單環染色體組成，G+C含量為50.9%。由于細菌顯示廣泛的同源性，分配染色體的堿基對I與大腸桿菌K-12的堿基對一相應。基因組顯示有約4082個預測基因，平均大小為873個堿基對。費氏志賀氏菌基因組表現出大腸桿菌病原體的主鏈和島鑲嵌結構，雖然水平轉移的DNA少很多且缺乏大腸桿菌中存在的357個基因。(參見Perna等，(2001) Nature, 409,529-533。生物體的獨特在于在其大的插入序列補充、一些基因組重排、12個隱性原噬菌體、372個假基因和195個志 賀氏菌特異基因。完整的費氏志賀氏菌注釋序列保存于GenBank，登錄號AE014073，納入本文供參考。(也參見《費氏志賀氏菌血清型2A菌株2457T的完整基因組序列和比較基因組學》(Complete Genome Sequence and Comparative Genomics ofShigella flexner Serotype 2A strain 2457T), Wei 等，提交待發表)。令人驚訝的是注意到在其DNA序列基礎上，志賀氏菌在系統發生上與大腸桿菌無法區別。
[0075]從此說明中顯然有費氏志賀氏菌序列，其基因組序列可用本文所討論方法和基因選擇范例來減少。由于本文所討論關于基因組減少的大腸桿菌(活疫苗)的原因，基因組減少的志賀氏菌能用于表達異源(重組)蛋白或其它有用營養。另一種基因組減少的志賀氏菌使用或對此任何致病細菌易受本發明缺失方法影響的是作為載體用于展示或呈遞抗原以誘導宿主的免疫反應。這種工程志賀氏菌能例如將用于毒性的基因從生物中缺失而維持其它基因如編碼抗原決定簇的基因，足以誘導宿主的免疫反應和優選在宿主腸壁中的粘膜免疫反應。
[0076]費氏志賀氏菌可能很適于此策略，因為其毒性決定簇特征被確定且定位于210-kb “大毒性(侵入)質粒”，其核苷酸序列被確定并保存于GenBank，登錄號AE348706，納入本文供參考。(也參見 Venkatesan 等，Infection of Immunity (2001 年 5 月)，3271-3285)。侵入質粒中可能的缺失候選是編碼賴氨酸脫羧酶的cadA基因。
[0077]缺失的志賀氏菌侵入質粒可導入基因組減少的大腸桿菌，從而可有效表達一些志賀氏菌侵入質粒基因，在接種大腸桿菌的宿主中能引起免疫反應。也能改造侵入質粒以從質粒中缺失有害基因如用于破壞液泡的基因。從侵入質粒去除的優選候選基因包括一個或多個選自ipaA、ipaB、ipaC、ipaD和virB的基因。本發明也可加入其它基因到基因組減少的大腸桿菌，侵入質粒導入大腸桿菌以最優化來自導入、修飾侵入質粒的基因表達。
[0078]本發明也涉及活疫苗，包括例如基因組減少的大腸桿菌或例如導入編碼抗原基因的基因組減少大腸桿菌，在接種疫苗的宿主中能誘導免疫反應。基因組減少的疫苗可以是以DNA為基礎的疫苗，所含DNA已知能誘導宿主中的所需生理反應(即免疫反應)。
[0079]根據本發明的基因組減少生物的一個主要優勢是提供干凈、最小遺傳背景，其中可導入DNA不僅能表達所需分子，也提供機會將另外的DNAs導入干凈背景以提供能最優化所需產物表達的分子來源。
[0080]缺失方法
[0081]構律線件靶DNA
[0082]構建線性靶DNA的例子如下:為產生引物a+b (圖l)，20pmol的引物a混合20pmol的引物b，PCR在總共50μ I體積中進行。循環參數為:15x(94°C 40秒/57°C或更低[取決于引物a和b間重疊程度]40秒/72°C 15秒)。其次，I μ I的此PCT產物混合各20pmol的引物a和c (圖1)、50ng pSG76_CS模板，第二輪PCR在2x50 μ I體積中進行。循環參數為:28x(94°C 40秒/57°C 40秒/72°C 80秒)。所得PCR產生的線性DNA片段用PromegaWizard PCR purification試劑盒純化并懸浮于20 μ I水。不需要去除模板質粒(如通過DpnI消化)。PSG76-CS作為模板質粒通過PCR產生線性靶片段。它包含氯霉素抗性(CmK)基因和2個1-SceI位點，通過PCR-調節插入第二個1-SceI位點來獲得以及通過PCR-調節插入第二個1-SceI識別位點到pSG76-C的NotI位點下游來獲得。2個1-SceI位點方向相反。
[0083]新的以線性DNA為基礎的無瘢痕缺失方法I
[0084]當下列描述根據圖2閱讀時，可最好的理解本發明以DNA為基礎的新無瘢痕缺失方法。一般說來，方法包括用人工DNA序列取代基因組片段，標記缺失。人工序列包含一個或多個識別位點用于序列特異性核酸酶如1-Scel，它切割的序列不在大腸桿菌K-12基因組任何地方天然出現。精確插入線性DNA分子到基因組通過系統協助的同源重組完成，系統可增加同源重組頻率。當序列特異性核酸酶導入細菌時，它在獨特識別位點切割基因組DNA，僅發生同源重組的細菌會存活。
[0085]特別提到圖2，質粒pSG76-CS用作模板以合成人工DNA插入片段。人工插入序列在圖2中命名為A、B和C的序列間延伸。Ck表示抗生素抗性基因。插入DNA從質粒中PCR擴增并電穿孔到大腸桿菌宿主。構建插入從而序列A和B配對宿主基因組中跨計劃缺失的序列。隨后選擇抗生素抗性的細菌，選擇使只有發生同源重組的細菌會存活，其中人工DNA插入細菌基因組。此重組在序列A和C對間發生。插入DNA序列也包括現位于插入一個末端的序列B，設計成與插入另一個末端外的基因組序列同源，如圖2所示。然后在細菌生長后，細菌用質粒PSTKST轉化，質粒表達1-SceI序列特異性核酸酶。1-SceI酶切割細菌基因組，僅發生重組的個體會存活。10-100%的存活子是B到B重組存活子，可通過篩選步驟鑒定。B到B重組從基因組中缺失整個插入DNA，只留下缺失周圍的天然序列。
[0086]為了重復，此方法的第一個步驟包括在細菌中提供線性DNA分子。線性DNA分子包含具下列特征的人工線性DNA序列:線性DNA序列的一個末端是與待缺失基因組區域左側翼基因組序列相同的序列，接著是與待缺失基因組區域右側翼基因組序列相同的序列；線性DNA序列的另一個末端是與待缺失基因組區域中基因組序列相同的序列；線性DNA兩個末端間有一個不存在于細菌菌株基因組的識別位點和抗生素選擇基因。人工DNA序列可用聚合酶鏈式反應(PCR)或定向DNA合成來產生。用于此目的的PCR模板包含獨特識別位點且人工線性DNA序列2個末端的基因組DNA序列是用于PCR反應的部分引物。PCR模板可由質粒提供。能用作模板的一個質粒例子是pSG76-C(GenBank登錄號Y09893),描述于 Posfai，G.等，J.Bacteriol.179:4426-4428 (1997)。也可使用 pSG76_CS (GenBank 登錄號AF402780)，它獲得自pSG76_C。pSG76-CS包含氯霉素抗性(CmR)基因和2個1-SceI位點，通過PCR-調節插入第二個1-SceI識別位點到pSG76-C的NotI位點下游來獲得。2個1-SceI位點方向相反。
[0087]人工或構建的DNA序列可提供給細菌，通過直接導入線性DNA分子到細菌，使用本領域普通技術人員已知的任何方法如電穿孔。在此情況中，選擇標記如抗生素抗性基因改造到人工DNA序列中用于稍后選擇含插入DNA序列的菌落。另外，線性DNA分子能在細菌中提供，通過用攜帶人工線性DNA序列的載體轉化細菌并經限制性酶切在細菌內產生線性DNA分子。所用限制性酶應僅切載體但不切細菌基因組。在此情況中，人工線性DNA序列不必須攜帶選擇標記，因為載體轉化效率更高從而插入線性DNA的細菌可稍后直接通過PCR篩選。
[0088]無瘢痕缺失方法的第二個步驟包括通過插入人工DNA分子來取代基因組區域。改造細菌細胞以包含增加同源重組頻率的系統。這種系統的一個例子是Red重組酶系統。系統能通過載體導入細菌細胞。系統協助線性DNA分子取代含缺失靶的基因組區域。如下面例子所述，載體PBAD α β y攜帶可用于大腸桿菌的同源重組系統，描述于Muyrers，J.P.P.等，Nucl.Acids Res.27:1555-1557 (1999)。也可使用另一個質粒 pKD46，描述于Datsenko, K.A.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.97:6640-6649 (2000)。其它可用的質粒包括pGPXX和pJGXX。PGPXX獲得自pBAD α β Y，通過用pSClOl復制起點取代pBAD α β y的復制起點。PJGXX是pSClOl質粒，在tet啟動子控制下從噬菌體933W中編碼Red功能。
[0089]無瘢痕缺失方法的第三個步驟包括去除插入DNA序列。序列特異性核酸酶如1-SceI的表達載體導入細菌，1-SceI識別插入DNA序列上的獨特識別位點。隨后表達序列特異性核酸酶并切割細菌基因組。切割后，僅發生同源重組導致插入線性DNA分子缺失的細胞可存活。因此，獲得細菌的靶DNA序列從基因組中缺失。能用于大腸桿菌的序列特異性核酸酶表達載體例子包括 pKSUCl、pKSUC5、pSTKST、pSTAST、pKTSHa、pKTSHc、pBADScel和pBADSce2。這些載體攜帶的序列特異性核酸酶是1-Scel。pKSUCl、pKSUC5、pSTKST和pSTAST描述于下面例子中。
[0090]上述方法可在細菌中反復使用以產生一系列缺失。當用于同源重組系統的表達載體和用于獨特序列特異性核酸酶的表達載體彼此不相容時，如PBAD α β y和pKSUCl的情況，每個缺失循環必須進行2個載體轉化。當使用2個相容質粒如pBAD αβy和pSTKST或PKD46和pKSUC5時，在另外缺失循環中可避免轉化2個載體。使用2個這些彼此不相容載體的例子描述于下面例子中。
[0091]可修改上面無瘢痕缺失方法以在細菌基因組上更有效產生一系列缺失(其例子是下面實施例的過程4)。修改方法的第一個步驟包括以平行方式在細菌細胞中產生單獨線性DNA分子插入，優選野生型細菌細胞，導致各攜帶單個插入的一組菌株。此步驟能如上所述完成。修改方法的第二個步驟包括將單個插入連續轉移到待減少基因組的靶細胞。Pl轉導是可用于轉移插入的一個方法例子。修改方法的第三個步驟包括重組去除插入序列，能如上所述完成。
[0092]新的以線性DNA為基礎的無瘢痕缺失方法II
[0093]在這個以線性DNA為基礎的新方法中，2個DNA序列改造到質粒載體中，I個與待缺失細菌基因組區域一個末端序列相同且另I個與細菌基因組區域另一個末端序列相同，方向類似。本文的載體定義為靶載體。2個DNA序列在靶載體上彼此相鄰。至少一個僅切靶載體而不是細菌基因組的酶識別位點也在2個DNA序列外的位置改造到靶載體。識別位點可以是序列特異性核酸酶如1-Scel。識別位點也可用于僅切未甲基化序列的甲基化敏感限制性酶。由于細菌基因組上的識別位點(如果有)被甲基化，限制性酶僅能切靶載體。靶載體轉化到細菌中且線性DNA分子在細菌內產生，通過在細菌中表達識別和切割靶載體上識別位點的酶。其次，在細菌中活化可增加同源重組的系統以誘導線性DNA和待缺失區域側翼的細菌基因組同源序列間的同源重組。由于上面的同源重組可獲得靶基因組區域缺失的細菌。 [0094]這個以線性DNA為基礎的新方法也能用于使所需DNA序列取代細菌基因組區域。在此情況中，所需DNA序列改造到靶載體中，序列能與細菌基因組進行同源重組以取代基因組區域。所有其它方面與上述用于缺失細菌基因組區域的相同。
[0095]無論方法是用于缺失或取代細菌基因組的靶區域，由于高結合效率不需要標記基因，標記基因選擇靶載體上攜帶的DNA結合到細菌基因組。通過PCR簡單篩選30-100個菌落通常可鑒定細菌基因組中有所需修飾的克隆。
[0096]作為特定例子，圖3和4闡明用此方法將琥珀終止密碼子導入基因中部。作為第一個步驟，產生的DNA片段具有位于基因中部或染色體區域的所需修飾。序列特異性核酸酶1-SceI識別位點引入DNA片段一側。這可通過包括PCR引物5’末端序列來簡單完成，引物用于擴增DNA片段。更長的DNA片段(500-5，000個核苷酸)一般工作最佳。
[0097]DNA片段克隆到多拷貝的靶質粒載體如pUC19(GenBank登錄號M77789)。由于此靶載體與下述突變載體一起使用，靶載體改造成與P15A起點質粒(獲得自pACYC184)(GenBank登錄號X06403)相容且具有除了氯霉素的藥物抗性標記。這些限制可容易用另外突變質粒來避免。
[0098]如圖4所示，此例子所用突變質粒包含序列特異性核酸酶1-SceI和λ red基因exo、P-BAD啟動子控制下的β和Y。質粒也包含pl5A ori和氯霉素抗性基因。
[0099]靶和突變質粒轉化到recA陽性大腸桿菌。根據氯霉素抗性和靶質粒上攜帶的抗性選擇細菌。隨后挑出單菌落并在Iml豐富的成分明確培養基中37°C培養約7.0小時(Neidhardt等，J.Bacteriol.119:736_47，全部納入本文供參考)，培養基含0.2%阿拉伯糖和氯霉素。隨后連續稀釋(例如1: 1，000、1: 10，000等)的培養物平板培養于非選擇性培養基如LB。接著，篩選有所需突變的菌落。如果生長表型已知，篩選可通過在適當培養基上通過膜片形成來完成。否則，篩選用菌落PCR進行，接著通過限制性消化和電泳或測序。
[0100]以自殺性質粒為基礎的方法
[0101]本文所述以自殺性質粒為基礎的方法可用于無瘢痕基因缺失和基因取代。發明的基本要素包括名為聯鎖(Interlock)質粒的質粒載體，質粒含抗生素抗性基因和啟動子控制下的復制起點。聯鎖質粒也包含一個或多個可插入DNA插入片段的位置。當方法用于無瘢痕缺失時，DNA插入片段包括兩個彼此相鄰的DNA序列，方向類似，一個與待缺失細菌基因組區域一個末端側翼序列相同且另一個與細菌基因組區域另一個末端側翼序列相同。當方法用于基因取代時，DNA插入片段包括取代細菌基因組片段的序列。當控制復制起點的啟動子被關閉時，質粒的復制被關閉且抗生素壓力能用于選擇在側翼區域位置的染色體整合。染色體在側翼區域位置整合后，控制質粒復制起點的啟動子可被打開，能存活的細菌僅是發生重組以去除所述復制起點、其啟動子或兩者的細菌。當DNA插入片段用于產生無瘢痕缺失時，整合插入和對應基因組區域間的重組會導致細菌在任何整合前具有所需取代或相同基因組。隨后可進行篩選步驟以鑒定基因組中有所需修飾的細菌。
[0102]上面方法的變化包括相同的聯鎖質粒，除了質粒也包含細菌基因組中缺乏的序列特異性核酸酶識別位點。染色體整合后，改造細菌以表達序列特異性核酸酶用于切割細菌基因組和選擇重組，而不是活化復制起點控制啟動子以選擇重組。
[0103]以自殺性質粒為基礎的方法也可以與上述線性DNA為基礎的新方法類似方式反復使用，以在細菌基因組上產生一系列缺失。[0104]圖6顯不質粒實施方案,能用于以自殺性質粒為基礎的方法。pIL_l是聯鎖質粒且pBAD-Sce-Ι是表達序列特異性核酸酶1-SceI的質粒。pIL_4是兩者的組合。pIL_l和PIL-4所用tet啟動子被緊密調節并因此相對其它控制機制如溫度敏感元件具有優勢，溫度敏感元件更加滲漏。使用PIL-4以取代基因的例子示于圖5A-C，用于闡明本發明以自殺性質粒為基礎的方法。圖5A顯示DNA插入片段pIL-4和pIL_4整合到細菌基因組。有了熱活化氯四環素(CTC)，tet阻遏物失活，O和P啟動子有功能，質粒復制。去除CTC后，tet阻遏物結合O啟動子和P啟動子并阻礙復制。氯霉素抗性可用于選擇整合子。圖5B顯示用異位起點誘導以選擇同源重組和同源重組的2個可能結果。圖5C顯示另一種選擇同源
重組的方法和同源重組的2個可能結果。此另外方法包括誘導1-SceI表達以產生雙鏈斷
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[0105]以自殺性質粒為基礎的方法的2個特定實施方案在下面描述為操作I和操作2。PlL-1和pIL-4能用于操作I，pIL-Ι結合pBAD-Sec-Ι能用于操作2。本領域普通技術人員也可修改操作2，單獨使用pIL-4。
[0106]操作1(用λ起點反選擇):
[0107]1.生成所需基因組修飾作為線性DNA片段。在產生琥珀突變體的情況中，修飾可用兆引物PCR進行。為在基因組中進行缺失，應使用所需缺失終點的融合。應磷酸化DNA片段末端用于克隆。
[0108]2.產生鈍克隆位點，通過用限制性酶Srfl消化pIL4載體(圖5A和6)。載體脫磷酸。
[0109]3.鈍端連接所需修飾和pIL4載體。
[0110]4.(注意:此步驟可能在高通量實施中不是必要的)。將連接轉化到大腸桿菌克隆菌株(如JS5)中。轉化在LB+lug/ml cTc中生長I小時(cTc-在LB培養基中新高壓滅菌的氯四環素。100 μ g/ml貯存物高壓滅菌20分鐘，隨后在4°C暗處保存。它可使用直至5天。另外，可置換2ng/ml無水四環素溶液)。然后平板培養于LB+氯霉素(Cam 25 μ g/ml)+CTC(ll.! g/ml)，37°C生長過夜。在相同培養基中生長菌落并準備質粒小量制備DNA。通過凝膠電泳分析且選擇有插入的克隆。
[0111]5.將確認的質粒轉化到recA陽性大腸桿菌菌株(如MG1655)。在LB+1 μ g/mlcTc中生長I小時。部分生長物在含Cam和I μ g/ml cTc的平板上培養。37°C生長過夜。
[0112]6.將菌落挑到Iml LB中，10μ I在Cam平板上培養。37 °C生長過夜。
[0113]7.在Cam平板上劃線菌落以確保每個存在的細胞包含整合質粒。37°C生長過夜。
[0114]8.將菌落挑到Iml LB中，ΙΟΟμΙ的1: 100稀釋在Cam平板上培養，平板含5 μ g/ml cTc。37°C生長過夜。
[0115]9.(篩選突變)僅部分反選擇菌落包含所需突變，其它的回復成野生型。突變體與回復體的比例取決于修飾在克隆片段中的位置。必須進行一些種類的篩選以鑒定所需突變。為生成琥珀突變體，所討論基因可通過PCR擴增并用BfaI限制性酶消化(BfaI切前面是’ C’的琥珀密碼子)。
[0116]操作2 (用1.Scel高通暈反選擇):
[0117]1-4與操作I相同。
[0118]5.攜帶插入的聯鎖質粒和pBAD-Scel共轉化到recA陽性大腸桿菌菌株(如MG1655)。在LB+I μ g/ml cTc中生長I小時。(另外,攜帶插入的聯鎖質粒可自身轉化到已攜帶pBAD-Scel的感受態 細胞)。
[0119]6.加入氯霉素到25 μ g/ml且卡那霉素到50 μ g/ml。37°C振蕩生長1-2小時。
[0120]7.細胞在微離心機中沉淀30秒。去除培養基上清。
[0121]8.(整合步驟)細胞重懸浮于Iml LB+氯霉素(25 μ g/ml) +卡那霉素(50 μ g/ml) +葡萄糖(0.2% )，37°C振蕩生長過夜。
[0122]9.過夜培養物在相同培養基中1: 10，000稀釋，37°C另外生長16-24小時。
[0123]10.(反選擇步驟)10 μ I培養物稀釋到Iml 1χΜ9最少鹽(以最小化生長速度)。將它分成2管，0.5ml每管。一管加入阿拉伯糖到0.2%，另一管加入葡萄糖到0.2% (作為負對照)。37°C振蕩生長1-2小時。
[0124]11.10 μ I阿拉伯糖管平板培養于LB+卡那霉素(50 μ g/ml) +阿拉伯糖(0.2% )，10 μ I葡萄糖管平板培養于LB+氯霉素(25 μ g/ml) +卡那霉素(50 μ g/ml) +葡萄糖(0.2% ) 0 37°C生長過夜。
[0125]12.(篩選突變)進行原始操作的步驟9。
[0126]實施例
[0127]JIM
[0128]用于PCR構建人工插入DNA序列的質粒命名為pSG76_CS (GenBank登錄號AF402780)，它通過插入第二個1-SceI位點從pSG76_C獲得(Posfai，G.等，J.Bacteriol.179:4426-4428 (1997))。第二個 1-SceI 位點通過 PCR-調節插入第二個1-SceI識別位點到pSG76-C的NotI位點下游來獲得。2個1-SceI位點方向相反。
[0129]pBAD α β Y質粒用于提高線性DNA片段重組到基因組中。此質粒描述于Muyrers, J.P.P.等，Nucl.Acids Res.27:1555-1557 (1999)。
[0130]用于表達1-SceI的PKSUCl質粒(GenBank登錄號AF402779)獲得自PSG76-K(Posfai,G.等，J.Bacteriol.179:4426-4428(1997))和pUC19RP12 (Posfai，G.等，Nucl.Acids.Res.27:4409-4415 (1999))。pSG76_K 的 Xba1-NotI 片段(攜帶 Kan 基因；NotI末端通過Klenow聚合酶變成鈍端)連接pUC19RP12的Xba1-DraI片段(攜帶1-SceI基因和 pUC ori) ο
[0131]pKSUC5 質粒獲得自 pFT-K(Posfai，G.等，J.Bacteriol.179:4426-4428(1997))和pKSUCl。pKSUCl的大Xba1-NcoI片段連接攜帶tet阻遏物的pFT-Κ的Xba1-NcoI片段。
[0132]PKD46質粒用于提高線性DNA片段重組到基因組中，描述于Datsenko，K.A.等，Proc.Natl.Acad.Sc1.97:6640-6649 (2000)。
[0133]用于四環素-調節表達1-SceI的質粒pSTKST (GenBank登錄號AF406953)是低拷貝數 KanK 質粒，獲得自 pFT-K (Posfai, G.等，J.Bacteriol.179:4426-4428 (1997))和 pUC19RP12 (Posfai, G.等，Nucl.Acids Res.27:4409-4415 (1999))。攜帶 1-SceI 基因的PUC19RP12的Xba1-PstI片段連接pFT_K的大Xba1-PstI片段。當由四環素誘導時，此質粒表達1-Scel。質粒復制是溫度-敏感的(Posfai，G.等，J.Bacteriol.179:4426-4428(1997))。
[0134]質粒pSTAST是用于四環素-調節表達1-SceI的低拷貝數Αρκ質粒，獲得自pFT-A(Posfai, G.等，J.Bacteriol.179:4426-4428(1997))和 pUC19RP12 (Posfai，G.等，Nucl.Acids Res.27:4409-4415 (1999))。攜帶 1-SceI 基因的 pUC19RP12 的 Xba1-PstI 片段連接pFT-A的大Xba1-PstI片段。當由四環素誘導時,此質粒表達1-SceI。質粒復制是溫度-敏感的(Posfai, G.等，J.Bacteriol.179:4426-4428 (1997))。
[0135]缺失過程I
[0136]所述方法用于反復在大腸桿菌K-12基因組中產生缺失。此過程是無瘢痕的缺失方法。過程開始是通過PCR構建線性靶片段。這通過混合20pmol引物A和20pmol引物B，在總共50 μ I體積中進行PCR來完成。循環參數為15x(94°C 40秒/57°C或更低(取決于A和B的重疊)40秒/72°C 15秒)。取出I μ I上面PCR混合物，加入各20pmol的引物A和C，加入50ng ?5676-05模板，在2#(^1體積中進行PCR (用50 μ I管，組合2管以獲得更多DNA)。所用循環參數為28x (94°C 40秒/57°C 40秒/72°C 80秒)。為從上面步驟中純化PCR混合物，使用Promega Wizard PCR purification試劑盒。所得DNA片段懸浮于20 μ I水。
[0137]其次是通過插入人工DNA片段來取代基因組區域。這通過取攜帶pBAD α β Y的靶細胞和制備所述電感受態細胞(Posfai, G.等，Nucl.Acids Res.27:4409-4415 (1999))，除了在收集細胞前0.25-1小時加入0.1 %阿拉伯糖到培養物。4μ I DNA片段(100-200ng)電穿孔到40 μ I電感受態細胞。細胞在Cam平板(25 μ g/ml)上培養且37°C孵育。通常的結果是過夜培養后獲得總共10到幾百個菌落。用引物D和E通過PCR檢查在正確位置插入片段的一些菌落。
[0138]接著是缺失插入序列。這是通過CaCl2方法從上面所選菌落制備感受態細胞來完成(Sambrook, J.等，《分子克隆:實驗室手冊》(Molecular Cloning:A LaboratoryManual).Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989))。質粒pKSUCl (~IOOng)通過標準過程轉化到細胞中(Sambrook, J.等，《分子克隆:實驗室手冊》.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY(1989))。細胞在Kan平板上培養且37°C孵育(pKSUCl和pBAD α β Y不相容，因此在Kan平板上選擇使pBADα β Y從細胞中去除)。用引物D和E通過PCR檢查正確缺失的菌落。選擇攜帶正確缺失的菌落。在此點，細胞攜帶pKSUCl。下一步是缺失此質粒。
[0139]缺失通過pBADa β y取代pKSUCl完成。選擇來自前一步驟的菌落，在非選擇條件下37°C生長于LB中，細胞再接種到新鮮培養基中2-3次。制備感受態細胞用于化學轉化或電穿孔。質粒PBAD α β y (100-200ng)轉化到感受態細胞中，細胞在Amp平板上培養。用牙簽在Kan和Amp平板上挑出100個菌落來選擇Kan敏感/Amp抗性的菌落。
[0140]所選菌落可用于下一輪缺失，通過使用新的靶片段和重復上面步驟。如果不需要更多缺失，細胞在非選擇條件下(不加入Amp)生長導致pBAD α β y從細胞長片段中自發失去。
[0141]缺失討稈I
[0142]此過程與過程I類似，但pKSUCl被pSTKST取代。此質粒與pBADa β y相容，有溫度-敏感的復制子，表達1-SceI需要氯四環素(CTC)誘導。從細胞中去除pSTKST的優勢是容易完成，通過培養物在42°C生長。
[0143]通過PCR構建線性靶片段和通過插入片段來取代基因組區域如過程I所述完成。
[0144]為缺失插入片段，感受態細胞從來自所選菌落的培養物制備，菌落有正確插入。細胞用pSTKST轉化，在Kan+Cam平板上培養且30°C孵育。來自此平板的菌落接種到IOmlLB+Kan中，其中添加熱處理的誘導物CTC(終濃度25 μ g/ml)并在30°C生長24小時。此步驟用于誘導1-SceI表達。稀釋培養物隨后在LB+Kan平板上鋪開且30°C過夜培養。檢查6-12個菌落，用引物D和E通過PCR檢查正確缺失。選擇攜帶正確缺失的菌落。
[0145]為從細胞中去除輔助質粒，培養物在42°C生長于LB中(沒有加入抗生素)。
[0146]討稈3
[0147]由于pBADa β y和pSTKST攜帶相容復制子，當在相同宿主中進行連續缺失時,不需重復轉化質粒。2個質粒通過抗生素選擇(Kan+Amp)經連續缺失構建在宿主細胞中維持。重組酶和特定核酸酶功能僅當需要時誘導。因為pSTKST復制是溫度-敏感的，細胞必須在30°C生長。
[0148]此過程與過程2相同，除了 pBAD α β Y和pSTKST僅轉化到細胞中I次，直到需要在細胞中維持2個質粒，培養物在30°C生長，Amp+Kan包括在培養基中。注意:有時我們在2(Amp+Kan)或3種(Amp+Kan+Cam)抗生素存在時30°C生長細胞有困難。
[0149]討稈4
[0150]當在相同細胞中進行一些連續缺失時，這是優選過程。插入(線性片段重組到攜帶pBAD α β y的宿主細胞基因組中)平行進行，產生一系列重組細胞，各自攜帶單個插入。隨后這些插入通過Pl轉導依次轉入細胞，細胞攜帶PSTKST且有前面全部缺失。通過誘導pSTKST在此最終宿主中去除所有外源序列。與前面方法相比，主要區別是插入步驟和去除插入序列在不同細胞中進行。由于插入平行進行，構建連續缺失更迅速。另一個優勢是細胞僅在第一次缺失構建開始時通過質粒轉化。
[0151]此過程在技術上與過程2相同，除了單獨插入通過Pl轉導轉入已有pSTKST的缺失菌株。各Pl轉導步驟后，誘導1-SceI表達以去除插入序列。
[0152]結果
[0153]對大腸桿菌菌株K-12 MG1655進行12個連續基因組缺失。選擇12個缺失區域用于缺失，部分來自大腸桿菌菌株0157: H7 EDL933和菌株K-12 MG1655基因組DNA序列的比較結果。缺失列于下表1。序列編號方式取自發表的K-12序列。
[0154]第一個缺失MDl用 Posfai，G.等，Nucl.Acids Res.27:4409-4415(1999)所述方法產生。用此方法產生MDl缺失，在染色體缺失位置留下114-bp pSG76-CS載體序列，包括FRT位點。MD2到MD6缺失用上述過程I產生。缺失MD7到MD12用過程4結合過程I或2產生。各新缺失的菌株命名和基因組坐標是:MDl 263080-324632 ；MD2 1398351-1480278 ；MD32556711-2563500 ；MD4 2754180-278970 ；MD5 2064327-2078613 ；MD6 3451565-3467490 ；MD 72464565-2474198 ；MD8 1625542-1650865 ；MD9 4494243-4547279 ；MD103108697-3134392 ；MD111196360-1222299 ；MD12 564278-585331。
[0155]在此階段總共去除378，180個堿基對，約為天然K-12MG1655大腸桿菌基因組的
8.1%。從基因組中去除這些區域不影響細菌存活或細菌生長。
[0156]下表2列出大腸桿菌基因組的其它片段、基因和區域，鑒定為進一步缺失的候選。片段也成功地從細菌基因組中去除。再次，產生這些缺失而對實驗室和工業用途細菌的有效性沒有明顯有害效果。序列命名也取自發表的K-12序列。2組缺失總計約為14%的原始細菌基因組。要指出的是基因本身能和側翼DNA —起缺失，只要側翼DNA不破壞宿主生長和存活必需的基因。
[0157]在過程I中，插入線性片段的效率隨著特定基因座而變化。正確位點插入在1-100% (通常20-100% )菌落中發生。使用范圍從42到74bp的側翼同源物。更長的同源物插入效率更好。重復 序列間的正確位點切除在1-100% (通常10-100%)菌落中發生且取決于重復區域長度。更長的重復一般更有效。重復序列長度范圍從42到50bp。表面上同樣重復的實驗間插入和切除效率有變化且現在還未充分理解。
[0158]過程3通過再產生缺失MD2來測試。正確位點插入線性DNA片段在6.6%菌落中發生。缺失插入序列很有效。25個所得菌落影印培養到Cam+Amp+Kan和Amp+Kan平板上，19個證明是Cam敏感。隨后這些菌落中的5個通過PCR測試，5個全部顯示失去預計的插入片段。
[0159]表8和表9更精確描述缺失基因終點，基因從界標中刪去或待刪。大腸桿菌菌株MDS12、MDS40和MDS73 (表8和表9)是中間菌株的缺失終點，中間菌株用于購建標志菌株。表9所列基因由數字“b”標識，以Blattner等,Science,同上和GenBank登錄號400096所述命名為基礎。表8的編號方式也以Blattner等同上為基礎。
[0160]確定缺失菌株特征
[0161]轉化頻率
[0162]需要將外源DNA結合到大腸桿菌缺失菌株基因組中，所用方式使宿主細菌細胞在分裂和生長時維持整合DNA。將外源DNA導入細菌宿主基因組的方法稱為轉化，有外源DNA的生物體稱為轉化生物。本領域需要有高轉化頻率的大腸桿菌菌株。
[0163]大腸桿菌菌株MDS39通過在親代大腸桿菌菌株中進行39個缺失(約14.1%基因組)來構建，發現通過電穿孔轉化效率高。此高效轉化延伸到吸收大尺寸BAC (細菌人工染色體)DNA,使菌株MDS39對廣泛范圍的應用有特定價值。
[0164]為測試大腸桿菌菌株MDS39的轉化效率，MDS39有且穩定維持外源DNA，三種菌株:DH10B、MDS31和MDS39在標準生長條件下生長至600nm光密度為0.5。旋轉離下細胞培養物，細胞沉淀用水洗幾次，最終重懸浮于水(以1/1000的原始培養體積)。25叩pBR322 DNA或甲基化BAC DNA或未甲基化BAC DNA加入100 μ I細胞懸浮液并用標準電穿孔操作進行電穿孔，如1.8kV和0.1cm電穿孔杯中的150ohms電阻，使用Invitrogen電穿孔儀II?裝置。在EcoK位點甲基化的BAC DNA和pBR322 DNA用標準操作在大腸桿菌菌株MG1655中制備。未甲基化BAC DNA在大腸桿菌菌株DHlOB中制備。[0165]表3顯示菌株MDS31和MDS39都能被分子量為4，636個堿基對的pBR322DNA和分子量為100，000個堿基對的甲基化BAC DNA有效轉化。甲基化BA⑶NA對菌株MDS31和MDS39的轉化效率可與對菌株DHlOB的轉化效率相比，DHlOB是目前認為轉化效率最佳的菌株之一。
[0166]當用未甲基化BAC DNA轉化時，菌株MDS39的轉化效率高于菌株DHlOB的轉化效率(表3)，而菌株MDS31的轉化效率低于菌株MDS39和DHlOB的轉化效率。菌株MDS31的轉化效率低是由于未甲基化DNA在菌株中受到限制，因為MDS31是r+m+菌株，而菌株DHlOB和MDS39是r-m-菌株。
[0167]最近MDS39的工作顯不可能在序列gb_ba:ecu 95365中存在剩余插入序列IS5。為確定從MDS39中缺失固有IS序列的效果，本文所述過程用于缺失此序列。MDS40中缺失的終點是表8和9的菌株。隨后測試所得菌株MDS40的轉化和生長特征(結果)，如下所討論。
[0168]電穿孔-感受態細胞如Invitrogen電穿孔儀II手冊所述制備。簡要地，200ml培養物生長到OD55tl = 0.5，然后離心收集細胞，用冰水洗2次和冰的10%甘油洗I次，重復離心和懸浮。在最后步驟時，細胞沉淀懸浮于0.4ml 10%甘油，等分成40 μ I部分并保存于-80°C。
[0169]細胞通常用IO-1OOng量的質粒DNA以1.8kV和0.1cm電穿孔杯中的150 Ω電阻電穿孔，使用電穿孔儀II裝置(Invitrogen)。然后細胞用Iml LB稀釋,搖床中接種I小時，在選擇性培養基上平板培養。
[0170]進行一些試驗，結果以數量級變化。2個典型、單獨實驗(各2次平行)的平均值不于表5。
[0171]也使用MG1655、MDS40和DHlOB的轉化效率，它們用化學轉化方法。感受態細胞通過簡單方法制備。冷凍50ml培養物并在OD55tl = 0.4離心收集，隨后用1/20體積的冰CaCl2溶液(IOmM Tris ρΗ7.5、15%甘油、60mM CaCl2)洗2次，重復離心和懸浮。接著細胞在冰上孵育I小時，等分成200 μ I部分并保存于_80°C。
[0172]對于轉化，細胞通常混合IOOng質粒DNA，冰上孵育30分鐘，42°C熱激2分鐘，然后加入0.8ml LB。細胞在37°C培養0.5-1小時，接著稀釋物在選擇性培養基上平板培養。結果不于表6。
[0173]牛長特征[0174]如上所討論，需要通過本發明方法制備的缺失菌株有很強能力在特定培養條件下生長。生長研究進行如下。
[0175]比較37°C時大腸桿菌菌株細胞的倍增時間(？)，時間以分鐘計，用96孔板讀數器(SpectraMax plus,Molecular Devices)搖動測量。生長曲線的線性部分對數用于計算平均倍增時間和平板上6個重復的標準偏差。盡管此裝置提供方便的方法進行比較測量，它不產生很好的細胞從而生長速度比搖瓶慢2倍。O
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【權利要求】
1.一種大腸桿菌，所述大腸桿菌的基因組被遺傳改造成比其天然親代大腸桿菌菌株基因組小5%至40%，其中從所述細菌基因組缺失的序列不會不利地影響細菌在特定生長條件下生存和增殖的速度，其中大腸桿菌基因組被遺傳改造以從大腸桿菌基因組中缺失一個或更多個DNA，該DNA選自天然親代菌株基因組中的鞭毛基因、限制性修飾系統基因、脂多糖表面基因、插入序列、rhs元件、毒素基因、致病基因、菌毛基因、侵襲素基因、周質蛋白基因、膜蛋白基因、原噬菌體、假基因、K島、噬菌體受體、非轉錄區以及不在任意兩個大腸桿菌菌株中都存在的基因或其它DNA序列， 其中所述大腸桿菌的基因組缺失了以下基因或其直系同源物中的一個或更多個:
b0247-b0310(MDl)， bl337_bl41I(MD2)， b2442_b2450(MD3)， b2622_b2660(MD4)，bl994-b2008 (MD5) , b3323_b3338 (MD6)，b2349_b2363 (MD7)，bl540_bl579 (MD8)，b4271-b4320(MD9), b2969_b2987(MDlO)，bll38_bll72(MDll)，b0538_b0565(MD12)，b0016-b0022 (GPl), b0577_b0582 (GP2)，b2389_b2395 (GP3)，b0358_b0368 (GP4)，b0370-b0380 (GP5)，b2856_b2863 (GP6)，b3042_b3048 (GP7)，b0656 (GP8)，bl325-bl333 (GP9)，b2030_b2062(GPlO)，b2190_b2192(GPlI)，b3215_b3219(GP12)，b3504-b3505 (GP13)，bl070_bl083 (GP14)，bl878_bl894(GP15)，bl917_bl950(GP16)，b4325-b4358(GP17)，b0497_b0502(GP18)，b0700_b0706(GP19)，bl456_bl462(GP20)，b3482-b3484(GP21)，b3593_b3596(GP22)，b0981_b0988(GP23)，bl021_bl031(GP24)，b2080-b2096(GP25), b3441_b3446(GP26), b3557_b3558(GP27), and b0150-b0153(MD40)。
2.如權利要求1所述的大腸桿菌，其基因組被遺傳改造成比其天然親代菌株基因組小5%M 20%。
3.如權利要求1或2所述的大腸桿菌，其基因組被遺傳改造成小于4.27Mb。
4.如權利要求1-3中任 一項所述的大腸桿菌，其基因組被遺傳改造成小于4.00Mb。
5.如權利要求1所述的大腸桿菌，所述大腸桿菌基因組中一個或多個編碼蛋白質的基因被缺失，所述蛋白分泌到其周質或在周質中加工，所述一個或多個基因選自fliY、yedO、nfnB、tauA、mppA、tynA、chiA、fimC、fecB、ygiH、yagP 和 yhcA。
6.如前述權利要求1-5中任一項所述的大腸桿菌，當與其天然親代相比時，缺乏21.5%的蛋白質編碼基因。
7.一種通過在細菌基因組中己知序列的所選基因組區域產生缺失而不引入瘢痕來產生權利要求1至6中任一項所述細菌的方法，所述方法包括步驟: 產生人工DNA序列，所述人工DNA序列包括:一端是與待缺失基因組區域左側翼基因組序列相同的I號序列，接著是與待缺失基因組區域右側翼基因組序列相同的2號序列；另一端是與待缺失基因組區域中基因組序列相同的3號序列；以及線性DNA分子一端的2號序列與線性DNA分子另一端的3號序列之間的序列特異性核酸酶識別位點，其中所述識別位點不存在于細菌基因組中； 在有利于第一和第三序列與細菌基因組中序列同源重組的條件下將人工DNA序列導入細菌； 將表達載體導入細菌，所述細菌基因組包含插入正確位置的線性DNA分子，該表達載體用于表達識別識別位點的序列特異性核酸酶； 在細菌中表達所述序列特異性核酸酶；以及收集在該序列特異性核酸酶表達時存活且包含正確缺失的細菌，和任選地重復上述步驟直至獲得其基因組具有至少5%缺失的細菌。
8.如權利要求7所述的方法，還包括步驟: 提供細菌，所述細菌包含用于系統的表達載體和用于序列特異性核酸酶的表達載體，所述系統能增加同源重組頻率，所述序列特異性核酸酶識別細菌基因組中不存在的識別位點，其中該序列特異性核酸酶的表達在誘導型啟動子控制下且兩個表達載體相容。
9.如權利要求7或8所述的方法，所述序列特異性核酸酶是1-SceI。
10.一種通過在細菌基因組中已知序列的所選基因組區域產生缺失來產生權利要求1至6中任一項所述細菌的方法，所述方法包括步驟: 提供載體，載體包括序列特異性核酸酶識別位點和兩個DNA序列，一個與待缺失細菌基因組區域一側的側翼序列相同，另一個與細菌基因組區域另一側的側翼序列相同，其中兩個DNA序列在載體上彼此相鄰，其中序列特異性核酸酶識別位點在載體上位于兩個DNA序列外； 將載體導入細菌； 將表達載體導入相同細菌，表達載體用于表達識別識別位點的序列特異性核酸酶； 將能增加同源重組頻率的系統導入相同細菌并在細菌中同時表達序列特異性核酸酶；以及 鑒定待缺失基因組區域被缺失的細菌，和任選地重復上述步驟直至獲得其基因組具有至少5%缺失的細菌。
11.一種改進了的在細菌中表達重組蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括:將載體導入權利要求1-6中任一項所述的細菌，所述載體包括帶有信號序列的編碼蛋白質的DNA，該DNA序列與表達控制序列操作相連；和 使細菌在適于表達蛋白編碼DNA的營養條件下生長。
12.如權利要求11所述的方法，所述表達控制序列組成型表達，或者，所述表達控制序列是誘導型啟動子。
【文檔編號】C12N15/09GK103540543SQ201310363511
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2003年1月22日 優先權日:2002年1月23日
【發明者】F·R·布拉特納, G·波斯發, C·D·赫林, G·普倫基特, J·D·格蘭斯納, T·M·托斯 申請人:威斯康星校友研究基金會