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一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時(shí)表達(dá)體系建立的方法與流程

文檔序號:12108905閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時(shí)表達(dá)體系建立的方法,其特征在于,將洋蔥表皮細(xì)胞侵染在含有農(nóng)桿菌的侵染培養(yǎng)基中,20~22℃侵染10~20分鐘,光下培養(yǎng)24小時(shí)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時(shí)表達(dá)體系建立的方法,其特征在于,包括以下步驟:

(1)取洋蔥內(nèi)表皮塊;

(2)含有目標(biāo)基因的農(nóng)桿菌侵染培養(yǎng)基的配置:將活化一次的攜帶雙元載體的農(nóng)桿菌接種到10ml YEB液體培養(yǎng)基中,28℃200rpm搖動培養(yǎng)過夜;將菌液再次轉(zhuǎn)接到新鮮的10ml YEB液體培養(yǎng)基中,28℃200rpm搖動4~5小時(shí),OD600=0.5~0.8;將菌液4℃低溫4000rpm離心6min后倒掉上清,用侵染培養(yǎng)基將菌體重懸致濃度OD600=0.3,添加Silwet L-77;

(3)洋蔥表皮侵染:在無菌條件下,將洋蔥內(nèi)表皮塊放到含有菌體的添加了Silwet L-77的侵染培養(yǎng)基中,輕輕晃動,侵染10~20min;侵染后將洋蔥表皮靠近葉肉的一側(cè)朝下放到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上;共培養(yǎng)培養(yǎng)皿放到光下20±2℃24個(gè)小時(shí)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時(shí)表達(dá)體系建立的方法,其特征在于,步驟(1)具體為:將洋蔥鱗莖,去除外層1~2層鱗葉,將洋蔥鱗莖消毒后在超凈工作臺內(nèi)用無菌水將鱗莖洗干凈,縱切開洋蔥鱗莖,取中層靠內(nèi)的較肥厚的鱗葉,在這些鱗葉內(nèi)部用解剖刀輕畫1cm2的十字方塊若干,撕下這些洋蔥內(nèi)表皮塊。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時(shí)表達(dá)體系建立的方法,其特征在于,所述洋蔥鱗莖消毒是70~75%的乙醇消毒。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時(shí)表達(dá)體系建立的方法,其特征在于,步驟(2)中所述農(nóng)桿菌菌株為EHA105或GV3101。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時(shí)表達(dá)體系建立的方法,其特征在于,步驟(2)中將活化一次的攜帶雙元載體的農(nóng)桿菌接種到10ml YEB液體培養(yǎng)基中,體積比為1:100,YEB液體培養(yǎng)基含有100μg/mL利福平、50μg/ml卡那霉素或者100μg/ml壯觀霉素,100μM乙酰丁香酮;

將菌液再次轉(zhuǎn)接到新鮮的10ml YEB液體培養(yǎng)基中,體積比1:10;YEB液體培養(yǎng)基含有100μM乙酰丁香酮。

7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時(shí)表達(dá)體系建立的方法,其特征在于,步驟(2)中用侵染培養(yǎng)基將菌體重懸致濃度OD600=0.3,所用的侵染培養(yǎng)基為高粱浸染培養(yǎng)基,侵染培養(yǎng)基中添加0.01%的Silwet L-77。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時(shí)表達(dá)體系建立的方法,其特征在于,添加了Silwet L-77的高粱侵染培養(yǎng)基每L包括以下成分:MS培養(yǎng)基4.43g,葡萄糖36g,蔗糖68.5g,MES培養(yǎng)基0.5g,Silwet L-77 0.01%,乙酰丁香酮100μM,pH 5.8。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時(shí)表達(dá)體系建立的方法,其特征在于,步驟(3)中共培養(yǎng)培養(yǎng)基為高粱共培養(yǎng)培養(yǎng)基,每L包括以下成分:MS培養(yǎng)基4.43g,葡萄糖10g,蔗糖20g,MES培養(yǎng)基0.5g,瓊脂8g,乙酰丁香酮100μM,pH 5.8。

10.如權(quán)利要求1所述的一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效洋蔥瞬時(shí)表達(dá)體系建立的方法在目標(biāo)蛋白的亞細(xì)胞定位以及蛋白與蛋白的互作方面的應(yīng)用。

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