本發明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種促進植物吸收養分的基因、其編碼的氨基酸序列和表達載體以及應用。

背景技術：

在我國西北地區較為惡劣的自然環境下，如何提高植物的抗逆性能一直是困擾科研工作者的難題。近年來，科研工作者使用基因工程育種的方法，將抗逆境基因轉入植物中以得到抗逆性能優越的植物新品種，所以擁有自主知識產權的抗逆境基因是世界植物分子育種領域競爭的焦點。但是，我國植物分子育種能力同發達國家差距巨大，目前能為植物帶來優良抗逆性能的基因還未公開。

技術實現要素：

為了解決現有技術存在的上述問題，本發明提供了一種促進植物吸收養分的基因、其編碼的氨基酸序列和表達載體以及應用。所述基因取自樟子松，能夠促進植物在養分貧瘠和高鹽堿條件下的生長。

本發明所采用的技術方案為：一種促進植物吸收養分的基因，定名為CML22基因。所述CML22基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

與所述CML22基因序列對應的，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本發明還提供了一種表達載體，其中包含所述CML22基因序列。

本申請的發明人，利用分子克隆技術，從樟子松中對有關Ca²⁺抗逆境基因CML22進行克隆，最終得到用于基因表達的表達載體，并將其導入到擬南芥中，最終獲得轉基因植株，通過對轉基因植株進行表型分析了解基因的生物學功能。結果顯示，在正常全培養基(CK)、養分貧瘠以及高鹽堿和含有1μM干旱激素ABA的培養基等多種實驗條件下，轉基因植物的鮮重都顯著高于正常植物， 證明了所述CML22基因序列、其編碼的氨基酸序列和包含有CML22基因序列的表達載體能夠應用于培育抗養分貧瘠和/或高鹽堿植物中。

本發明的有益效果為：本發明公開了一種促進植物吸收養分的基因、其編碼的氨基酸序列和表達載體以及應用，通過將所述基因導入到擬南芥中，最終獲得抗逆性能優越的轉基因植株。

附圖說明

為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是整個基因工程育種的技術流程簡圖；

圖2是不同擬南芥植物在不同培養基上使用相同的培養條件培養后的根長統計；

圖3是不同擬南芥植物在不同培養基上使用相同的培養條件培養后的鮮重統計。

具體實施方式

為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明的技術方案進行詳細的描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中；的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬于本發明所保護的范圍。

在本發明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規方法。

實施例1

一種促進植物吸收養分的CML22基因，所述CML22基因的序列如SEQ ID NO：1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

實施例2

本實施例是利用實施例1中CML22基因進行基因工程育種的流程及驗證，具體步驟如下：

1、樟子松樣品采集

為了最大限度的增加其體內和抗逆性相關的RNA的豐富度，選擇在天氣相對寒冷的11月(2015年)進行樟子松根的取樣，樣品在收集后迅速保存于液氮中備用。

2、表達載體的構建

合成基因所用的克隆載體是pUC57-Simple，抗性是Amp(氨芐西林)。

2.1目的載體的連接和構建的完成

本實施例中用到的表達載體是pOREE3，其抗性為Kan(卡那霉素)。

目的載體的連接是將合成好的的基因片段和目的載體同時經過5’：BamHⅠ3':KpnⅠ的酶切，經過DNA膠回收，DNA連接酶連接，然后轉化大腸桿菌，經過菌落PCR和提取質粒，酶切驗證的方法，最終獲得連接到的載體基因的質粒。

本實施例中使用的雙酶切反應體系：

a、目的片段與表達載體的連接：

原則：按照目的片段和表達載體摩爾比是3:1或1:3的比例進行連接

T4DNA連接酶(1μl)+buffer(2μl)+17μl(目的片段+表達載體)16℃過夜連接

b、轉化：取大腸桿菌感受態于冰上解凍，將連有目的片段和表達載體的產物再次轉化到大腸桿菌感受態里，混勻，冰浴30分鐘，42℃熱激90秒，立即置于冰上2分鐘；加入500μl無抗性LB液體培養基，37℃搖床上200rpm或37℃恒溫培養箱靜置培養60分鐘后，將菌液涂布與含有相應抗生素(Kan50mg/ml)的固體LB平板上；37℃倒置培養過夜后觀察其結果。

c、挑取菌板上的單菌落加入到含有Kan(50mg/ml)抗生素的5ml LB培養液里，37℃搖床過夜培養。

d、質粒提取：選用TRAN的質粒提取試劑盒提取質粒

1)、取2ml過夜培養的菌液，10000x g離心1分鐘，去上清。如菌液量大，可分多次離心收集。

2)、加入250μl無色溶液RB(含RnaseA)，震蕩懸浮細菌沉淀，不應留有小的菌塊。

3)、加入250μl藍色溶液LB，溫和地上下翻轉混合4-6次，使菌體充分裂解，形成藍色透亮的溶液，顏色由半透亮變為透亮藍色，指示完全裂解(不宜超過5分鐘)。

4)、加入350μl黃色溶液NB，輕輕混合5-6次(顏色由藍色完全變成黃色，指示混合均勻，中和完全)，直至形成緊實的黃色凝集塊，室溫靜置2分鐘。

5)、12000x g離心5分鐘，小心吸取上清加入離心柱中。12000x g離心1分鐘，棄流出液。如上清體積大于800μl，可以分成多次加入柱中，并同上離心，棄流出液。

6)、加入650μl溶液WB，12000x g離心1分鐘，棄流出液。

7)、12000x g離心2分鐘，徹底去除殘留的WB。

8)、將離心柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入30-50μl EB或去離子水(PH>7.0)室溫靜置1分鐘。

9)、10000x g離心1分鐘，洗脫出的DNA于﹣20℃保存

e、酶切驗證：繼續選用前面所用的限制性內切酶5’：BamHⅠ3':KpnⅠ對陽性克隆質粒進行驗證。

雙酶切反應體系

37℃恒溫培養箱，溫浴30分鐘。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取帶型正確的進行保菌(40％黃蓋甘油)。

2.2、農桿菌轉化：電轉化法轉化農桿菌

1)、取農桿菌感受態，置于冰上融化，加入質粒約5μl，混勻后冰上放置30分鐘。

2)、同時準備干凈干燥的電轉杯，冰上預冷；

3)、將電轉杯表面擦干，把加有質粒的農桿菌全部加入電轉杯中后放入電轉儀，電激轉化；

4)、電轉杯加入1ml無抗生素的LB培養液，反復吹吸，吸入2ml離心管中，28℃搖床200rpm或28℃恒溫培養箱恢復培養1.5小時后；

5)、取500μl菌液涂布于含有抗生素(Rif 50mg/ml和Kan 50mg/ml)的固體LB培養基上，28℃恒溫培養箱倒置培養1—2天直至單克隆出現；

6)、選取陽性農桿菌單菌落進行搖菌，28℃搖床，250rpm，培養1-2天

2.3、農桿菌質粒提取：選用TRAN的質粒提取試劑盒提取質粒

1)、取2ml過夜培養的菌液，10000x g離心1分鐘，去上清。如菌液量大，可分多次離心收集。

2)、加入250μl無色溶液RB(含RnaseA)，震蕩懸浮細菌沉淀，不應留有小的菌塊。

3)、加入250μl藍色溶液LB，溫和地上下翻轉混合4-6次，使菌體充分裂解，形成藍色透亮的溶液，顏色由半透亮變為透亮藍色，指示完全裂解(不宜超過5分鐘)。

4)、加入350μl黃色溶液NB，輕輕混合5-6次(顏色由藍色完全變成黃色，指示混合均勻，中和完全)，直至形成緊實的黃色凝集塊，室溫靜置2分鐘。

5)、12000x g離心5分鐘，小心吸取上清加入離心柱中。12000x g離心1分鐘，棄流出液。如上清體積大于800μl，可以分成多次加入柱中，并同上離心，棄流出液。

6)、加入650μl溶液WB，12000x g離心1分鐘，棄流出液。

7)、12000x g離心2分鐘，徹底去除殘留的WB。

8)、將離心柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入30-50μl EB或去離子水(PH>7.0)室溫靜置1分鐘。

9)、10000x g離心1分鐘，洗脫出的DNA于﹣20℃保存

2.4、酶切驗證：選用限制性內切酶5’：BamHⅠ3'：KpnⅠ對所提取的質粒進行驗證，

雙酶切反應體系

28℃恒溫培養箱，溫浴30分鐘。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，分析結果，選擇條帶正確的農桿菌保存甘油菌(40％藍蓋)，用于轉化植物。

3、花絮侵染法來獲取轉基因植株

3.1挑取已正確保菌的農桿菌進行活化(活化目的是確保菌的活力)，將活化好的菌加入到含有抗生素(Rif 50mg/ml和Kan 50mg/ml)的5ml LB培養液中，28℃搖床過夜培養，將搖好的菌液放入到離心機內，5000x g，10min，棄去上清液，加入1ml的侵染液(5％蔗糖，0.02％silwet77懸浮液溶于水)，用膠頭滴管輕輕吹吸使菌懸浮。

3.2、選用三盒長勢良好且已開花的野生型Col-0植株，剪去植株上的已結豆莢和已完成授粉的花苞，用膠頭滴管吸取菌液滴在未開花的花苞上，并貼標 簽標注，每隔2—3天侵染一次，直至所有植株都開花(注：每次侵染前一天給植物澆水)。

3.3、當植株成熟后及時收取T1代種子，待種子干燥一周左右將其撒播在含有抗生素(草銨膦120mM)的抗性固體MQA CK培養皿上，先放置到4℃冰箱春化三天，再光照培養一周左右，進行陽性苗T1代的篩選。

3.4、選取抗性培養皿上長勢良好的T1代植株，移土培養并單株標號，待其成熟后及時單株收取T2代種子，干燥一周后，繼續將其單管撒在抗性培養基上，光照培養數天后，選取符合活死比為3:1的T2代植株移土培養，種子成熟后及時單株收取T3代種子，干燥一周后，將T3代種子撒在含有草銨膦抗性的MQA CK培養基上，選取全活的純合植株進行表型分析

4、表型分析

4.1本實例中用到的MQA培養基成分主要有

大量元素：1M KNO₃、1M MgSO₄、1M H₃PO₄、1M CaCl₂

微量元素：MS微量(0.5x)、

Fe²⁺鹽：MS Fe²⁺鹽(0.5x)

Mn²⁺鹽：MS Mn²⁺鹽(0.5x)以及0.5M MES緩沖液

碳源：1％蔗糖

4.1具體的培養基方案如表1(100ml)

注：0μM PO₄^3-、0μM Ca²⁺、0μM NO^3-、這幾個梯度加入1.0％的瓊脂糖1g

1mM Ca²⁺、1μM ABA、100mM NaCl、pH 7這幾個梯度加入1.2％的瓊脂1.2g

另ABA是在培養基滅完菌之后溫度降至手溫時再加0.5μl。

4.2.種植方式

點播種子的過程是在無菌條件下進行的，點播種子之前先要用75％酒精對種子進行消毒(洗種子時間不宜超過30分鐘)，然后，再將種子在無菌條件下換用100％酒精沖洗一下，并將其連酒精一起晾干在無菌的濾紙上，待種子 完全晾干后，用消過毒的鑷子將種子點播在培養基上。

每種梯度一個重復，待種完后用封口膜封口，先在4℃冰箱春化三天，再放置溫度為22℃，濕度為40％RH的培養室豎直光照培養十四天之后觀察轉基因型與野生型Col-0的表型，并對其進行根長和鮮重的數據采集，結果如圖2和3所示。

圖2和圖3的結果顯示，使用相同的培養條件培養后，在正常培養基、養分貧瘠、高鹽堿和含有1μM干旱激素ABA的培養基上，轉基因擬南芥的根長均顯著高于正常擬南芥植物，轉基因擬南芥的鮮重均顯著高于正常擬南芥植物。說明所述CML22基因、其編碼的氨基酸序列和包含有CML22基因序列的表達載體能夠應用于培育抗養分貧瘠和高鹽堿植物中。

以上所述，僅為本發明的具體實施方式，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，可輕易想到變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。

SEQUENCE LISTING

<110> 內蒙古和盛生態科技研究院有限公司

<120> 一種促進植物吸收養分的基因、其編碼的氨基酸序列和表達載體以及應用

<130> 2010

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 690

<212> DNA

<213> 樟子松（Pinus sylvestris var. mongolica Litv.）

<400> 1

atggcagcag gggagggaat tgtgagcttc ctggaagaca acagcagcat ggtcagcgtg 60

tttctaagag ctgtgctgtt ttacggactg cttacctcgc ttctgcgcta tttctttccg 120

aaaagattta agggtttctt cggcggaaaa gccatggaag ttgcggctga aagcggcaag 180

ggtttgatga aggagaaaag cggctgtggt gctaatatag cggtcggaag aggcgaattg 240

cagagggttt tctcgacctt tgataaaaat ggcgacggcc tgataagcca gcaggaaatg 300

gctgagtcgc ttgagaagct agggctaaag atcggagaag aggaggtctc gtccgccatt 360

aaaaaggtag atgcaaatgg cgacggaaat gtggattttg aggagtttgt gatattttat 420

gaggatatta gtaaggttgg aggaggggct gctaatttgg aggaagatcc agaattggca 480

gacgcttttg ctgtttttga tggaaatggc gacggtttga taactgctga agagttgcag 540

tccgttatgt gttcgctagg gttgaaggaa ggacggacgg ccggagattg tcgaaatatg 600

atccgccagg ttgataagga cggcgatgga atggtgaact acgcagagtt taaagagatg 660

atgaagagtg cttttgccaa gaagatatga 690

<210> 2

<211> 228

<212> PRT

<213> 未知

<400> 2

Met Ala Ala Gly Glu Gly Ile Val Ser Phe Leu Glu Asp Asn Ser Ser

1 5 10 15

Met Val Ser Val Phe Leu Arg Ala Val Leu Phe Tyr Gly Leu Leu Thr

20 25 30

Ser Leu Leu Arg Tyr Phe Phe Pro Lys Arg Phe Lys Gly Phe Phe Gly

35 40 45

Gly Lys Ala Met Glu Val Ala Ala Glu Ser Gly Lys Gly Leu Met Lys

50 55 60

Glu Lys Ser Gly Cys Gly Ala Asn Ile Ala Val Gly Arg Gly Glu Leu

65 70 75 80

Gln Arg Val Phe Ser Thr Phe Asp Lys Asn Gly Asp Gly Leu Ile Ser

85 90 95

Gln Gln Glu Met Ala Glu Ser Leu Glu Lys Leu Gly Leu Lys Ile Gly

100 105 110

Glu Glu Glu Val Ser Ser Ala Ile Lys Lys Val Asp Ala Asn Gly Asp

115 120 125

Gly Asn Val Asp Phe Glu Glu Phe Val Ile Phe Tyr Glu Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Val Gly Gly Gly Ala Ala Asn Leu Glu Glu Asp Pro Glu Leu Ala

145 150 155 160

Asp Ala Phe Ala Val Phe Asp Gly Asn Gly Asp Gly Leu Ile Thr Ala

165 170 175

Glu Glu Leu Gln Ser Val Met Cys Ser Leu Gly Leu Lys Glu Gly Arg

180 185 190

Thr Ala Gly Asp Cys Arg Asn Met Ile Arg Gln Val Asp Lys Asp Gly

195 200 205

Asp Gly Met Val Asn Tyr Ala Glu Phe Lys Glu Met Met Lys Ser Ala

210 215 220

Phe Ala Lys Lys

225