本發明涉及一株土壤放線菌lf-1及其應用，屬于農業植物保護技術領域，具體地說，本發明所述的土壤放線菌lf-1是一種人工分離的放線菌，為淺天青色鏈霉菌（streptomycescoelescens）lf-1，該微生物對多種蚜蟲，特別是煙葉蚜蟲，油菜蚜蟲，薔薇蚜蟲等有明顯的防治作用。

背景技術：

蚜蟲是糧食和經濟作物的主要害蟲，種類繁多，中國大概有1100種。其繁殖能力極強，每年可繁殖20-30代，且每代繁殖數量驚人，每年都對我國的糧食和經濟作物造成了嚴重的危害。

目前蚜蟲的防治主要采用化學防治，如吡蟲啉、殺滅菊酯、抗蚜威等。由于化學殺蟲劑使用操作方便并且能迅速有效地控制害蟲種群數量，因而在目前乃至今后相當長的時期內，化學農藥仍然是控制媒介昆蟲及農業害蟲的有利武器。但大量使用化學農藥既破壞生態平衡，又會造成農產品中的農藥高殘留，對人畜和環境也會造成二次危害，不僅損害了人和動物的健康，而且引起土壤微生物種群多樣性和豐度減少，土壤肥力下降，另一方面引發病原菌及害蟲產生耐藥性，使防治工作難度和成本加大。現在已經出現了長期使用化學藥劑的不良后果，蚜蟲已經產生了明現的抗藥性，并帶來嚴重的“3r”問題。

大量的研究已經表明生物防治是一種有效防治害蟲的環保措施，其中微生物防治害蟲作為一種對環境友好、無殘留的生物防治方法，得到越來越多的研究和應用。目前實際生產中應用微生物菌劑防治蚜蟲不多，主要是蟲生真菌發酵產物及其活性物質，如利用一些蟲生真菌白僵菌、綠僵菌、擬青霉等防治害蟲，微生物防治害蟲最成功的應該是利用蘇云菌桿菌防治棉鈴蟲了，在全世界大概是推廣應用最好的微生物菌劑。

放線菌在自然界中分布廣泛,是一類具有巨大實用價值的微生物種群，有望成為新型生物農藥的主要來源之一。目前放線菌活性產物研究較多，利用菌劑防治蟲害研究較少，羅蘭等人初步研究了2株放線菌防治蘿卜蚜，效果較好。在煙草煙蚜蟲防治上的應用放線菌劑更少見報道，僅見廖文程等人利用菌株發酵的活性產物防治煙葉蚜蟲。鮮見利用放線菌株的菌劑防治煙葉蚜的報道，未見利用淺天青色鏈霉菌菌株制備菌劑防治蚜蟲。

隨著國家大力倡導“無公害”綠色農業理念，迫切需要使用更多的對人及自然生態無危害的生物防治方法來減少化學農藥的使用量。本發明的淺天青色鏈霉菌（streptomycescoelescens）lf-1防治蚜蟲，具有高效安全，防效時間長等優點，菌劑應用于生產將更具有應用前景。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，針對目前蚜蟲對農藥產生抗藥性以及使用農藥對環境的二次污染，提供一株適用于防治蚜蟲的土壤放線菌新菌株lf-1，利用該菌株能夠防治蚜蟲，提高農作物的產量和經濟效益，并減少農藥對人畜和環境的二次污染危害。

本發明的放線菌菌株分類命名為淺天青色鏈霉菌（streptomycescoelescens）

lf-1，已在保藏單位保藏，保藏單位名稱：中國典型培養物保藏中心，簡稱cctcc，保藏單位地址：中國武漢武漢大學，保藏日期為2014年10月20日，保藏編號為cctccno：m2014500。

本發明所述淺天青色放線菌（streptomycescoelescens）lf-1應用于多種蚜蟲防治，特別是在防治煙葉蚜蟲、油菜蚜蟲及薔薇蚜蟲等多種蚜蟲效果顯著。

本發明所述菌株lf-1經pcr技術，dna測序儀分析，該菌株的16srdna基因序列由1434個堿基組成。本發明的菌株lf-1，用常規方法分離自云南楚雄煙田土壤，經形態、生理生化特征鑒定及16srdna基因序列分析，鑒定為淺天青色放線菌（streptomycescoelescens）lf-1。

本發明的優點在于菌株lf-1產基淀粉酶，纖維素酶，蛋白酶，脂肪酶及幾丁質酶，具有實際應用防治蚜蟲效果好，持效時間較長，而且對人畜安全和環境友好的特點。

附圖說明

圖1為本發明所述的淺天青色放線菌lf-1在固體培養基上培養特征（正面）。

圖2為本發明所述的淺天青色放線菌lf-1菌絲體特征（光學顯微鏡40倍）。

圖3為本發明所述的淺天青色放線菌lf-1菌株的系統發育進化樹。

圖3中，分支節點上的數字表示經過1000次bootstrap分析所支持的結果。線段標尺0.001表示0.1%的序列差異的分支長度。

具體實施方式

以下所述實施例僅用于舉例說明本發明的方法，并不限制本發明的范圍。

1.分離培養基：

改良高氏ⅰ號培養基：

硝酸鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.05%，硫酸鎂0.05%，nacl0.05%，硫酸亞鐵0.001%，可溶性淀粉2.0%，瓊脂1.5%，重鉻酸鉀0.025%，苜蓿根土壤浸提液150ml，蒸餾水850ml，ph7.0-7.5，121℃下滅菌30min。

2.檢測鑒定培養基：

1）淀粉酶檢測：酵母粉0.15%，可溶性淀粉1.5%，硝酸鈉0.15%,磷酸氫二鉀0.1%，mgso4·7h2o0.05%,feso4.7h2o(0.001%),氯化鉀0.05%,瓊脂1.4%，加水定容至1000ml，ph自然。

2）脂肪酶檢測：油脂中性紅培養基，氯化鈉0.5%，蛋白胨1.0%，橄欖油10ml，牛肉膏0.5%，瓊脂1.4%，中性紅1.6%中性紅水溶液1ml，加水定容至1000ml。

3）蛋白酶檢測：

蛋白胨0.5%，酵母粉0.25%，可溶性淀粉1%，磷酸二氫鉀0.03%，mgso4·7h2o0.05%，牛奶100ml，氯化鈉0.1%，瓊脂1.4%，加水至1000ml。

4）幾丁質酶檢測：

硝酸鈉0.15%，mgso4·7h2o0.05%，磷酸二氫鉀0.03%，feso4·7h2o0.015%，10g/l膠態幾丁質200ml，瓊脂1.4%，加水定容至1000ml，ph自然。

5）纖維素酶檢測：氯化鈉0.6%,mgso4.7h2o0.01%，磷酸二氫鉀0.05%,氯化鈣0.01%,磷酸氫二鉀0.2%，cmc-na1.5%，硫酸銨0.2%,酵母粉0.1%，瓊脂1.4%，加水定容至1000ml，ph自然。

3.液體培養基：

硝酸鉀0.1%，磷酸氫二鉀0.05%，硫酸鎂0.05%，氯化鈉0.05%，硫酸亞鐵0.001%，可溶性淀粉2.0%，重鉻酸鉀0.025%，蒸餾水1000ml，ph7.0-7.5，121℃下滅菌30min。

實例1:

1.菌株分離

本發明菌株的獲得方法為常規方法，具體如下：將采自楚雄煙田的土壤樣品風干，稱取新土樣10g放入100℃烘箱處理15min，取出再放在裝有90rnl無菌水250ml三角瓶中，加入小玻璃珠充分振30min，吸取1ml懸浮液，按10倍梯度稀釋法，制成稀釋液備用。取50ul~100ul涂布在裝有改良高氏1號培養基平皿上，將培養皿倒置于28℃恒溫箱中培養5～7d，及時記錄其菌落形態和培養特性，同時轉接純化后編號保存備用。

2.鑒定

2.1形態鑒定

培養基菌落形態觀察：lf-1菌株劃線培養于改良高氏一號培養基上菌落形態，菌落凸起，干燥，邊緣花環狀，不光滑，菌落先變紅后變灰白，培養基逐漸變藍，培養基變藍所需時間較短，培養2-3天可看到培養基呈深藍色(見圖1)。

菌株lf-1氣生菌絲分支較少，產孢菌絲具有分支，單枝孢子絲為螺旋狀，孢子絲較短，該菌株產孢菌絲形態（見圖2）。

2.2分子生物學特征

lf-1菌株的16srdna基因序列的pcr擴增到的片段大小約1500bp，送上海生工測序后在genbank中進行blast分析，lf-1菌株與streptomycescoelescensaf503496相似性為100%。以同源性比較高(>97％)的鏈霉菌16srdna序列作為參比對象，構建系統進化樹。使用clustalx2.0軟件進行多序列比對，然后采用鄰位相接法(neighbour-joining)利用mega5．1(beta)繪制系統進化樹，自展數(bootstrap)為1000。結果菌株lf-1與streptomycescoelescensaf503496都聚在一個分枝上（見圖3）。

2.3菌株發酵液的制備

lf-1菌株先接種在改良高氏一號平皿培養基上活化培養3～5d，再分別接種在裝有50ml液體培養液的250ml錐形瓶中，每瓶接種2～3環。28℃，120r/min發酵3d。以15%接種量擴大發酵，培養5d后單層紗布過濾得到菌液發酵液，4℃保存備用。

3.酶活檢測：

先將菌株lf-1從斜面上接種在改良高氏一號培養基上，活化培養3d天，再將活化好的菌體分別點植在酶活檢測培養基淀粉酶，纖維素酶，蛋白酶，脂肪酶及幾丁質酶培養基上，每種酶重復3次，倒置培養7天，觀察測定其酶比活。

表1lf-1菌株5種酶活性檢測

結果表明（表1），菌株lf-1具有產淀粉酶，纖維素酶，蛋白酶，脂肪酶及幾丁質酶的活性，水解圈最大的是淀粉酶，淀粉酶水解圈直徑22mm，酶比活3.1；其次是纖維素酶，水解圈直徑為12mm，酶比活為4.0；幾丁質酶水解圈直徑11mm，酶比活為2.2。蛋白酶和脂肪酶的酶活較弱。菌株lf-1具有這5種酶活，進一步說明菌株lf-1具有產殺蚜蟲或者抑制蚜蟲的活性物的潛力。

實例2：

發酵液對溫室煙葉蚜蟲防治：

選擇溫室內長勢良好且長相一致的烤煙，按隨機區組設計，每個處理5株，3次重復，在每株烤煙植株上接種約200頭左右蚜蟲，記錄成活蚜蟲數。菌株發酵液分別稀釋10倍，吡蟲啉處理為10%吡蟲啉wp，稀釋1000倍（青島產），以清水為對照ck1，分別噴施煙株，重復三次。在噴施后的第1天﹑第3天﹑第5天﹑第7天及第10天統計蚜蟲數量，計算蚜蟲減退率和防效。

計算公式如下：

蟲口減退率（%）=（防治前的活蟲數-防治后的活蟲數）／防治前的活蟲數×100

防治效果（%）=[1-(處理區防治后的活蟲數×對照區防治前的活蟲數)／(處理區防治前的活蟲數×對照區防治后的活蟲數)]×100

表2.不同處理的蟲口減退率及防效分析

。

溫室進行的菌劑防治煙葉蚜蟲研究（表2），結果表明處理后第1天噴施吡蟲啉后的蟲口減退率和防效分別為89.1%和69.2%，噴施菌劑lf-1蟲口減退率和防效分別為52.1%和69.2%，噴施清水的對照減退率和防效分別為-11.6%和28.3%，菌劑處理的效果較吡蟲啉處理的效果低，但效果明顯比清水對照好；處理后第5天吡蟲啉蟲口減退率和防效分別為95.1%和98.2%，噴施菌劑lf-1蟲口減退率和防效分別為59.4%和86.9%，噴施清水的對照減退率和防效分別為-104.1%和34.4%。吡蟲啉處理的效果好于菌劑處理的效果，菌劑防效比第3天增長明顯，并明顯好于清水對照。噴施后第7天，噴施菌劑和噴施吡蟲啉蚜蟲防效分別是92%和95.1%，兩者防治效果幾乎沒有差異，防效都明顯好于對照清水；到第10天兩者的防效沒有差異。表明前5天噴施菌劑lf-1的防效沒有噴施吡蟲啉效果好，但每天的防效都逐步提高，到第7天后兩者防效幾乎沒有差異。也說明菌劑lf-1防治蚜蟲較化學農藥起作用進程慢一些，但防治蚜蟲效果和化學農藥吡蟲啉幾乎一樣。

實例3：

菌株發酵液對大田煙葉蚜蟲防治：

選取大田長勢一致的煙株，將事先培養好的蚜蟲（若蟲）按200頭/株放在煙株上，用細沙網罩將煙株罩好。菌株發酵液分別稀釋5倍，以清水為對照，分別噴施煙株，每個處理5株，3次重復，做好隔離，在噴施后的第1天﹑第3天﹑第5天﹑第7天﹑第10天統計蚜蟲數量，計算蚜蟲死亡率并進行統計分析。

表3.不同處理的防效顯著性分析（顯著性水平a=0.05）

菌劑lf-1在防治大田煙葉蚜蟲的效果較好（見表3），從噴施菌劑后第1天到第10天，5次的觀察記錄進行顯著性分析，結果表明從噴施菌劑后的第1天，噴施菌劑lf-1防治蚜蟲的效果都顯著高于噴灑水（對照）的處理效果。

實例4：

菌株發酵液對煙葉蚜蟲，薔薇蚜蟲，油菜蚜蟲的防治：

菌株發酵液分別稀釋5倍，以清水為對照。先在溫室培養3種蚜蟲（煙葉蚜蟲，薔薇蚜蟲，油菜蚜蟲），選取長勢一致的煙苗，薔薇嫩枝，以及油菜嫩枝，做好隔離，噴灑發酵菌劑。分別選取蟲齡一致的蚜蟲100頭/枝放入到煙苗，薔薇和油菜上，以清水為對照，重復3次。第2天即處理后第1天開始觀察統計蚜蟲情況。

計算公式:

死亡率(%)=蚜蟲死亡數/蚜蟲總頭數

校正死亡率(%)=（蚜蟲總死亡數-對照死亡數）/（1-對照死亡率）

表3.3種蚜蟲死亡數量分析

。

噴灑菌劑后第1天蚜蟲開始死亡，第2天煙苗、薔薇及油菜上蚜蟲的校正死亡率分別為30.1%，31.3%及45.7%。第4天的時候蚜蟲死亡較多，有的開始變成黑色，3種蚜蟲的校正死亡率分別為53.4%，79.2%及78.5%。到第7天的時候大部分死亡，蚜蟲的校正死亡率分別為64.4%，91.9%及83.6%，噴施菌劑的3種蚜蟲死亡率處理均顯著高于對照ck（見表3）。

研究證明，本發明的淺天青色放線菌菌株lf-1產淀粉酶，纖維素酶，蛋白酶，脂肪酶及幾丁質酶，對多種蚜蟲防治效果明顯，生防效果較好，可應用于防治多種作物蚜蟲危害，有利于人畜安全和保護環境，是重要的防治蚜蟲的潛在應用微生物菌株。

淺天青色鏈霉菌（streptomycescoelescens）lf-1核苷酸堿基序列：

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<110>云南大學

<120>一株土壤放線菌及其防治蚜蟲應用

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