本發(fā)明涉及一種基因的克隆與功能鑒定，尤其涉及美洲大蠊wingless基因全長克隆與功能鑒定及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

美洲大蠊是中國南方地區(qū)最常見的蜚蠊，能進(jìn)入室內(nèi)危害，是優(yōu)勢衛(wèi)生害蟲之一。它們能在室內(nèi)的任何地方被發(fā)現(xiàn)，如臟的床墊、床單表明，軟墊的家具，地毯，它們在廚房里活動(dòng)頻繁^[1]。目前，化學(xué)防治仍是蟑螂防治的一項(xiàng)重要手段。隨著化學(xué)殺蟲劑的大量使用，蟑螂迅速產(chǎn)生了抗藥性，并且越來越嚴(yán)重^[2]。同時(shí)由于化學(xué)殺蟲劑的使用，會(huì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的嚴(yán)重的影響和破壞作用。因此，利用分子生物信息技術(shù)來防制蟑螂具有非常廣闊的應(yīng)用前景^[3]。目前，已有多種昆蟲基因被報(bào)道對殺蟲劑的效果起到一定的調(diào)控作用，如重組的HaSNPV幾丁質(zhì)酶有望作為Bt殺蟲劑的增效劑^[4]，昆蟲的鈉離子通道基因?qū)⑾x劑抗性具有一定的影響機(jī)制^[5]，中華按蚊CYP6基因家族中的多個(gè)基因均對殺蟲劑的抗藥性起到一定的調(diào)控作用^[6]等。

Wnt基因在1982年被Nusse和他的團(tuán)隊(duì)^[7]首次報(bào)道，當(dāng)時(shí)被命名為int-1基因，這個(gè)基因的非正常激活會(huì)誘發(fā)癌癥。隨后在果蠅中發(fā)現(xiàn)了與int-1同源的基因wingless基因(wg)，它們被共同定義為“wnt”基因^[8]。Wnt基因家族的成員在多個(gè)物種中被檢測出來，從無脊椎的線蟲至脊椎動(dòng)物，在人中共發(fā)現(xiàn)了19個(gè)wnt家族的基因^[9]，在果蠅中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)wnt家族的基因，蜂中發(fā)現(xiàn)了7個(gè)wnt家族的基因，蚊中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)wnt家族的基因，在赤擬谷盜中發(fā)現(xiàn)了9個(gè)wnt家族的基因^[10][11]。Wnt家族的基因編碼一個(gè)大的分泌半胱氨酸-富集蛋白家族，在動(dòng)物發(fā)育中作為細(xì)胞間信號分子發(fā)揮重要的作用。許多wnt蛋白由350至380個(gè)氨基酸組成，有100多個(gè)保守的殘基分散在整個(gè)序列中。這些蛋白的起始處是一條疏水信號的序列，接著是一段可以被識別到的信號肽。每個(gè)蛋白都有一至多個(gè)N-糖基化位點(diǎn)以及多達(dá)24個(gè)半胱氨酸殘基形成二硫鍵^[12]。通過自分泌或旁分泌途徑，wnt配體結(jié)合至各種跨膜受體上，驅(qū)動(dòng)wnt信號傳導(dǎo)途徑，從而觸發(fā)靶標(biāo)基因在細(xì)胞間的調(diào)控轉(zhuǎn)錄。

Wnt信號通路通過wnt蛋白激活，涉及成年動(dòng)物發(fā)育過程中的胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化等。這一個(gè)過程需要“從頭至尾”的調(diào)控，來確定神經(jīng)嵴的正確分化，從而形成腦、心臟、腎臟以及性別分化等^[13]。這個(gè)精確系統(tǒng)的破壞會(huì)導(dǎo)致發(fā)育障礙。果蠅和赤擬谷盜中的wnt家族基因都被報(bào)道出來了^[14]，這些在胚胎發(fā)育過程中的wnt基因現(xiàn)在也已有報(bào)道了^[15]，尤其是典型的wingless/wnt1基因的極性功能已多被報(bào)道^[13]。然而，我們目前對wingless基因在美洲大蠊胚胎發(fā)育時(shí)期及后胚胎發(fā)育時(shí)期的作用功能知之甚少。我們想要了解wingless基因在美洲大蠊從幼蟲發(fā)育至成蟲期間的功能。既然有多個(gè)研究結(jié)果證實(shí)wingless基因涉及昆蟲的胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化等過程，那么wingless基因的這些功能能否應(yīng)用在殺蟲劑的制備中，制備出具有阻礙昆蟲繁殖等功能的殺蟲劑值得我們探索和研究。無論是尋找新基因，還是研究已知基因，或是開展基因功能的研究，又或者是使特定基因表達(dá)以期得到基因編碼的蛋白質(zhì)等方面的研究，獲得目的基因的全長cDNA是前提條件和首要目標(biāo)。

此外，在分子生物學(xué)研究中基因探針是必不可少的重要的工具。由于在系統(tǒng)進(jìn)化上人和哺乳類遺傳距離較近，其基因探針具有較大的通用性，所以醫(yī)學(xué)發(fā)展起來的人基因探針為哺乳動(dòng)物研究帶來了許多方便。而無脊椎動(dòng)物的分子生物學(xué)研究一向十分薄弱，因此可用于昆蟲的基因探針來源困難，基因探針的選擇和使用對昆蟲分子生物學(xué)研究至為關(guān)鍵^[16]。

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供美洲大蠊wingless基因全長cDNA、其編碼蛋白、所述美洲大蠊wingless基因全長cDNA的克隆方法及應(yīng)用；

本發(fā)明的目的還在于提供一種美洲大蠊wingless基因的原位雜交探針。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：

本發(fā)明提供了美洲大蠊wingless基因全長cDNA，命名為PaWg，該基因序列已遞交GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KJ680328；所述的cDNA全長序列共1,456bp，其開放閱讀框(ORF)包含1,194個(gè)堿基，編碼397個(gè)氨基酸，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。該基因序列編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。該蛋白的理論等電點(diǎn)PI為9.46，分子量為4.4kD，是個(gè)穩(wěn)定的親水性蛋白。該蛋白的第1-21位氨基酸序列是一段信號肽，位點(diǎn)21與22之間存在一個(gè)酶切位點(diǎn)。同時(shí)該蛋白可能包含2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別在107和343位點(diǎn)的天冬酰胺上。

本發(fā)明提供了上述美洲大蠊wingless基因全長cDNA的克隆方法，包括如下步驟：

1)對從美洲大蠊樣本中提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA；

2)以步驟1)中獲得的cDNA為模板，簡并引物F1(如SEQ ID NO.3所示)和R1(如SEQ ID NO.4所示)為上游引物和下游引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增；

優(yōu)選地，其PCR反應(yīng)條件如下：94℃3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35cycles；72℃10min；4℃∞保存；

3)在對步驟2)中擴(kuò)增所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化，以及鑒定和測序；

4)將步驟1)中所獲得的RNA作為模板，構(gòu)建RACE cDNA文庫；獲得的產(chǎn)物為5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA，可分別作為5'-RACE和3'-RACE反應(yīng)的模板；

5)根據(jù)步驟3)中所獲得的基因序列設(shè)計(jì)3'RACE和5'RACE引物，分別以步驟4)中所獲得的5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA為模板，并使用UPM引物，其核苷酸序列為：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，進(jìn)行5'-RACE或3'-RACE巢式PCR擴(kuò)增美洲大蠊wingless基因的全長序列；

所述的3'-RACE和5'-RACE引物的核苷酸序列分別為：

3’RACE-F1：(如SEQ ID NO.5所示)；

3’RACE-F2：(如SEQ ID NO.6所示)；

5’RACE-R1：(如SEQ ID NO.7所示)；

5’RACE-R2：(如SEQ ID NO.8所示)。

優(yōu)選地，第一輪PCR反應(yīng)條件為：94℃30s，72℃3min，5個(gè)循環(huán)；94℃30s，68℃30s，72℃3min，5個(gè)循環(huán)；94℃30s，65℃30s，72℃3min，15個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存；優(yōu)選地，第二輪PCR反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃2min，20個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

6)回收、連接和轉(zhuǎn)化步驟5)中擴(kuò)增所得的第一次巢式PCR的5’RACE和3’RACE的PCR產(chǎn)物；

7)將步驟3)中獲得的wingless基因序列與步驟6)中獲得的5’RACE基因序列進(jìn)行拼接，根據(jù)拼接好的基因序列設(shè)計(jì)第二次巢式PCR的5'RACE引物，并以步驟4)中所獲得的5'-RACE-Ready cDNA為模板，第二次巢式PCR擴(kuò)增美洲大蠊wingless基因的全長序列；所述的第二次巢式PCR的5'-RACE引物的核苷酸序列分別為：

5’RACE-R3：(如SEQ ID NO.9所示)；

5’RACE-R4：(如SEQ ID NO.10所示)。

第二次巢式PCR反應(yīng)的第一輪PCR和第二輪PCR反應(yīng)條件如上。

8)在對步驟7)中擴(kuò)增所得的第二次巢式PCR的5’RACE的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化，以及鑒定和測序；

9)將步驟3)中獲得的wingless基因序列、步驟6)中獲得的5’RACE和3’RACE基因序列與步驟8)中獲得的5’RACE基因序列進(jìn)行拼接，得到wingless基因全長序列，經(jīng)BLAST比對驗(yàn)證其為美洲大蠊wingless(PaWg)基因全長cDNA序列。此序列已遞交進(jìn)入GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KJ680328。

我們利用基因體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)制備出了美洲大蠊wingless基因的原位雜交探針，首先以美洲大蠊雄性成蟲胸部組織cDNA樣品為模板，制備含T7啟動(dòng)子的DNA模板；隨后以含T7啟動(dòng)子的DNA為模板，使用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Riboprobe in vitro Transcription Systems，Promega)制備wingless基因原位雜交的探針，同時(shí)，使用地高辛標(biāo)記的UTP對NTP進(jìn)行修飾；最后將標(biāo)記探針應(yīng)用在美洲大蠊胚胎的RNA干擾中，從而確認(rèn)wingless基因在美洲大蠊胚胎發(fā)育過程中的功能作用。

本發(fā)明提供了該基因、蛋白以及其克隆方法在制備蟑螂殺蟲劑以及生物探針方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案達(dá)到了如下的有益效果：

1)本發(fā)明獲得了美洲大蠊wingless基因全長cDNA序列，并得出該基因及其編碼蛋白質(zhì)的功能，為美洲大蠊wingless基因相關(guān)研究與應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2)本發(fā)明使用SMART技術(shù)，構(gòu)建美洲大蠊性腺組織和胸部組織的SMART RACE cDNA文庫，為篩選和克隆美洲大蠊生殖發(fā)育相關(guān)基因及翅發(fā)育相關(guān)基因的全長cDNA奠定了基礎(chǔ)。

3)我們利用基因體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)制備出了美洲大蠊wingless基因的原位雜交探針，通過這個(gè)技術(shù)的廣泛推廣應(yīng)用，可制備出其他多種昆蟲的wingless基因探針，從而應(yīng)用在增強(qiáng)天敵昆蟲的翅發(fā)育功能作用上，增加天敵昆蟲的飛行能力，增強(qiáng)其捕食害蟲的能力。

附圖說明

圖1是美洲大蠊胸部總RNA的提取。M.DL 2000Marker；1.總RNA。

圖2是wingless基因片段的擴(kuò)增。M.DL 2000Marker；1-3.PCR產(chǎn)物(平行實(shí)驗(yàn))。

圖3是wingless基因3’RACE的擴(kuò)增結(jié)果。M.DL2000Marker；1.3’RACE PCR產(chǎn)物。

圖4是wingless基因5’RACE擴(kuò)增結(jié)果。M.DL2000Marker；1.5’RACE第一次巢式PCR產(chǎn)物；2.5’RACE第二次巢式PCR產(chǎn)物。

圖5是美洲大蠊PaWg基因的核苷酸序列和氨基酸序列。圖中，推導(dǎo)的加尾信號用方框表示；星號指示終止密碼子；信號肽序列用單下劃線表示；預(yù)測的N-糖基化位點(diǎn)用雙下劃線表示。

圖6是PaWg蛋白理化性質(zhì)。

圖7是PaWg蛋白疏水性分析結(jié)果。

圖8是使用TMHMM工具對PaWg蛋白的跨膜區(qū)分析結(jié)果。

圖9是PaWg蛋白信號肽分析。

圖10是PaWg蛋白的N-糖基化位點(diǎn)分析。

圖11是PaWg蛋白的O-糖基化位點(diǎn)分析。

圖12是PaWg蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果。

圖13是含T7啟動(dòng)子的DNA模板。M.DL2000Marker，1.Wg(T7)-F2和Wg-R2為上、下游引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物，2.Wg-F1和Wg(T7)-R1為上、下游引物擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物。

圖14是wingless基因的dsRNA。M.DL2000Marker，1.dsRNA。

圖15是RT-PCR分析wingless基因的表達(dá)。(A)wingless基因在4個(gè)生長發(fā)育時(shí)期的mRNA水平：1.卵，2.早期幼蟲，3.晚期幼蟲，4.成蟲；(B)RNAi敲除wingless基因：Congtrol.未進(jìn)行注射的野生型，GFP.使用GFP的dsRNA進(jìn)行注射，RNAi.使用wingless的dsRNA進(jìn)行注射。

圖16是RANi干擾前后美洲大蠊前后翅表型的改變。圖中，S1.野生型美洲大蠊幼蟲發(fā)育而成的翅，S2.六齡期幼蟲受干擾后發(fā)育成的前翅，S3.六齡期幼蟲受干擾后發(fā)育成的后翅，S4.七齡期幼蟲受干擾后發(fā)育成的前翅，S5.七齡期幼蟲受干擾后發(fā)育成的后翅，S6.八齡期幼蟲受干擾后發(fā)育成的前翅，S7.八齡期幼蟲受干擾后發(fā)育成的后翅，S8.九齡期幼蟲受干擾后發(fā)育成的前翅，S9.九齡期幼蟲受干擾后發(fā)育成的后翅。

圖17是wingless基因探針。M.DL2000Marker，1.探針。

圖18是美洲大蠊胚胎原位雜交。S10.早期胚胎的頭部、胸部第一體節(jié)和第二體節(jié)的背面，S11.晚期胚胎的胸部第一體節(jié)、第二體節(jié)和第三體節(jié)的背面，S12.早期胚胎，S13.晚期胚胎中的觸角，S14.晚期胚胎中的下唇須，S15.晚期胚胎中的中足和后足，S16.晚期胚胎中的中足腿，S17.晚期胚胎中的后足。

具體實(shí)施方式

為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步的介紹。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例1中，對美洲大蠊的wingless基因全長進(jìn)行了克隆。其具體步驟如下：

1.1提取組織樣品的總RNA：

提取美洲大蠊卵莢、早期幼蟲、晚期幼蟲和雄性成蟲胸部組織樣品的總RNA，其總RNA的提取按照RNeasy Mini Kit(Qiagen公司)說明書于生物安全柜上操作；然后，將提取的總RNA溶于無RNA酶的水中，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性和核酸與蛋白質(zhì)定量檢測儀測定純度與濃度后，保存于-70℃冰箱備用。

其電泳檢測結(jié)果如圖1所示：從電泳圖片中可以看出，兩條明顯的條帶分別為28s，18s，說明提取的RNA完整，無降解，可以用于RT-PCR的擴(kuò)增。

1.2制備組織樣品cDNA：

取步驟1.1中所獲得的美洲大蠊卵莢、早期幼蟲、晚期幼蟲和雄性成蟲胸部組織樣品的總RNA樣品，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Super SMART^TM PCR cDNA Synthesis Kit，按試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。cDNA樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性和核酸與蛋白質(zhì)定量檢測儀測定純度后，保存于-20℃冰箱備用。

1.3美洲大蠊wingless基因編碼區(qū)部分片段的克?。?/p>

1.3.1設(shè)計(jì)采用PCR方法擴(kuò)增美洲大蠊wingless基因片段的引物：

從NCBI上下載多條與美洲大蠊較為近緣的物種的wingless基因序列，經(jīng)過序列比對之后，選取wingless基因保守區(qū)域，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)簡并引物Sense primer(F1)：5’-AAGGATCGCTTCGACGGCGCGTC-3’(SEQ ID NO.3)和Antisense primer(R1)：5’-CCGCAACACATsAGrTCrCAnCC-3’(SEQ ID NO.4)，在美洲大蠊中采用PCR方法擴(kuò)增wingless基因片段。

1.3.2 RT-PCR擴(kuò)增：

以步驟1.2中所獲得的美洲大蠊雄性成蟲胸部組織cDNA樣品為模板，簡并引物F1和R1分別為上游引物(Forward Primer)和下游引物(Reverse Primer)，按照r-Taq DNA聚合酶(TaKaRa)說明書的方法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，并根據(jù)引物調(diào)整PCR的退火溫度和循環(huán)次數(shù)如下：

配制總量為25μl的PCR反應(yīng)液，包括：1μl模板cDNA、2μl dNTP Maxture(2.5μm)、 0.5μl Forward Primer(10μm)、0.5μl Reverse Primer(10μm)、2.5μl 10×Ex Taq Buffer(Mg²⁺Free)、2μl MgCl₂(25mM)、0.2μl TaKaRa Ex Taq(5U/μl)和16.3μlddH₂O。

PCR反應(yīng)條件如下：94℃3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35cycles；72℃10min；4℃∞保存。

1.3.3目的片段(PCR產(chǎn)物)的回收與連接：

使用GenClean柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，將回收的DNA與pMDl9-T載體連接，16℃反應(yīng)過夜；5倍稀釋樣品后，進(jìn)行連接反應(yīng)。

1.3.4轉(zhuǎn)化：

取10μl連接產(chǎn)物加入到100μl大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，輕輕混勻后冰浴30min；42℃熱激45秒，冰中放置2min；隨后，加入SOC培養(yǎng)基800μl，37℃、250轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)1h；取搖床培養(yǎng)后的SOC培養(yǎng)液100μl均勻涂布于Amp⁺的LB平板上；在37℃恒溫培養(yǎng)箱中正置平板30min，然后倒置培養(yǎng)過夜；置平板于4℃中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。

1.3.5鑒定與測序：

a)挑克?。?/p>

用滅菌的10μl槍頭在超凈臺中挑取單克隆至LB Amp⁺液體培養(yǎng)基中，37℃、250轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)4-6小時(shí)。

b)菌落PCR：

取0.5μl細(xì)菌培養(yǎng)液作為PCR反應(yīng)的模板，使用通用M13-F和M13-R引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，PCR反應(yīng)液總量為15μl，包括：1.5μl 10×PCR Buffer、1.2μl Mg²⁺、1.5μl dNTP Mix、0.15μl M13-F、0.15μl M13-R、0.15μl r-Taq、0.5μl菌液和9.85μl滅菌水。其PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，30個(gè)循環(huán)；72℃8min。反應(yīng)結(jié)束后，用1％瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，隨后進(jìn)行測序，其中得到一段290bp長的序列(如圖2所示)，經(jīng)NCBI的Blast程序(Altschul,S.F.,Madden,T.L.,A.A.,Zhang,J.,Zhang,Z.,Miller,W.and Lipman,D.J.1997.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs.Nucleic Acids Res 25:3389-3402)進(jìn)行同源性比對分析后證實(shí)該片段為wingless基因序列，為我們所需要的目的片段。

1.4. RACE cDNA文庫的構(gòu)建：

將步驟1.1中所獲得的RNA作為模板，使用試劑盒SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit構(gòu)建RACE cDNA文庫，操作步驟按試劑盒的說明書進(jìn)行。獲得的產(chǎn)物為5'-RACE-Ready cDNA和3'-RACE-Ready cDNA，可分別作為5'-RACE和3'-RACE反應(yīng)的模板。

1.5. RACE法擴(kuò)增wingless基因全長：

根據(jù)步驟1.3中所獲得的290bp長的wingless基因序列設(shè)計(jì)3'RACE和5'RACE引物，擴(kuò)增美洲大蠊wingless基因的全長序列。所述的3'-RACE和5'-RACE引物的核苷酸序列如下：

3’RACE-F1：5’-GAGCCTTCCCCAGGGTTCTGCGAGC-3’；(SEQ ID NO.5)

3’RACE-F2：5’-GACTCGGTATCCAAGGCACGCACGG-3’；(SEQ ID NO.6)

5’RACE-R1：5’-CCCTGGGGAAGGCTCCAAGTAGACC-3’；(SEQ ID NO.7)

5’RACE-R2：5’-TTCTTCTTACCACCGACGCCGCTGC-3’。(SEQ ID NO.8)

用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit試劑盒(Clontech)，分別以步驟1.4中所獲得的5'-RACE-Ready cDNA或3'-RACE-Ready cDNA為模板，以基因特異性引物和UPM引物(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)進(jìn)行5'-RACE或3'-RACE巢式PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

其中，第一輪PCR反應(yīng)液體系為：5.0μl 10×Advantage 2PCR buffer、1.0μl 50×dNTP Mix(2.5mmol/L)、5.0μl 10×UPM(10μmol/L)、1.0μl 5'RACE-R1/3'RACE-F1(10μmol/L)、2.5μl RACE-Ready cDNA、1.0μl 50×Advantage 2polymerase Mix和34.5μl PCR-Grade water。其PCR反應(yīng)條件為：94℃30s，72℃3min，5個(gè)循環(huán)；94℃30s，68℃30s，72℃3min，5個(gè)循環(huán)；94℃30s，65℃30s，72℃3min，15個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

隨后，將第一輪PCR產(chǎn)物5μl加入245μl的水中稀釋，作為第二輪PCR反應(yīng)的模板。第二輪PCR反應(yīng)液體系為：5.0μl 10×Advantage 2PCR buffer、1.0μl 50×dNTP Mix(2.5mmol/L)、1.0μl 10×NUP(10μmol/L)、1.0μl 5'RACE-R2/3'RACE-F2(10μmol/L)、5.0μl RACE-Ready cDNA、1.0μl 50×Advantage 2polymerase Mix和36.0μl PCR-Grade water。其PCR反應(yīng)條件為：94℃3min；94℃30s，65℃30s，72℃2min，20個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃保存。

再次，電泳檢測PCR結(jié)果，并且對獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆、測序：

將測出的序列用DNAStar軟件的Seqman程序查找目的序列，然后將5’RACE及3’RACE獲得的序列和步驟1.3中獲得的wingless基因序列進(jìn)行拼接，由于5’RACE第一次巢式PCR的產(chǎn)物較短，因此根據(jù)該5’RACE獲得的序列，設(shè)計(jì)了5’RACE第二次巢式PCR的引物(5’RACE-R3：5’-TTCTTGACGCATCTCCGAGGAAACG-3’(SEQ ID NO.9)和5’RACE-R4：5’-GGAGAACTTGAAGCCGTAGCCGATG-3’(SEQ ID NO.10))，按上述方法，進(jìn)行第二次巢式PCR擴(kuò)增。其PCR電泳結(jié)果如圖3和圖4所示。

經(jīng)過第一次巢式PCR獲得了一條230bp長的特異條帶(見圖3)，條帶經(jīng)切膠回收、克隆測序以及同源性比對，證實(shí)該230bp的片段為wingless基因的3’端序列；

經(jīng)過第一次巢式PCR獲得了一條280bp長的特異條帶(見圖4)，條帶經(jīng)切膠回收、克隆測序以及同源性比對，證實(shí)該280bp的片段為wingless基因的5’端序列。將第一次巢式PCR獲得的5’端序列與wingless基因中間序列進(jìn)行拼接，獲得了一條450bp長的序列，根據(jù)這450bp長的序列，設(shè)計(jì)5’端第二次巢式PCR的引物(5’RACE-R3和5’RACE-R4)，經(jīng)過第二次巢式PCR得到一條800bp長的特異條帶(見圖4)，條帶經(jīng)切膠回收、克隆測序以及同源性比對，證實(shí)該800bp的片段為wingless基因的5’端序列。最后將這兩次巢式PCR獲得的序列進(jìn)行拼接，最終得到wingless基因的5’端序列為1,020bp。

最后，將5’端序列、3’端序列和步驟1.3中所獲得的wingless基因序列進(jìn)行序列拼接，得到一條長為1,456bp的wingless基因全長序列，經(jīng)BLAST比對驗(yàn)證其為美洲大蠊wingless(PaWg)基因全長cDNA序列。此序列已遞交進(jìn)入GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KJ680328。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例2中，對實(shí)施例1中所獲得的美洲大蠊wingless(PaWg)基因全長cDNA序列進(jìn)行了序列分析。

用NCBI的BLAST程序?qū)aWg基因全長cDNA序列進(jìn)行全長完整性驗(yàn)證。使用ORF Finder(www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/)對PaWg cDNA的開放閱讀框(open reading frame，ORF)進(jìn)行查找及相應(yīng)的氨基酸序列翻譯。

該基因序列全長1,456bp，預(yù)測該序列的開放閱讀框包含1,194個(gè)堿基，編碼397個(gè)氨基酸，5’UTR的長度為157bp，3’UTR的長度為105bp。翻譯的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA(位于1349-1351位)，其后有加尾信號AATAAA(圖5)。將推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行Blastx同源性比對分析后發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)得到的PaWg基因與其他物種的wingless基因在氨基酸水平分享68-76％的同源性(表1)，其中PaWg基因與致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)、地中海果實(shí)蠅(Ceratitis capitata)、歐洲熊蜂(Bombus terrestris)、佛羅里達(dá)弓背蟻(Camponotus floridanus)、黑脈金斑蝶(Danaus plexippus)、家蠶(Bombyx mori)和豌豆蚜蟲(Acyrthosiphon pisum)的wingless基因的同源性達(dá)76％。

表1 PaWg基因的BLAST同源性檢索結(jié)果：

(接上頁表1)

實(shí)施例3：

本實(shí)施例3中，分析了PaWg蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)：

3.1 PaWg蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析：

采用ProtParam工具(http://us.expasy.org/tools/protparam.html)在線工具進(jìn)行PaWg 蛋白的理化性質(zhì)分析(Gasteiger,E.,Hoogland,C.,Gattiker,A.,Wilkins,M.R.,Appel,R.D.and Bairoch,A.2005.Protein identification and analysis tools on the ExPASy server.Methods Mol Biol 112:531-552)，使用Compute pI/Mw在線工具(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)進(jìn)行分子量與等電點(diǎn)的預(yù)測，依次給出了PaWg蛋白的氨基酸數(shù)(Number of amino acids)、分子量(Molecular weight)、理論等電點(diǎn)(Theoretical pI)、氨基酸組分(Amino acid composition)、正/負(fù)電荷殘基總數(shù)(Total number of positively/negatively charged residues)、原子總數(shù)(Total number of atoms)、原子組成(Atomic composition)、分子式(Formula)、不穩(wěn)定指數(shù)(Instability index)、脂肪指數(shù)(Aliphatic index)、消光系數(shù)(Extinction coefficients)、估計(jì)的半衰期(Estimated half-life)、總平均親水性(Grand average of hydropathicity，GRAVY)。

ProtParam預(yù)測PaWg蛋白理化性質(zhì)結(jié)果如圖6。結(jié)果顯示：該蛋白的理論等電點(diǎn)PI為9.46，分子量為4.4kD。原子總計(jì)包括6,078個(gè)原子，分子式為C₁₈₉₁H₃₀₁₀N₅₉₂O₅₅₁S₃₄；在組成PaWg蛋白的20種氨基酸中，甘氨酸(Gly)所占的比例最高，達(dá)到10.6％，色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)所占的比例最低，均為2.0％；脂肪指數(shù)為65.09；PaWg蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為39.37，根據(jù)GRP(Guruprasad-Reedy-Pandit)方法(Guruprasad,K.,Reddy,B.B.and Pandit,M.W.1990.Correlation between stability of a protein and its dipeptide composition:a novel approach for predicting in vivo stability of a protein from its primary sequence.Protein Eng 4:155-161)，推測PaWg蛋白穩(wěn)定。

3.2 PaWg蛋白質(zhì)疏水性分析：

使用ProtScale在線程序(http://us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl)進(jìn)行疏水性分析(Gasteiger,E.,Hoogland,C.,Gattiker,A.,Wilkins,M.R.,Appel,R.D.and Bairoch,A.2005.Protein identification and analysis tools on the ExPASy server.Methods Mol Biol 112:531-552)。分析得到值使用的是Kyte-Doolittle法(坎貝爾(Campbell A.M.),海爾(Heyer L.J.)著,孫之榮(主譯).2007.探索基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和生物信息學(xué).北京:科學(xué)出版社)來判斷氨該基酸是親水性或疏水性氨基酸(見圖7)。其中，氨基酸的疏水性用高正值表示，氨基酸的親水性用低負(fù)值表示。

圖7所示為PaWg蛋白的疏水性分析結(jié)果。表明PaWg蛋白屬于親水性蛋白。推測PaWg氨基酸在位點(diǎn)9-18之間和位點(diǎn)86處含疏水性區(qū)域。

3.3 PaWg蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析：

使用在線TMHMM Server v.2.0在線工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行跨膜區(qū)的預(yù)測，結(jié)果如圖8所示，表明PaWg蛋白不含有跨膜區(qū)。

3.4 PaWg蛋白質(zhì)信號肽分析：

使用在線SignalP 4.1Server工具(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)進(jìn)行信號肽的預(yù)測分析(Bendtsen,J.,Nielsen,H.,von Heijne,G.and Brunak,S.2004.Improved prediction of signal peptides:SignalP 3.0.J Mol Biol 340:783-795)。

其分析結(jié)果如圖9所示：PaWg蛋白的信號肽預(yù)測結(jié)果表明，第1-21位氨基酸序列是一段信號肽，21與22之間存在一個(gè)酶切位點(diǎn)。

3.5 PaWg蛋白質(zhì)N-糖基化位點(diǎn)及O-糖基化位點(diǎn)分析：

使用在線軟件NetNGlyc 1.0Server和在線DictyOGlyc 1.1server工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/DictyOGlyc/)對美洲大蠊的PaWg蛋白的N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測。

N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果如圖10。從結(jié)果我們可以看出，該蛋白可能包含兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別在107和343位點(diǎn)的天冬酰胺上。O-糖基化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果如圖11，結(jié)果表明，該蛋白不包含O-糖基化位點(diǎn)。

3.6 PaWg蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測：

使用PORTER服務(wù)器(http://distill.ucd.ie/porter/)進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測(Pollastri,G.and Mclysaght,A.2005.Porter:a new,accurate server for protein secondary structure prediction.Bioinformatics 21:1719-1720)。

結(jié)果如圖12所示，上一行為PaWg氨基酸序列，下一行為與之對應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)，其中C表示coil(無規(guī)則卷曲)，H表示helix(α螺旋)，E表示extended(β-折疊)，預(yù)測結(jié)果表明PaWg蛋白的二級結(jié)構(gòu)組分中，α螺旋(H)占33.75％<45％，β-折疊(E)占10.33％>5％，因此PaWg不屬于全α型蛋白。

實(shí)施例4：

本實(shí)施例4中，使用RNA干擾(RNAi)對實(shí)施例1中所獲得的美洲大蠊wingless基因進(jìn)行了功能測定。

4.1含T7啟動(dòng)子的DNA模板的制備：

其具體步驟如下：

1)以美洲大蠊雄性成蟲胸部組織cDNA樣品為模板，使用wg-F1(CGACAACATCGGCTACGGCT)和wg(T7)-R1(TAATACGACTCACTATAGGGCCTCTGCACCACGGACACCT)作為第一對上、下游引物，以wg(T7)-F2(TAATACGACTCACTATAGGGCGACAACATCGGCTACGGCT)和wg-R2(CCTCTGCACCACGGACACCT)作為第二對上、下游引物，分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，制備單鏈上含T7啟動(dòng)子(TAATACGACTCACTATAGG)的DNA模板，方法詳見實(shí)施例1.2。

2)目的片段的回收與連接：詳見實(shí)施例1.3.3；

3)轉(zhuǎn)化：方法詳見實(shí)施例1.3.4；

4)鑒定與測序：方法實(shí)施例1.3.5。

結(jié)果如圖13所示。結(jié)果表明，以美洲大蠊雄性成蟲胸部組織cDNA樣品為模板，使用這兩對引物分別可以擴(kuò)增出兩條550bp左右長度的含T7啟動(dòng)子的DNA模板，但是引物二聚體較多。隨后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠、純化、克隆，得到單一的PCR產(chǎn)物，送去上海生工公司進(jìn)行測序，序列片段經(jīng)過Blast比對之后，確認(rèn)為wingless基因。

4.2美洲大蠊wingless基因dsRNA的制備：

分別以4.1中獲得的兩條含T7啟動(dòng)子的單鏈DNA為模板，按T7RiboMAX^TM Express RNAi System試劑盒的說明書進(jìn)行操作，制備美洲大蠊wingless基因的dsRNA。

結(jié)果如圖14所示。結(jié)果表明，美洲大蠊wingless基因的dsRNA的片段大小與4.1中擴(kuò)增出的DNA模板大小一致，約為550bp。經(jīng)檢測該dsRNA的濃度為6,354ng/μl，OD_260/280＝2.05。

4.3注射wingless基因的dsRNA進(jìn)行RNA干擾：

首先取美洲大蠊卵莢、早期幼蟲、晚期幼蟲和成蟲胸部組織的cDNA樣品(方法見實(shí)施例1中1.2)，分別使用wingless基因和內(nèi)參基因β-actin的熒光定量PCR反應(yīng)特異引物(F：TTACCACCACTGCCGAACGA，R：CCTCTGGACAACGGAACCTC)，按照實(shí)時(shí)定量試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit，TaKaRa)的說明書進(jìn)行qRT-PCR，來檢測wingless基因在美洲大蠊各發(fā)育階段的表達(dá)情況，具體操作步驟方法如下：

1、qRT-PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析。制備梯度稀釋的cDNA模板，按10倍梯度列稀釋。操作方法按實(shí)時(shí)定量試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit，TaKaRa)重復(fù)三次進(jìn)行，結(jié)束后電泳檢測PCR產(chǎn)物的特異性。隨后作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖：橫坐標(biāo)是模板拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)是各濃度的Ct值。

2、根據(jù)標(biāo)曲，以β-actin基因作內(nèi)參基因，進(jìn)行wingless基因的qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系與標(biāo)曲的反應(yīng)體系一致。反應(yīng)程序也與標(biāo)曲的反應(yīng)程序一致，反應(yīng)重復(fù)三次。反應(yīng)結(jié)束后采用比較Ct值的方法RATE＝2^-ΔΔCT(Livak,K.J.and Schmittgen,T.D.2001.Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2^-ΔΔCTMethod.Methods 25:402-408)來分析wingless基因的表達(dá)水平。Ct值取三次重復(fù)反應(yīng)的平均值。使用SPSS 17.0對表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中P值小于0.05被認(rèn)為表達(dá)差異明顯。

取美洲大蠊6-9齡期幼蟲各5只及10只未受精的雌性成蟲，使用美國Hamilton注射進(jìn)樣針(配33號針頭)，在美洲大蠊幼蟲及成蟲第一對翅原基的部位(身體一側(cè))，注射3μl(3μg/μl) 的wingless基因的dsRNA，3小時(shí)之后，在美洲大蠊個(gè)體的身體另一側(cè)，注射同樣劑量的dsRNA，進(jìn)行wingless基因的RNA干擾。經(jīng)過RNA干擾后的個(gè)體，同樣進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)來檢測wingless基因的表達(dá)情況。隨后將美洲大蠊幼蟲個(gè)體分別置于玻璃瓶中養(yǎng)殖，將美洲大蠊雌性個(gè)體與正常的雄性成蟲一一配對，單獨(dú)置于玻璃瓶中養(yǎng)殖，定期更換食物和水。待美洲大蠊幼蟲發(fā)育為成蟲時(shí)，觀察其翅膀的發(fā)育情況。待美洲大蠊干擾后的雌性成蟲與正常雄性成蟲交配產(chǎn)出卵莢之后，觀察被干擾后的胚胎發(fā)育情況，同時(shí)觀察由干擾卵莢產(chǎn)出的幼蟲翅原基的發(fā)育情況。

為了排除非特異性影響的可能性，我們另外使用了水母綠熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)的一段長為720bp的序列(Chesebro,J.,Hrycaj,S.,Mahfooz,N.and,A.2009.Diverging functions of Scr between embryonic and post-embryonic development in a hemimetabolous insect,Oncopeltus fasciatus.Dev Biol 329:142-151.)，對美洲大蠊的幼蟲及成蟲進(jìn)行注射，以作為wingless基因注射的對照組(Hrycaj,S.,Chesebro,J.andA.2010.Functional analysis of Scr during embryonic and post-embryonic development in the cockroach,Periplaneta americana.Dev Biol 341:324-334.)。GFP蛋白的注射方法及注射部位與wingless基因完全一致。

結(jié)果如圖15所示，我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)參基因β-actin在美洲大蠊各個(gè)發(fā)育階段均有等量的表達(dá)，而wingless基因雖然在美洲大蠊各個(gè)發(fā)育階段中都能檢測出來，但是由圖15(A)可知，wingless基因在卵莢、早期幼蟲和晚期幼蟲中具有較高的表達(dá)量，而在成蟲中wingless基因的表達(dá)量降低。在GFP蛋白對照組中，經(jīng)GFP基因注射的美洲大蠊幼體發(fā)育為成蟲之后，其翅膀的表型與野生型一致，沒有發(fā)生特異性的表型改變。待GFP基因的dsRNA和wingless基因的dsRNA注射美洲大蠊10天后，我們再次提取各注射蟲體的RNA，反轉(zhuǎn)錄之后進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證wingless基因的表達(dá)情況，RT-PCR的產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，結(jié)果如圖15(B)所示。我們發(fā)現(xiàn)未進(jìn)行注射的野生型美洲大蠊體內(nèi)wingless基因正常表達(dá)，經(jīng)過GFP基因的dsRNA注射后的美洲大蠊也能正常表達(dá)wingless基因，且經(jīng)過GFP-dsRNA注射后的美洲大蠊，其體內(nèi)的wingless基因的表達(dá)量與野生型中的相等。然而，經(jīng)過wingless基因的dsRNA注射后的美洲大蠊，其體內(nèi)的wingless基因無表達(dá)。此結(jié)果說明，經(jīng)過wg-dsRNA注射之后的美洲大蠊，其體內(nèi)的wingless基因被干擾從而無法正常表達(dá)，表明注射后的美洲大蠊體內(nèi)wingless基因被成功敲除。

被wingless基因干擾后的各齡期幼蟲，發(fā)育至成蟲后，其翅均有明顯的表型改變，結(jié)果如圖16所示。野生型美洲大蠊的翅呈長橢圓狀，翅面較平整、翅脈清晰、翅邊緣完整(圖16，S1)。而幼蟲被干擾后發(fā)育出的翅，都有缺失或是彎曲折疊現(xiàn)象。我們在各齡期中選取較有代表性的表型改變現(xiàn)象作分析。六齡期幼蟲被干擾后發(fā)育出的翅，缺陷最為明顯，兩側(cè)前翅均有缺失、斷裂。一側(cè)前翅的翅尾彎曲、折疊，另一側(cè)前翅發(fā)育不完全，長度明顯小于野生型翅(圖16，S2)；而兩側(cè)后翅的表型變化更為明顯，明顯后翅發(fā)育不完全、存在翅尾斷裂、彎曲折疊、翅脈不清晰的表型改變(圖16，S3)。七齡期幼蟲被干擾后發(fā)育出的翅，兩側(cè)前翅發(fā)育較為完全，無缺失的現(xiàn)象，但是翅脈紋路不清晰，有多余的紋路出現(xiàn)，且翅尾有彎曲折疊現(xiàn)象(圖16，S4)；但是兩側(cè)后翅與六齡期幼蟲一樣，明顯發(fā)育不完全，小于野生型的翅，同時(shí)也出現(xiàn)了翅邊緣不完整、斷裂、彎曲折疊的表型改變，但是表型改變的現(xiàn)象較好與六齡期幼蟲(圖16，S5)。八齡期幼蟲被干擾后發(fā)育出的翅，前翅發(fā)育不完全，一側(cè)發(fā)育出較小的前翅，且翅面不平整、翅脈紋路不清晰、有多余紋路出現(xiàn)，翅尾斷裂、有彎曲折疊的表型改變(圖16，S6)；后翅發(fā)育的較為完整，無明顯的翅發(fā)育較小的現(xiàn)象，同時(shí)相比較于六齡期和七齡期的幼蟲，八齡期幼蟲后翅翅尾斷裂現(xiàn)象減少，但是翅脈紋路仍然不清晰(圖16，S7)。九齡幼蟲，是我們實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖中的末齡期幼蟲，是幼蟲發(fā)育為成蟲最關(guān)鍵的一個(gè)齡期。九齡幼蟲被干擾后發(fā)育的翅，其表型改變的情況明顯好轉(zhuǎn)于其他各齡期的幼蟲。前翅發(fā)育完全，翅脈紋路清晰，翅面平整，翅邊緣較為完整，僅有部分翅尾斷裂的現(xiàn)象(圖16，S8)；而后翅也能夠發(fā)育得較為完整，翅脈較為清晰，僅翅尾有部分?jǐn)嗔巡煌暾谋硇透淖?圖16，S9)。

同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)受到wg-dsRNA干擾后的雌蟲，大多不能產(chǎn)卵。即使有少量的卵莢產(chǎn)出，但干擾型產(chǎn)出的卵莢長度普遍短于野生型雌蟲產(chǎn)出的卵莢長度，卵莢內(nèi)卵的數(shù)量也少于野生型卵莢內(nèi)卵的數(shù)量。同時(shí)，受干擾后的雌蟲產(chǎn)出的卵莢不能正常孵化出一齡幼蟲。

我們的研究結(jié)果表明wingless基因在美洲大蠊各齡期幼蟲的翅發(fā)育過程中都起著至關(guān)重要的作用。Wingless基因不僅決定著美洲大蠊翅發(fā)育過程中有無翅的形成，同時(shí)在翅形狀、翅脈紋路、翅的平整性等多個(gè)翅發(fā)育功能方面也起著關(guān)鍵性的作用。Wingless基因?qū)g期小的幼蟲的干擾作用更大。Wingless基因?qū)γ恳积g期幼蟲進(jìn)行干擾之后，其后翅的表型改變都比前翅表型的改變更為明顯。因此我們推測wingless基因?qū)蟪岚l(fā)育的影響作用要大于對前翅發(fā)育的影響。Wingless基因的缺失，將會(huì)直接導(dǎo)致美洲大蠊前翅和后翅發(fā)育不完全，以及翅表型的改變。

另外，由于注射wg-dsRNA之后的美洲大蠊雌性成蟲的卵子受到干擾，無法與野生型雄性的精子結(jié)合形成受精卵，因此我們推測wingless基因在美洲大蠊的受精卵形成過程中也起到一定的作用。同時(shí)受干擾后的美洲大蠊卵莢的低孵化率，也表明wingless基因在美洲大蠊的胚胎發(fā)育早期階段起作用，導(dǎo)致早期胚胎的死亡。

基于以上結(jié)論可以得出，該美洲大蠊wingless基因全長cDNA序列可以用于殺蟲劑的制備，以防治農(nóng)業(yè)害蟲和城市衛(wèi)生害蟲。通過制備含有wingless蛋白缺失的殺蟲劑，噴灑城市衛(wèi)生害蟲蟑螂時(shí)，殺蟲劑與蟑螂表皮或附器接觸后滲入蟲體，通過RNA干擾的作用，在蟑螂體內(nèi)發(fā)揮功效，抑制蟑螂的翅膀發(fā)育，以及生殖功能的發(fā)育，導(dǎo)致蟑螂無法飛行，降低蟑螂的行動(dòng)能力；同時(shí)抑制雌性蟑螂的生殖能力，使雌性蟑螂無法繁殖后代，降低蟑螂的繁殖能力。

4.4美洲大蠊wingless基因體外轉(zhuǎn)錄：

以美洲大蠊wingless基因的含T7啟動(dòng)子的DNA為模板，使用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(Riboprobe in vitro Transcription Systems，Promega)制備該基因原位雜交的探針，其具體方法見該試劑盒操作說明；隨后將標(biāo)記探針應(yīng)用在RNA干擾中。同時(shí)，使用地高辛標(biāo)記UTP對NTP進(jìn)行修飾。

美洲大蠊wingless基因探針制備的結(jié)果如圖17所示。結(jié)果表明，該片段長度與DNA模板長度一致，約為550bp。探針經(jīng)過紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，經(jīng)檢測探針濃度為1,229ng/μl，OD_260/280＝2.06，檢測結(jié)果表明該探針的質(zhì)量較好，可用于后續(xù)原位雜交實(shí)驗(yàn)。

4.5美洲大蠊胚胎的原位雜交：

收集各個(gè)發(fā)育時(shí)期的美洲大蠊卵莢，提取出卵莢中的胚胎，使用甲醇、PBST溶液、50μg/ml蛋白酶K溶液、甲醛、雜交液、用地高辛標(biāo)記的RNA探針、顯色試劑盒(Promega)等進(jìn)行美洲大蠊胚胎的原位雜交實(shí)驗(yàn)，最后用80％甘油浸泡胚胎，顯微鏡觀察，-20℃保存。

其具體步驟如下：

1)收集各個(gè)發(fā)育時(shí)期的美洲大蠊卵莢，在操鏡臺中使用干凈、滅菌的剪刀和鑷子，小心的提取出卵莢中的胚胎，置于Embryo Wash Solution中進(jìn)行清洗。

2)另準(zhǔn)備一個(gè)小瓶，加入5ml 3.7％甲醛和5ml正庚烷，甲醛和正庚烷不相互溶解并分層，上層是正庚烷；

3)轉(zhuǎn)移已脫殼的美洲大蠊胚胎進(jìn)入瓶中，美洲大蠊胚胎會(huì)位于兩層液相之間；

4)間或劇烈震蕩15～20min；

5)吸去下層液相，但不要吸去兩層液相之間的美洲大蠊胚胎；

6)加入等體積的甲醇，劇烈震蕩2min；使卵膜破裂；

7)靜置1min，吸去上層液相及兩層液相之間的胚胎；

8)加甲醇洗胚胎三次，每次5min；

9)-20℃保存，或繼續(xù)以下實(shí)驗(yàn)；

以下的步驟須避免Rnase污染：

10)用PBST洗胚胎三次，每次5min；

11)用50μg/ml蛋白酶K對胚胎進(jìn)行處理，8-15min；

12)用PBST洗胚胎四次，每次3min；

13)用10％甲醛/PBST混合處理胚胎1-2h，震蕩；

14)用PBST洗胚胎五次，每次5min；

15)用雜交液等體積混合PBST，洗胚胎一次，10min；

16)用雜交液洗胚胎一次，10min；

17)用新鮮的雜交液進(jìn)行預(yù)雜交，48℃水浴1-2h；

18)在新的EP管中加入新鮮雜交液200μl，加用地高辛標(biāo)記的RNA探針，探針的終濃度為2ng/μl，沸水浴雜交液5min，冰浴2min；

19)吸去預(yù)雜交用的雜交液，加入含探針的雜交液，水浴48℃至少24-48h；

20)用48℃新鮮雜交液浸泡12-36h；

21)用新鮮預(yù)熱雜交液洗胚胎3次，每次20min；

22)用雜交液等體積混合PBST，洗胚胎一次，10min；

23)用PBST洗胚胎四次，每次10min；

24)步驟21、步驟22、步驟23在48℃水浴中進(jìn)行；

25)在PBST中稀釋抗地高辛抗體，抗體室溫下孵育胚胎2h以上；

26)用PBST洗胚胎四次，每次10min；

27)用AP Buffer洗胚胎三次，每次3min；

28)用顯色試劑盒進(jìn)行顯色；

29)用PBST洗胚胎三次，每次3min；

30)分別用25％、50％、75％、90％的乙醇和無水乙醇各洗胚胎一次；

31)用二甲苯與無水乙醇等體積混合處理胚胎一次，1h；

32)用無水乙醇洗胚胎若干次，洗去二甲苯；

33)用80％甘油浸泡胚胎，顯微鏡觀察，-20℃保存。

結(jié)果如圖18所示。結(jié)果表明，在美洲大蠊胚胎發(fā)育的早期階段，wingless基因在美洲大蠊的唇基部、觸角基部、胸部和腿基部都有表達(dá)，而到了胚胎發(fā)育的晚期階段，wingless基因的表達(dá)開始后移，在唇末梢、觸角中部、胸部、腿節(jié)及腹部都有表達(dá)，其中腹部的表達(dá)更為明顯：

1)wingless基因在胸部的發(fā)育：由圖18，S10可以看出，在美洲大蠊胚胎發(fā)育的早期階段，wingless基因首先在胸部第一體節(jié)中開始進(jìn)行表達(dá)，在胸部第二體節(jié)和第三體節(jié)中均無表達(dá)，表明wingless基因在胸部的表達(dá)是從第一體節(jié)逐漸開始的。而在美洲大蠊胚胎發(fā)育的完期階段(圖18，S11)，wingless基因的表達(dá)從第一體節(jié)延伸到了第二體節(jié)和第三體節(jié)中。

2)wingless基因在頭部的發(fā)育：我們對wingless基因在美洲大蠊胚胎中頭部的不同發(fā)育時(shí)期也做了比較。我們發(fā)現(xiàn)在早期胚胎中，wingless基因在觸角的基部有表達(dá)，結(jié)果如圖18，S12所示。而在晚期胚胎的發(fā)育中，我們發(fā)現(xiàn)wingless基因在觸角中的表達(dá)向觸角中部遷移，結(jié)果如圖18，S13所示。

另外，我們發(fā)現(xiàn)在美洲大蠊胚胎發(fā)育的早期，wingless基因在下唇須的基部有表達(dá)，結(jié)果如圖S12所示；而在胚胎發(fā)育的晚期，wingless基因在下唇須中的表達(dá)則是向下唇須的末梢部遷移，尤其是在下唇須的末梢部位，wingless基因的表達(dá)尤為強(qiáng)烈，結(jié)果如圖18，S14所示。

3)wingless基因在腿部的發(fā)育：我們在美洲大蠊胚胎發(fā)育的早期階段發(fā)現(xiàn)，wingless僅在前足的基部有一定的表達(dá)，在中足和后足的基部均未發(fā)現(xiàn)有wingless的表達(dá)，結(jié)果如圖18，S12所示。在美洲大蠊胚胎發(fā)育的晚期階段，我們發(fā)現(xiàn)wingless基因在前足、中足和后足中均有表達(dá)，且在各足的關(guān)節(jié)處表達(dá)尤為強(qiáng)烈，結(jié)果如圖18，S15、S16和S17所示。S16表明wingless在中足的關(guān)節(jié)處表達(dá)量增加，而圖S17表明wingless在后足的關(guān)節(jié)處有強(qiáng)烈的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果標(biāo)明，在美洲大蠊胚胎發(fā)育過程中，wingless基因在美洲大蠊的胸部、頭部和腿部均有明顯的功能作用。在胸部發(fā)育過程中，wingless基因主要作用于胸部體節(jié)外側(cè)，引起美洲大蠊的翅發(fā)育的分階段進(jìn)行，首先是前翅翅原基在早期胚胎中進(jìn)行發(fā)育，接著是后翅翅原基在中后期胚胎發(fā)育中進(jìn)行。在頭部發(fā)育過程中，wingless基因?qū)γ乐薮篌褂|角發(fā)育、下唇須的延伸、以及足關(guān)節(jié)的形成和足關(guān)節(jié)的延伸都起著一定的調(diào)控作用。wingless基因調(diào)控了美洲大蠊整個(gè)胚胎發(fā)育時(shí)期。

基于以上結(jié)論可以得出，該美洲大蠊wingless基因全長cDNA序列可以用于生物探針的制備：70年代以來，我國已成功地大量飼養(yǎng)赤眼蜂、平腹小蜂、草蛉、七星瓢蟲、麗蚜小蜂、食蚜癭蚊、小花蝽、智利小植綏螨、西方盲走螨、側(cè)溝繭蜂等捕食或寄生性天敵昆蟲。通過wingless基因在昆蟲蟑螂體內(nèi)的研究基礎(chǔ)，可以為研究其他捕食或寄生性天敵昆蟲的wingless基因奠定重要的基礎(chǔ)。從而通過制備捕食或寄生性天敵昆蟲的wingless基因探針，在人工繁殖天敵昆蟲時(shí)，利用wingless基因探針，使這類天敵昆蟲的wingless基因充分發(fā)揮作用，增加天敵昆蟲的翅發(fā)育功能，增強(qiáng)它們的飛行能力，從而能夠更有效的發(fā)揮它們的天敵作用。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書、說明書及其等效物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 揚(yáng)州大學(xué)

<120> 美洲大蠊wingless基因全長鑒定及應(yīng)用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1456

<212> DNA

<213> Periplaneta americana

<400> 1

acaaatcggt agctgtcgga tcggttcggc aggtctcgtg ggggcggcat cggtcgccat 60

ctcctccccc gcccccgcta actcgctttc atttttttct ggcgtctgtg cggtgccggc 120

tggtgctcgt aggtgctcct ggtgtctcca tgtgacgatg aagtggtcca gtgcaccttt 180

ggtgctgatg accctgctga tggccctcgt caccctcgcc gaggaggtgg ccagcaagaa 240

caaggccggg cgcggacgcg gcagcaagtg gtgggggatt gcgaaagccg gcgagcccaa 300

caacttgctt ccgcagacgc cgggcgcgct ctacatggac ccggccgtgc acgccattct 360

gcggcggaag cagagacgtc tagttcggga gaacccggga gttcttgtgg cggtagccaa 420

aggtgctaac caggccatcg tagaatgcca gttccagttt cgaaacagga ggtggaactg 480

ctcgacaaga aattttctac gaggcaaaaa tctcttcgga aaaattgttg acagaggttg 540

tcgggagacg gcgttcatat acgcgatcac aagtgcgggc gtgacacacg ccatcgcgcg 600

ggcgtgcagc gagggcagca tcgagtcgtg cacgtgtgat tacagccacc aggcgcgggc 660

gccgcaggtg acgtccgtgc ccggcctgcg cgactgggag tgggcgggct gctccgacaa 720

catcggctac ggcttcaagt tctcccgcga attcgtcgat accggcgagc gggggcgcaa 780

cctccgcgag aagatgaatc tccacaacaa tgaggccggc agagcgcacg tttcctcgga 840

gatgcgtcaa gaatgtaagt gccacggcat gtctggctcc tgcacggtca agacctgctg 900

gatgcggctg cccagcttcc gagtcgtagg cgacaacctc aaggatcgct tcgacggcgc 960

gtccagagtg atggtgagta acgcgggcag cctgcgcggc cagggtggta gcggcggcag 1020

cggcgtcggt ggtaagaaga acagatacaa cttccaactg aaaccctaca acccggacca 1080

caagccgccc ggccccaaag acctggtcta cttggagcct tccccagggt tctgcgagcg 1140

caacccgaga ctcggtatcc aaggcacgca cggacgtcag tgcaacgata cgtcgatagg 1200

cgtggatggt tgcgacctca tgtgttgtgg gcgaggatat agaactcatg aggtgtccgt 1260

ggtgcagagg tgtgcgtgca tgttccactg gtgctgcgaa gtcaagtgca acctctgtcg 1320

gacaaagaaa accattcaca cgtgtctgtg agtggtgaaa aagaaacaat tcacccatac 1380

tagtgagtgc tgcaaataaa acaatccaca cgtgtctgtg agtggtggaa aaaaaaaaaa 1440

aaaaaaaaaa aaaaaa 1456

<210> 2

<211> 397

<212> PRT

<213> Periplaneta americana

<400> 2

Met Lys Trp Ser Ser Ala Pro Leu Val Leu Met Thr Leu Leu Met Ala

1 5 10 15

Leu Val Thr Leu Ala Glu Glu Val Ala Ser Lys Asn Lys Ala Gly Arg

20 25 30

Gly Arg Gly Ser Lys Trp Trp Gly Ile Ala Lys Ala Gly Glu Pro Asn

35 40 45

Asn Leu Leu Pro Gln Thr Pro Gly Ala Leu Tyr Met Asp Pro Ala Val

50 55 60

His Ala Ile Leu Arg Arg Lys Gln Arg Arg Leu Val Arg Glu Asn Pro

65 70 75 80

Gly Val Leu Val Ala Val Ala Lys Gly Ala Asn Gln Ala Ile Val Glu

85 90 95

Cys Gln Phe Gln Phe Arg Asn Arg Arg Trp Asn Cys Ser Thr Arg Asn

100 105 110

Phe Leu Arg Gly Lys Asn Leu Phe Gly Lys Ile Val Asp Arg Gly Cys

115 120 125

Arg Glu Thr Ala Phe Ile Tyr Ala Ile Thr Ser Ala Gly Val Thr His

130 135 140

Ala Ile Ala Arg Ala Cys Ser Glu Gly Ser Ile Glu Ser Cys Thr Cys

145 150 155 160

Asp Tyr Ser His Gln Ala Arg Ala Pro Gln Val Thr Ser Val Pro Gly

165 170 175

Leu Arg Asp Trp Glu Trp Ala Gly Cys Ser Asp Asn Ile Gly Tyr Gly

180 185 190

Phe Lys Phe Ser Arg Glu Phe Val Asp Thr Gly Glu Arg Gly Arg Asn

195 200 205

Leu Arg Glu Lys Met Asn Leu His Asn Asn Glu Ala Gly Arg Ala His

210 215 220

Val Ser Ser Glu Met Arg Gln Glu Cys Lys Cys His Gly Met Ser Gly

225 230 235 240

Ser Cys Thr Val Lys Thr Cys Trp Met Arg Leu Pro Ser Phe Arg Val

245 250 255

Val Gly Asp Asn Leu Lys Asp Arg Phe Asp Gly Ala Ser Arg Val Met

260 265 270

Val Ser Asn Ala Gly Ser Leu Arg Gly Gln Gly Gly Ser Gly Gly Ser

275 280 285

Gly Val Gly Gly Lys Lys Asn Arg Tyr Asn Phe Gln Leu Lys Pro Tyr

290 295 300

Asn Pro Asp His Lys Pro Pro Gly Pro Lys Asp Leu Val Tyr Leu Glu

305 310 315 320

Pro Ser Pro Gly Phe Cys Glu Arg Asn Pro Arg Leu Gly Ile Gln Gly

325 330 335

Thr His Gly Arg Gln Cys Asn Asp Thr Ser Ile Gly Val Asp Gly Cys

340 345 350

Asp Leu Met Cys Cys Gly Arg Gly Tyr Arg Thr His Glu Val Ser Val

355 360 365

Val Gln Arg Cys Ala Cys Met Phe His Trp Cys Cys Glu Val Lys Cys

370 375 380

Asn Leu Cys Arg Thr Lys Lys Thr Ile His Thr Cys Leu

385 390 395

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<400> 3

aaggatcgct tcgacggcgc gtc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

ccgcaacaca tsagrtcrca ncc 23

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<400> 5

gagccttccc cagggttctg cgagc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<400> 6

gactcggtat ccaaggcacg cacgg 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<400> 7

ccctggggaa ggctccaagt agacc 25

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<400> 8

ttcttcttac caccgacgcc gctgc 25

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<400> 9

ttcttgacgc atctccgagg aaacg 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工引物序列

<400> 10

ggagaacttg aagccgtagc cgatg 25