本發明涉及生物技術，具體涉及一種熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體及其構建方法。
背景技術：
：LOX（Lipoxygenase，LOX）是非血紅素、非硫鐵過氧化酶，它能催化具有順,順-1,4-戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸及其酯類發生空間及位置特異性的雙加氧反應，生成相應的氫過氧化物。在植物中其天然底物主要是亞油酸和亞麻酸，在動物體內其天然底物主要是花生四烯酸。LOX作為無毒、無害、天然的添加劑在食品、醫藥、化工等領域有著重要的應用價值。在面粉的加工過程中它能夠將面粉中的多不飽和脂肪酸催化氧化成氫過氧化物，這些氫過氧化物能夠起到提高面粉白度，增強面筋蛋白強度的作用。另外，在污水處理與環境保護方面，可以用于染料的降解。然而脂肪氧合酶熱穩定性差的缺陷限制了其在工業上的應用。因此，通過分子改造來提高脂肪氧合酶熱穩定性以期獲得酶學性質更適用工業應用的突變酶是目前的研究熱點。技術實現要素：本發明目的是為了提供一種酶活與熱穩定性同時提高的脂肪氧合酶突變體及其構建方法，提高了脂肪氧合酶突變體的熱穩定性，擴展了應用范圍。本發明的技術方案如下：一種熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體，該脂肪氧合酶突變體具有如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5或SEQIDNO.6中任一種所示的氨基酸序列。一種以上所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體中PCR反應的簡并引物，其特征在于，該簡并引物具體如下：N130-f：TTACTCACNNKCTGGCAAAATATGACATCAAG；N130-r：TTTGCCAGMNNGTGAGTAAGCTCATGTG；S437-f：GGAAAAATCANNKATATTGGAACCAGGACTTC；S437-r：TCCAATATMNNTGATTTTTCCCGAATGAGCG；G260-f：GCTAACGCAGNNKTCTATTGTTGATGTAA；G260-r：AACAATAGAMNNCTGCGTTAGCATG。一種以上所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體的構建方法，包括以下步驟：（1）魚腥藻脂肪氧合酶突變位點確定：將魚腥藻脂肪氧合酶自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位絲氨酸作為飽和突變位點；（2）魚腥藻脂肪氧合酶突變體庫的建立及突變體篩選：以重組質粒為模板，在第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位絲氨酸相對應的核苷酸處利用NNK代替原有密碼子設計簡并引物，該簡并引物如以上所述，進行全質粒PCR反應，構建3個定點飽和突變庫，DpnI消化模板，純化后產物直接轉化大腸桿菌，將轉化后的大腸桿菌涂布于含有100μg/ml氨芐抗性LB平板上，37℃下培養16-24小時，得到3個飽和突變庫；（3）取3個飽和突變庫的菌落接種于含有氨芐LB培養基的96孔板中，于37℃過夜培養，得到3個突變體庫的母版，取母版接種于含有氨芐LB培養基的96孔板中，37℃下培養3h，再加入IPTG低溫誘導16h；然后裂解菌體，得到粗酶液，將粗酶液在50℃條件下孵育5min，冷卻，測定殘余活力，得到陽性突變體；；（4）將步驟（3）得到的陽性突變體接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃，180rpm培養至OD600為0.6-0.8時，加IPTG低溫誘導，離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體，將上清液過Ni-NTA親和柱純化，透析去除咪唑即得到純的脂肪氧合酶突變體。進一步地，所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體的構建方法，步驟（2）中大腸桿菌為大腸桿菌E.coliBL21(DE3)。進一步地，所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體的構建方法，其特征在于，步驟（2）中重組質粒為重組質粒pET32a-Ana-LOX。進一步地，所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體的構建方法，步驟（2）中全質粒PCR反應的反應條件為：96℃5min；然后98℃10s，55℃5s，72℃90s，共25個循環；最后72℃5min。進一步地，所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體的構建方法，步驟（3）中裂解菌體采用凍融破碎的方法進行，具體為-70℃冷凍2小時，室溫融化1小時，反復凍融。以上所述的熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體在食品、制藥、造紙或污水處理中的應用。與野生型魚腥藻脂肪氧合酶相比，本發明的脂肪氧合酶突變體的熱穩定性獲得了提高，以各自的比活力及半衰期t1/2來表示酶活與熱穩定性的提高，本發明的脂肪氧合酶突變體熱穩定性提高如表1所示。表1本發明首先利用已知的結構與生物信息學信息，找出可能的突變位點，在對這些位點進行飽和突變，構建突變文庫；然后在96孔板上進行誘導表達；最后對文庫進行篩選得到性質改良的突變體。再以此突變株作為模板，組合其余位點的突變，重復上述過程。本發明運用半理性設計的方法，對魚腥藻脂肪氧合酶基因進行多輪定點飽和突變，獲取脂肪氧合酶突變體，這些突變體包含氨基酸突變G260A、S437T、N130D及組合突變體N130D/S437Y、N130D/G260Q。以各自的比活力與半衰期t1/2來表示，脂肪氧合酶突變體的活力與熱穩定性得到了提高，具有較高的實際應用價值和廣闊的市場前景。附圖說明圖1為本發明實施例1中脂肪氧合酶家族蛋白的系統發育樹圖；圖2為本發明實施例1中多重序列比對選擇突變位點圖；圖3為本發明實施例1中脂肪氧合酶突變體熱失活動力學圖；圖4為本發明實施例1中脂肪氧合酶突變體最適反應溫度圖。具體實施方式實施例11.飽和突變位點的確定：對脂肪氧合酶家族進行系統發育分析，選擇與魚腥藻脂肪氧合酶進化關系緊密的同一家族的氨基酸序列進行多重序列比對，結合結構信息確定下列位點為飽和突變位點：自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸、437位絲氨酸。其中魚腥藻脂肪氧合酶氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。突變位點選擇過程具體為在pfam數據庫中選擇脂肪氧合酶家族序列，將其通道blastp與Ana-LOX進行比對，篩選出相似度30%-90%的序列，并構建系統發育樹，最終選擇與Ana-LOX親緣關系最近的序列（圖1）。將這些序列進行多重序列比對，比對結果與Ana-LOX進行比較，篩選出潛在的突變位點（圖2）。Ana-LOX序列提交phyre2網站構建三維模型，將潛在的突變位點放在模型中結合作用力分析，最終確定自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸、437位絲氨酸為突變位點。其中圖1為脂肪氧合酶家族蛋白的系統發育樹圖，通過構建Ana-LOX與其蛋白質家族的系統發育樹篩選出8條序列與其進化關系緊密，選擇這些序列進行多重序列比對。圖2為多重序列比對選擇突變位點圖，可以發現Ana-LOX氨基酸序列與其多重序列比對存在大量的位點不一致，例如130號位Ana-LOX為天冬酰胺而該處頻率最高的氨基酸為天冬氨酸，可以將其視為潛在的突變位點，可以做為進一步分析的候選。2.魚腥藻脂肪氧合酶突變體庫的建立及突變體篩選用下述方法篩選具有較好熱穩定性的魚腥藻脂肪氧合酶的突變體，具體過程包括以下步驟：1）根據突變位點構建飽和突變庫并導入宿主細胞以重組質粒pET32a-Ana-LOX為模板，根據以上確定的突變位點，分別在第130位天冬酰胺、260位甘氨酸、437位絲氨酸相對應的核苷酸處利用NNK代替原有密碼子，設計簡并引物：N130-fTTACTCACNNKCTGGCAAAATATGACATCAAG（SEQIDNO.7）N130-rTTTGCCAGMNNGTGAGTAAGCTCATGTG（SEQIDNO.8）S437-fGGAAAAATCANNKATATTGGAACCAGGACTTC（SEQIDNO.9）S437-rTCCAATATMNNTGATTTTTCCCGAATGAGCG（SEQIDNO.10）G260-fGCTAACGCAGNNKTCTATTGTTGATGTAA（SEQIDNO.11）G260-rAACAATAGAMNNCTGCGTTAGCATG（SEQIDNO.12）以上簡并引物中，N代表ATCG中的任一種；M代表A和C中的任一種；K代表G和T中的任一種。然后進行全質粒PCR反應，使用TaKaRa公司的PrimeSTARDNA聚合酶，PCR反應條件為：96℃5min；然后98℃10s，55℃5s，72℃90s，共25個循環；最后72℃5min。構建3個定點飽和突變庫，DpnI消化模板，純化后產物直接轉化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，將轉化后的大腸桿菌涂布于含有100μg/ml氨芐抗性LB平板上，37℃下培養16-24小時，得到3個飽和突變庫；2）從飽和突變體庫中篩選熱穩定性提高的突變體取飽和突變庫中的菌落接種于含有100μg/ml氨芐LB培養基的96孔板中，于37℃過夜培養，得到3個突變體庫的母版；從培養好的母版中取20μl接種至含有100μg/ml氨芐LB培養基的96孔板中，37℃下培養3h，在加入終濃度為100μg/ml的IPTG，16℃誘導16h；利用凍融破碎的方法裂解菌體，得到粗酶液；將所得到的粗酶液在50℃下孵育5min，在冰上冷卻，測定每孔的殘余活力；以野生型為對照，將殘余活力高于野生型的作為陽性突變體。將篩選到的陽性突變體工程菌接種于含有100μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃，180rpm培養至OD600為0.6-0.8時，加IPTG至100μg/mL，低溫16℃誘導16h，離心收集菌體，用磷酸鹽緩沖液重懸菌體，超聲波破碎菌體，并將上清液過Ni-NTA親和柱純化，透析去除咪唑即可得到純的脂肪氧合酶突變體；純酶液測定50℃下的半衰期，確定每個突變體庫中熱穩定性最高的突變體，進行測序，至此完成了第一輪篩選，得到三個熱穩定性與酶活提高的突變體，分別為N130D，G260A和S437T，分別對應SEQIDNO.2，3和4。以N130D的基因作為模板，進行突變體組合：針對260位甘氨酸、437位絲氨酸位點設計飽和突變庫，并參考上述步驟進行新一輪的篩選；經過組合突變，獲得了兩株熱穩定性與酶活力顯著提高的突變株，經測序確定兩株組合突變體分別為：N130D/G260Q，N130D/S437Y，分別對應SEQIDNO.5和6。為了測定脂肪氧合酶突變體的比活力與半衰期，對酶進行分離純化。將超聲破碎得到的粗酶液通過Ni2+離子親和柱進行純化，透析過夜即可得到純的脂肪氧合酶突變體純酶。脂肪氧合酶在50℃下半衰期的測定方法為：50℃下孵育酶液，在不同處理時間取樣，測定殘余活力百分比。以殘余活力百分比的ln值對時間t（min）作圖，直線的斜率為失活常數kd，由t1/2=ln2/kd得到脂肪氧合酶在該溫度下的半衰期。圖3為脂肪氧合酶突變體熱失活動力學圖在單點突變中N130D突變對酶熱穩定性的改良最為顯著。在N130D的基礎上，組合突變體N130D/S437Y、N130D/G260Q的熱穩定性也有了進一步提升。圖4為脂肪氧合酶突變體最適反應溫度圖，突變體對溫度的適應范圍相比野生型變得更寬，在常溫下25℃野生型活力低于50%，而突變體均超過60%，可以推測突變體活化能降低。野生型對穩定較為敏感，當溫度超過最適反應溫度35℃，酶活急劇下降，而突變體S437T與N130D/S437Y的最適反應溫度可以達到45℃。組合突變體N130D/S437Y、N130D/G260Q即使達到55℃的高溫依然可以保持70%以上的活力，而此時野生型已經失活。具有Ser437位置的突變體S437T與N130D/S437Y最適反應溫度均提高了10℃，表明Ser437位置時影響最適反應溫度的關鍵氨基酸。脂肪氧合酶目前在多個領域都有著廣泛的應用，如在食品領域可使面粉增白，在造紙、染料、涂料、洗滌劑、污水處理、聚氯乙烯增塑劑的工業化生產，還可作為藥物合成的中間體，所以脂肪氧合酶也被用于其他工業催化用途，如利用脂肪氧合酶對脂肪酸或脂肪酸酯進行選擇性催化，形成特定的氫過氧化脂肪酸及其酯的衍生物，再將之環氧化，生成環氧化油，則可減小石油用量；氫過氧化油脂經還原得到羥基油脂，經過氧化物酶裂解得到不飽和酸及醛，再進一步反應可以得到二元酸，這些物質在食品、化工、生物技術等領域都有重要用途。因此，本發明提供的脂肪氧合酶突變體能夠在以上領域進行更好的應用。序列表<110>南京農業大學<120>一種熱穩定性提高的脂肪氧合酶突變體及其構建方法<130>1<160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>455<212>PRT<213>魚腥藻脂肪氧合酶野生型氨基酸序列<400>1GlyValSerGlyAlaLeuValHisTyrPheGlySerIleValArgAla151015GluArgThrGlnTyrLeuTyrGlySerLysAspAspLeuProGlyLys202530ProValTyrPheProLeuProValThrGluIleProSerLysArgPhe354045LeuPheLeuLeuGluLysTyrAsnPheLeuThrAspAsnSerTyrPro505560SerAspGlyGluHisAspLysIleGluAlaLeuValSerAlaMetPro65707580ThrThrAlaLeuAspLeuAlaValGlyThrThrAspProThrAspIle859095ProAspSerTyrPheLeuGluArgArgLeuAsnGlyTyrAsnProGly100105110AlaIleArgGluSerSerGlyGlnGluGlyTrpThrHisGluLeuThr115120125HisAsnLeuAlaLysTyrAspIleLysProGlyLeuHisPheProAsp130135140PheValGlnCysArgLeuPheValAspLysGlnAsnGlyValLysLeu145150155160HisSerIleLysIleAspAspHisGluIleThrProCysGlnGluGln165170175TrpGlnTyrAlaLysArgThrTyrLeuGlnAlaGluPheLeuSerGln180185190GluLeuLysLeuHisLeuAlaArgCysHisPheAsnIleGluGlnTyr195200205ValMetAlaIleLysArgArgLeuAlaProThrHisProValArgAla210215220PheIleAsnProHisLeuGluGlyLeuIlePheIleAsnSerSerAla225230235240ValProLysIleIleGlySerThrGlyPheIleProIleAlaSerMet245250255LeuThrGlnGlySerIleValAspValMetLysAsnGluLeuSerLys260265270LeuSerTyrMetTrpAsnProIleAlaAspLeuProArgAspIlePro275280285GlyAspLeuPheThrProAlaAlaThrAlaTyrTrpGluLeuLeuAsn290295300AsnTyrValGluGlnGlyLeuLeuGlnProPheGluAspGluLeuArg305310315320ThrGluValAsnAlaIleGlnValAspGluLeuPheAlaGluLeuLys325330335GluArgSerLeuTyrSerGlyAspGlnProProLysTyrAspSerSer340345350GluLeuLysSerLeuLeuMetTyrIleIleTyrHisSerSerPheLeu355360365HisSerTrpAlaAsnPheLysGlnTyrAspAspAlaGlyAsnProAsn370375380HisValSerMetGlyAspTyrSerGlnTyrAspGlnGlnThrGlnAsp385390395400LysIleArgPheSerGlnArgSerLeuThrTrpValLeuSerSerIle405410415ArgTyrAsnSerValAlaValTyrGlySerAspLeuLeuLysGlnLeu420425430IleArgGluLysSerSerIleLeuGluProGlyLeuProLeuGluAsp435440445LeuMetMetSerIleAsnIle450455<210>2<211>455<212>PRT<213>魚腥藻脂肪氧合酶N130D突變體氨基酸序列<400>2GlyValSerGlyAlaLeuValHisTyrPheGlySerIleValArgAla151015GluArgThrGlnTyrLeuTyrGlySerLysAspAspLeuProGlyLys202530ProValTyrPheProLeuProValThrGluIleProSerLysArgPhe354045LeuPheLeuLeuGluLysTyrAsnPheLeuThrAspAsnSerTyrPro505560SerAspGlyGluHisAspLysIleGluAlaLeuValSerAlaMetPro65707580ThrThrAlaLeuAspLeuAlaValGlyThrThrAspProThrAspIle859095ProAspSerTyrPheLeuGluArgArgLeuAsnGlyTyrAsnProGly100105110AlaIleArgGluSerSerGlyGlnGluGlyTrpThrHisGluLeuThr115120125HisAspLeuAlaLysTyrAspIleLysProGlyLeuHisPheProAsp130135140PheValGlnCysArgLeuPheValAspLysGlnAsnGlyValLysLeu145150155160HisSerIleLysIleAspAspHisGluIleThrProCysGlnGluGln165170175TrpGlnTyrAlaLysArgThrTyrLeuGlnAlaGluPheLeuSerGln180185190GluLeuLysLeuHisLeuAlaArgCysHisPheAsnIleGluGlnTyr195200205ValMetAlaIleLysArgArgLeuAlaProThrHisProValArgAla210215220PheIleAsnProHisLeuGluGlyLeuIlePheIleAsnSerSerAla225230235240ValProLysIleIleGlySerThrGlyPheIleProIleAlaSerMet245250255LeuThrGlnGlySerIleValAspValMetLysAsnGluLeuSerLys260265270 LeuSerTyrMetTrpAsnProIleAlaAspLeuProArgAspIlePro275280285GlyAspLeuPheThrProAlaAlaThrAlaTyrTrpGluLeuLeuAsn290295300AsnTyrValGluGlnGlyLeuLeuGlnProPheGluAspGluLeuArg305310315320ThrGluValAsnAlaIleGlnValAspGluLeuPheAlaGluLeuLys325330335GluArgSerLeuTyrSerGlyAspGlnProProLysTyrAspSerSer340345350GluLeuLysSerLeuLeuMetTyrIleIleTyrHisSerSerPheLeu355360365HisSerTrpAlaAsnPheLysGlnTyrAspAspAlaGlyAsnProAsn370375380HisValSerMetGlyAspTyrSerGlnTyrAspGlnGlnThrGlnAsp385390395400LysIleArgPheSerGlnArgSerLeuThrTrpValLeuSerSerIle405410415ArgTyrAsnSerValAlaValTyrGlySerAspLeuLeuLysGlnLeu420425430IleArgGluLysSerSerIleLeuGluProGlyLeuProLeuGluAsp435440445LeuMetMetSerIleAsnIle450455<210>3<211>455<212>PRT<213>魚腥藻脂肪氧合酶G260A突變體氨基酸序列<400>3GlyValSerGlyAlaLeuValHisTyrPheGlySerIleValArgAla151015GluArgThrGlnTyrLeuTyrGlySerLysAspAspLeuProGlyLys202530ProValTyrPheProLeuProValThrGluIleProSerLysArgPhe354045LeuPheLeuLeuGluLysTyrAsnPheLeuThrAspAsnSerTyrPro505560SerAspGlyGluHisAspLysIleGluAlaLeuValSerAlaMetPro65707580ThrThrAlaLeuAspLeuAlaValGlyThrThrAspProThrAspIle859095ProAspSerTyrPheLeuGluArgArgLeuAsnGlyTyrAsnProGly100105110AlaIleArgGluSerSerGlyGlnGluGlyTrpThrHisGluLeuThr115120125HisAsnLeuAlaLysTyrAspIleLysProGlyLeuHisPheProAsp130135140PheValGlnCysArgLeuPheValAspLysGlnAsnGlyValLysLeu145150155160HisSerIleLysIleAspAspHisGluIleThrProCysGlnGluGln165170175TrpGlnTyrAlaLysArgThrTyrLeuGlnAlaGluPheLeuSerGln180185190GluLeuLysLeuHisLeuAlaArgCysHisPheAsnIleGluGlnTyr195200205ValMetAlaIleLysArgArgLeuAlaProThrHisProValArgAla210215220PheIleAsnProHisLeuGluGlyLeuIlePheIleAsnSerSerAla225230235240ValProLysIleIleGlySerThrGlyPheIleProIleAlaSerMet245250255LeuThrGlnAlaSerIleValAspValMetLysAsnGluLeuSerLys260265270LeuSerTyrMetTrpAsnProIleAlaAspLeuProArgAspIlePro275280285GlyAspLeuPheThrProAlaAlaThrAlaTyrTrpGluLeuLeuAsn290295300AsnTyrValGluGlnGlyLeuLeuGlnProPheGluAspGluLeuArg305310315320ThrGluValAsnAlaIleGlnValAspGluLeuPheAlaGluLeuLys325330335GluArgSerLeuTyrSerGlyAspGlnProProLysTyrAspSerSer340345350GluLeuLysSerLeuLeuMetTyrIleIleTyrHisSerSerPheLeu355360365HisSerTrpAlaAsnPheLysGlnTyrAspAspAlaGlyAsnProAsn370375380HisValSerMetGlyAspTyrSerGlnTyrAspGlnGlnThrGlnAsp385390395400LysIleArgPheSerGlnArgSerLeuThrTrpValLeuSerSerIle405410415ArgTyrAsnSerValAlaValTyrGlySerAspLeuLeuLysGlnLeu420425430IleArgGluLysSerSerIleLeuGluProGlyLeuProLeuGluAsp435440445LeuMetMetSerIleAsnIle450455<210>4<211>455<212>PRT<213>魚腥藻脂肪氧合酶S437T突變體氨基酸序列<400>4GlyValSerGlyAlaLeuValHisTyrPheGlySerIleValArgAla151015GluArgThrGlnTyrLeuTyrGlySerLysAspAspLeuProGlyLys202530ProValTyrPheProLeuProValThrGluIleProSerLysArgPhe354045LeuPheLeuLeuGluLysTyrAsnPheLeuThrAspAsnSerTyrPro505560SerAspGlyGluHisAspLysIleGluAlaLeuValSerAlaMetPro65707580ThrThrAlaLeuAspLeuAlaValGlyThrThrAspProThrAspIle859095ProAspSerTyrPheLeuGluArgArgLeuAsnGlyTyrAsnProGly100105110AlaIleArgGluSerSerGlyGlnGluGlyTrpThrHisGluLeuThr115120125HisAsnLeuAlaLysTyrAspIleLysProGlyLeuHisPheProAsp130135140PheValGlnCysArgLeuPheValAspLysGlnAsnGlyValLysLeu145150155160HisSerIleLysIleAspAspHisGluIleThrProCysGlnGluGln165170175TrpGlnTyrAlaLysArgThrTyrLeuGlnAlaGluPheLeuSerGln180185190GluLeuLysLeuHisLeuAlaArgCysHisPheAsnIleGluGlnTyr195200205ValMetAlaIleLysArgArgLeuAlaProThrHisProValArgAla210215220PheIleAsnProHisLeuGluGlyLeuIlePheIleAsnSerSerAla225230235240ValProLysIleIleGlySerThrGlyPheIleProIleAlaSerMet245250255LeuThrGlnGlySerIleValAspValMetLysAsnGluLeuSerLys260265270LeuSerTyrMetTrpAsnProIleAlaAspLeuProArgAspIlePro275280285GlyAspLeuPheThrProAlaAlaThrAlaTyrTrpGluLeuLeuAsn290295300AsnTyrValGluGlnGlyLeuLeuGlnProPheGluAspGluLeuArg305310315320ThrGluValAsnAlaIleGlnValAspGluLeuPheAlaGluLeuLys325330335GluArgSerLeuTyrSerGlyAspGlnProProLysTyrAspSerSer340345350GluLeuLysSerLeuLeuMetTyrIleIleTyrHisSerSerPheLeu355360365HisSerTrpAlaAsnPheLysGlnTyrAspAspAlaGlyAsnProAsn370375380HisValSerMetGlyAspTyrSerGlnTyrAspGlnGlnThrGlnAsp385390395400LysIleArgPheSerGlnArgSerLeuThrTrpValLeuSerSerIle405410415ArgTyrAsnSerValAlaValTyrGlySerAspLeuLeuLysGlnLeu420425430IleArgGluLysThrSerIleLeuGluProGlyLeuProLeuGluAsp435440445LeuMetMetSerIleAsnIle450455<210>5<211>455<212>PRT<213>魚腥藻脂肪氧合酶N130D/G260Q突變體氨基酸序列<400>5GlyValSerGlyAlaLeuValHisTyrPheGlySerIleValArgAla151015GluArgThrGlnTyrLeuTyrGlySerLysAspAspLeuProGlyLys202530ProValTyrPheProLeuProValThrGluIleProSerLysArgPhe354045LeuPheLeuLeuGluLysTyrAsnPheLeuThrAspAsnSerTyrPro505560SerAspGlyGluHisAspLysIleGluAlaLeuValSerAlaMetPro65707580ThrThrAlaLeuAspLeuAlaValGlyThrThrAspProThrAspIle859095ProAspSerTyrPheLeuGluArgArgLeuAsnGlyTyrAsnProGly100105110AlaIleArgGluSerSerGlyGlnGluGlyTrpThrHisGluLeuThr115120125HisAspLeuAlaLysTyrAspIleLysProGlyLeuHisPheProAsp130135140PheValGlnCysArgLeuPheValAspLysGlnAsnGlyValLysLeu145150155160HisSerIleLysIleAspAspHisGluIleThrProCysGlnGluGln165170175TrpGlnTyrAlaLysArgThrTyrLeuGlnAlaGluPheLeuSerGln180185190GluLeuLysLeuHisLeuAlaArgCysHisPheAsnIleGluGlnTyr195200205ValMetAlaIleLysArgArgLeuAlaProThrHisProValArgAla210215220PheIleAsnProHisLeuGluGlyLeuIlePheIleAsnSerSerAla225230235240ValProLysIleIleGlySerThrGlyPheIleProIleAlaSerMet245250255LeuThrGlnGlnSerIleValAspValMetLy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