本發(fā)明涉及生物制品純化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法。

背景技術(shù)：

豬圓環(huán)病毒(PCV)是目前已知的最小的病毒之一，CAP蛋白是PCV2的主要抗原，能誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。目前，流行病學(xué)調(diào)查顯示，PCV2已經(jīng)在世界范圍內(nèi)廣泛分布，規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)幾乎沒(méi)有血清陰性的豬。自PMWS首次在加拿大爆發(fā)至今，全世界五大洲均診斷出PMWS的感染，對(duì)大多數(shù)養(yǎng)豬國(guó)造成了極大的威脅。

由于防治PCV2的重要性，有關(guān)PCV2疫苗的制備成為生物制品研發(fā)的熱點(diǎn)之一。PCV2亞單位基因工程疫苗通過(guò)原核或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PCV2的結(jié)構(gòu)蛋白CAP，再以此來(lái)制備PCV2的病毒樣顆粒(Virus like particles,VLP)。該VLP不含有病毒核酸，卻具有與病毒相似的衣殼結(jié)構(gòu)，能夠作為抗原誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答，進(jìn)而產(chǎn)生抗體。目前，對(duì)于病毒樣顆粒的純化方案通常是沉淀法、離心法和透析法等，但是存在步驟復(fù)雜繁瑣，成本較高，純化效率低等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)病毒樣顆粒的純化方法效率較低的技術(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)病毒樣顆粒的純化方法在達(dá)到所需的純度水平時(shí)步驟較為繁瑣。

本發(fā)明要解決的再一技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)病毒樣顆粒的純化方法對(duì)特定結(jié)構(gòu)的病毒樣顆粒藝針對(duì)性不強(qiáng)、純化效果不佳、

為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，包括以下步驟：

1)取PCV2病毒培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞，得到細(xì)胞裂解液；

2)取步驟1)所得的細(xì)胞裂解液澄清處理，得到病毒澄清液；

3)取步驟2)所得的病毒澄清液濃縮8～12倍，得到病毒濃縮液；

4)取步驟3)所得的病毒濃縮液利用Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)純化，純化過(guò)程中，先通過(guò)蠕動(dòng)泵以1.56πr²ml/min的流速利用0.9～1.1mol/L PBS溶液進(jìn)行柱平衡至紫外蛋白檢測(cè)儀OD₂₈₀基線平穩(wěn)，而后取步驟3)所得的病毒濃縮液上樣，上樣結(jié)束后利用0.9～1.1mol/L PBS溶液洗脫，收集紫外蛋白檢測(cè)儀OD₂₈₀的第一洗脫峰；

其中r是層析柱半徑，單位是厘米。

作為優(yōu)選，步驟4)純化之前先用無(wú)菌的0.5mol/L的NaOH溶液對(duì)Sepharose4FF分子篩層析純化系統(tǒng)進(jìn)行循環(huán)沖洗20～30min，再用無(wú)菌1mol/L PBS對(duì)其進(jìn)行循環(huán)沖洗，至PH為6.8～7.2。

作為優(yōu)選，步驟1)具體包括以下操作：取PCV2病毒培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，固液分離取沉淀，利用PBS溶液洗滌3次，棄去上清，加入細(xì)胞裂解液裂解，固液分離取沉淀，加入細(xì)胞裂解液重懸浮，而后超聲波處理。

作為優(yōu)選，步驟1)所述的固液分離均是在4℃條件下以9500r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。

作為優(yōu)選，步驟1)中所述加入細(xì)胞裂解液裂解是：加入4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，用槍頭吹吸混勻后，冰浴20min。

作為優(yōu)選，步驟1)所述超聲處理是以振幅為25％的超聲波每次處理10s，每?jī)纱翁幚碇g的時(shí)間間隔30s，超聲處理的總時(shí)間為30min。

作為優(yōu)選，步驟2)所述澄清處理是利用孔徑為0.5～0.8μm的濾板實(shí)現(xiàn)的。

作為優(yōu)選，步驟2)中，先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡濾板5min，而后用1mol/L無(wú)菌PBS溶液洗滌至PH為7.0，再澄清處理步驟1)所得的細(xì)胞裂解液。

作為優(yōu)選，步驟3)中對(duì)病毒澄清液的濃縮是利用孔徑為100KD的中空纖維濾膜實(shí)現(xiàn)的。

作為優(yōu)選，步驟3)中先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡中空纖維濾膜20～30min，而后用1mol/L無(wú)菌PBS溶液洗滌至PH為7.0，再濃縮處理步驟2)所得的病毒澄清液。

作為優(yōu)選，以上技術(shù)方案中所述PCV2病毒培養(yǎng)液是通過(guò)中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN105087606A所披露的方法制備的。

本發(fā)明提供了一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，該方法圍繞PCV2病毒樣顆粒的自身特性和其表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)手段開(kāi)發(fā)了全新的純化方法，該方法先綜合利用凍融和超聲處理手段實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的裂解，而后利用濾板模塊去除大量細(xì)胞碎片和大分子雜質(zhì)，獲得無(wú)菌澄清液，再利用100kD的中空纖維膜系統(tǒng)將澄清液濃縮，獲得濃縮的病毒抗原溶液，最后利用Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)以?xún)?yōu)化的操作條件層析純化。本發(fā)明方法密切針對(duì)豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的特征設(shè)計(jì)，尤其適用于重組桿狀病毒PCV2病毒樣顆粒的純化。本發(fā)明可以更高效的去除雜質(zhì)，分離獲得目的蛋白，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)抗原的有效回收。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例中豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白天然表達(dá)基因與修飾后的基因核苷酸序列對(duì)照?qǐng)D；圖中，Optimized字樣代表修飾后的基因序列，Original字樣代表豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白天然表達(dá)基因序列，二者序列存在差異的部分通過(guò)陰影表示。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例中重組桿狀病毒pOET3-CAP的PCR結(jié)果；圖中，M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為PCV2全基因擴(kuò)增產(chǎn)物，2為重組桿狀病毒pOET3-CAP上清擴(kuò)增產(chǎn)物，3為重組桿狀病毒pOET3-CAP沉淀擴(kuò)增產(chǎn)物，4為sf9細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物，5為ddH₂O擴(kuò)增產(chǎn)物。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE鑒定結(jié)果；圖中M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為重組桿狀病毒上清，2為重組桿狀病毒沉淀。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例中表達(dá)產(chǎn)物的Western-Blot鑒定結(jié)果；圖中M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為重組桿狀病毒上清，2為重組桿狀病毒沉淀。

圖5本發(fā)明實(shí)施例中表達(dá)產(chǎn)物的間接免疫熒光鑒定圖；圖中，A為重組桿狀病毒pOET3-CAP感染sf9細(xì)胞48h(200×)，B為正常sf9細(xì)胞培養(yǎng)120h(200×)。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例中表達(dá)產(chǎn)物的Capto Core 700層析色譜圖：圖中峰一為目的峰，峰二為雜質(zhì)峰。

圖7為本發(fā)明實(shí)施例中表達(dá)產(chǎn)物的各純化樣品SDS-PAGE鑒定結(jié)果：圖中M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為PCV2-CAP-P2桿毒(陽(yáng)性對(duì)照)，2為PCV2-CAP-P3桿毒70KD過(guò)濾液，3為PCV2-CAP-P3桿毒70KD過(guò)濾濾膜沖洗液，4為PCV2-CAP-P3桿毒5KD濃縮液，5為PCV2-CAP-P3桿毒5KD過(guò)膜包的穿透液。

圖8為本發(fā)明實(shí)施例中表達(dá)產(chǎn)物的各純化樣品Western-Blot鑒定結(jié)果：圖中M為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，1為PCV2-CAP-P2桿毒(陽(yáng)性對(duì)照)，2為PCV2-CAP-P3桿毒70KD過(guò)濾液，3為PCV2-CAP-P3桿毒70KD過(guò)濾濾膜沖洗液，4為PCV2-CAP-P3桿毒5KD濃縮液，5為PCV2-CAP-P3桿毒5KD過(guò)膜包的穿透液。

圖9為本發(fā)明實(shí)施例中表達(dá)產(chǎn)物的Sepharose 4FF分子篩層析色譜圖：圖中峰一為目的峰，峰二為雜質(zhì)峰。

具體實(shí)施方式

以下將對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過(guò)多不必要的細(xì)節(jié)，在以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。

以下實(shí)施例中所使用的近似性語(yǔ)言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數(shù)量有一定的變動(dòng)。因此，用“大約”、“左右”等語(yǔ)言所修正的數(shù)值不限于該準(zhǔn)確數(shù)值本身。在一些實(shí)施例中，“大約”表示允許其修正的數(shù)值在正負(fù)百分之十(10％)的范圍內(nèi)變化，比如，“大約100”表示的可以是90到110之間的任何數(shù)值。此外，在“大約第一數(shù)值到第二數(shù)值”的表述中，大約同時(shí)修正第一和第二數(shù)值兩個(gè)數(shù)值。在某些情況下，近似性語(yǔ)言可能與測(cè)量?jī)x器的精度有關(guān)。

除有定義外，以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。

以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)生化試劑；所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值；以下實(shí)施例中的％，如無(wú)特別說(shuō)明，均為質(zhì)量百分含量。

實(shí)施例1人工修飾PCV2CAP基因的重組桿狀病毒的獲得

在保持氨基酸不變的前提下，將密碼子改造為桿狀病毒偏嗜密碼子，提高表達(dá)量。進(jìn)行密碼子優(yōu)化時(shí)，優(yōu)先選擇昆蟲(chóng)細(xì)胞使用頻率最高的密碼子。以PCV2b分離株CAP基因序列(GenBank No.EU257511.1)為原始模板，根據(jù)密碼子的偏愛(ài)性人工合成PCV2CAP基因的序列，修飾后的基因序列如SEQ ID NO2所示，修飾前后的基因序列對(duì)比情況如附圖1所示。以上修飾前后基因所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。

人工修飾后的PCV2CAP基因片段克隆至pUC57載體，通過(guò)BamHI及XhoI雙酶切，回收大量目的基因，再克隆至桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pOET3中，構(gòu)建載體pOET3-PCV2-CAP。將該重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得大量pOET3-PCV2-CAP質(zhì)粒。

按照f(shuō)lashBAC系統(tǒng)操作說(shuō)明書(shū)，在sf9細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pOET3-PCV2-CAP質(zhì)粒，獲得重組桿狀病毒pOET3-PCV2-CAP。

實(shí)施例2重組桿狀病毒PCV2的鑒定

1PCR鑒定

提取P1代桿狀病毒DNA(提取步驟按照天根病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，用引物PCV2-CAP-S/A經(jīng)PCR擴(kuò)增CAP基因，以鑒定外源基因是否整合入重組桿狀病毒基因組中。

2SDS-PAGE檢測(cè)Cap蛋白的表達(dá)

準(zhǔn)備100～200mL的處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞活性良好的sf9細(xì)胞，細(xì)胞密度2×106cells/mL。無(wú)菌接種最多0.5mL的桿狀病毒到細(xì)胞中，擴(kuò)增一般需要4～5天。收獲病毒，3000rmp4℃離心15min，無(wú)菌收獲桿毒避光保存于4℃。將收獲的重組桿狀病毒離心，分離上清及沉淀，沉淀用適量體積的PBS重懸，分別上樣。以正常細(xì)胞作為空白對(duì)照。根據(jù)目的蛋白的分子量(目的蛋白大小：27.8KD)，配制12％分離膠，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳完成后考馬斯亮藍(lán)染色2h～3h，取出，浸入脫色液中脫色至條帶清晰無(wú)雜帶。掃圖后分析。

3Western-blot檢測(cè)Cap蛋白的表達(dá)

將收獲的重組桿狀病毒離心，分離上清及沉淀，沉淀用適量體積的PBS重懸，分別上樣。以正常細(xì)胞作為空白對(duì)照，然后電泳并轉(zhuǎn)印。將轉(zhuǎn)印的硝酸纖維素膜完全浸沒(méi)封閉液(5％的脫脂乳)中室溫封閉2h～3h。一抗4℃孵育過(guò)夜，PBS洗膜3次。用山羊抗小鼠IgG(H+L)為二抗室溫孵育≤1h。PBST洗膜3次。BSA加到膜上后反應(yīng)顯影，顯色后觀察結(jié)果。

4IFA鑒定

在感染當(dāng)天，準(zhǔn)備細(xì)胞密度為5×105cells/ml的細(xì)胞懸液，將1mL細(xì)胞懸液加入到6孔板中，室溫孵育1h，顯微鏡觀察細(xì)胞，sf9細(xì)胞應(yīng)該覆蓋約50％面積。棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，將合適稀釋度的病毒液加入6孔板中，孵育1h(或孵育過(guò)夜)，培養(yǎng)基孵育作為陰性對(duì)照。棄去病毒液，每孔中加入2mL培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。感染后48h(檢測(cè)蛋白表達(dá)的最佳時(shí)段)，進(jìn)行間接免疫熒光。棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔加入0.5mL冰甲醇(-20℃)固定10min。棄去固定液，自然干燥10min，PBS洗三遍，每遍5min。0.1％的Triton室溫孵育10min，PBS洗三遍，每遍5min。5％BSA 37℃封閉30min。棄上清。加入1:1000稀釋的一抗，37℃孵育45min(或4℃孵育過(guò)夜)，PBS洗三遍，每遍5min。加入1:1000稀釋的二抗(FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG)，37℃孵育≤1h。PBS洗三遍，每遍5min。每孔加入0.5mL PBS，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，可以檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào)，空白細(xì)胞則為陰性。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，感染細(xì)胞可觀察到強(qiáng)烈的熒光，而正常sf9細(xì)胞沒(méi)有熒光信號(hào)，表明重組桿狀病毒能表達(dá)Cap蛋白且具有很好的免疫活性。

實(shí)施例3重組桿狀病毒PCV2的純化

一初純

將重組桿狀病毒PCV2毒液9500rpm 4℃離心30min，分離上清，用PBS重懸沉淀，將沉淀反復(fù)凍融3次后用均質(zhì)機(jī)破碎細(xì)胞，9500rpm 4℃離心30min，收集上清。調(diào)整樣品的PH至7.5，將上清過(guò)0.45μm的濾器，濾液用作過(guò)柱樣品。

二精細(xì)純化

1裝柱：按照說(shuō)明書(shū)推薦比例，在柱高10cm的柱子內(nèi)裝填10ml Capto Core700填料，約為柱體積一半。

2水洗：用一個(gè)柱子體積(1CV)的蒸餾水清洗柱子。流速約為1.6ml/min

3平衡：用至少5CV的緩沖液平衡柱子或等到UV基線、PH和導(dǎo)電性都穩(wěn)定。

4上樣：裝填不到200ml的樣品過(guò)柱。收集每一個(gè)流穿峰。

5洗脫：用5到20CV的緩沖液洗柱子。

6清洗：用含有1M NaOH的30％異丙醇或27％丙醇反向清洗柱子。

平衡：用5到20CV的緩沖液平衡柱子或等到UV基線、PH和導(dǎo)電性都達(dá)到需要值。

實(shí)施例4重組桿狀病毒PCV2的純化

一裂解

將重組桿狀病毒PCV2毒液反復(fù)凍融3次，置于離心管中，9500rpm 4℃離心20min，PBS洗滌3次，棄去上清。在沉淀的細(xì)胞泥中加入適量4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，用槍頭吹吸混勻后，冰上作用20min。4℃9500r/min離心20min，棄去上清。加入適量4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，重懸沉淀，然后超聲(振幅25％)處理，每次10s間隔30s，超聲30min。

二澄清

將濾板模塊CH ST110(P)(0.5-0.8μm)裝入簡(jiǎn)易裝置中，組裝完畢后用無(wú)菌0.5mol/L NaOH溶液對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行浸泡處理5min。用無(wú)菌1mol/L PBS溶液對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行循環(huán)沖洗，洗去殘余的溶液，直至PH為7.0左右。將重組桿狀病毒PCV2CAP毒液通過(guò)上述濾板，去除大量細(xì)胞碎片和大分子雜質(zhì)，獲得無(wú)菌澄清液。

三濃縮

用無(wú)菌0.5mol/L NaOH溶液對(duì)100kD中空纖維膜系統(tǒng)進(jìn)行浸泡處理至少20min。用無(wú)菌1mol/L PBS對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行循環(huán)沖洗，洗去殘余的溶液，直至PH為7.0左右。取濾板過(guò)濾液通過(guò)100kD中空纖維膜進(jìn)行純化處理，將毒液濃縮10倍，分別留存濃縮液及透過(guò)液，準(zhǔn)備檢測(cè)。

四層析純化

用無(wú)菌0.5mol/L NaOH溶液對(duì)Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)進(jìn)行循環(huán)沖洗20～30min。用無(wú)菌1mol/L PBS對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行循環(huán)沖洗，洗去殘余的溶液，直至PH為7.0左右。

將層析柱進(jìn)液管連接至蠕動(dòng)泵，出液管連接至紫外蛋白檢測(cè)儀(可連接電腦采集數(shù)據(jù)或記錄儀進(jìn)行記錄)。開(kāi)啟蠕動(dòng)泵設(shè)置流速v＝1.56πr2ml/min(r表示層析柱半徑)，用1mol/L PBS進(jìn)行柱平衡直至紫外檢測(cè)OD280基線平穩(wěn)，暫停蠕動(dòng)泵。將蠕動(dòng)泵進(jìn)液管插入抗原濃縮液中啟動(dòng)蠕動(dòng)泵開(kāi)始上樣。上樣結(jié)束后暫停蠕動(dòng)泵，將其進(jìn)液管移入無(wú)菌1mol/L PBS中啟動(dòng)蠕動(dòng)泵進(jìn)行洗脫。紫外檢測(cè)OD280值增加時(shí)開(kāi)始收集第一洗脫峰，OD280值降至最低時(shí)停止收集。繼續(xù)洗脫層析柱至抗原液全部流出柱體，進(jìn)行下一次上樣。

五純化樣品的測(cè)定

對(duì)各階段純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE、Western-blot檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，實(shí)施例4的純化工藝經(jīng)過(guò)裂解、澄清、濃縮和層析純化的工藝流程，可以更高效的去除雜質(zhì)，分離出目的蛋白，達(dá)到有效回收目的抗原地目的，提供了一種針對(duì)重組桿狀病毒PCV2的純化方法。

實(shí)施例5

一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，包括以下步驟：

1)取PCV2病毒培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞，得到細(xì)胞裂解液；

2)取步驟1)所得的細(xì)胞裂解液澄清處理，得到病毒澄清液；

3)取步驟2)所得的病毒澄清液濃縮8倍，得到病毒濃縮液；

4)取步驟3)所得的病毒濃縮液利用Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)純化，純化過(guò)程中，先通過(guò)蠕動(dòng)泵以1.56πr²ml/min的流速利用0.9mol/L PBS溶液進(jìn)行柱平衡至紫外蛋白檢測(cè)儀OD₂₈₀基線平穩(wěn)，而后取步驟3)所得的病毒濃縮液上樣，上樣結(jié)束后利用0.9mol/L PBS溶液洗脫，收集紫外蛋白檢測(cè)儀OD₂₈₀的第一洗脫峰；

其中r是層析柱半徑，單位是厘米。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿(mǎn)足以下條件：

步驟4)純化之前先用無(wú)菌的0.5mol/L的NaOH溶液對(duì)Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)進(jìn)行循環(huán)沖洗20min，再用無(wú)菌1mol/L PBS對(duì)其進(jìn)行循環(huán)沖洗，至PH為6.8。

步驟1)具體包括以下操作：取PCV2病毒培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，固液分離取沉淀，利用PBS溶液洗滌3次，棄去上清，加入細(xì)胞裂解液裂解，固液分離取沉淀，加入細(xì)胞裂解液重懸浮，而后超聲波處理。

步驟1)所述的固液分離均是在4℃條件下以9500r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。

步驟1)中所述加入細(xì)胞裂解液裂解是：加入4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，用槍頭吹吸混勻后，冰浴20min。

步驟1)所述超聲處理是以振幅為25％的超聲波每次處理10s，每?jī)纱翁幚碇g的時(shí)間間隔30s，超聲處理的總時(shí)間為30min。

步驟2)所述澄清處理是利用孔徑為0.5μm的濾板實(shí)現(xiàn)的。

步驟2)中，先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡濾板5min，而后用1mol/L無(wú)菌PBS溶液洗滌至PH為7.0，再澄清處理步驟1)所得的細(xì)胞裂解液。

步驟3)中對(duì)病毒澄清液的濃縮是利用孔徑為100KD的中空纖維濾膜實(shí)現(xiàn)的。

步驟3)中先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡中空纖維濾膜20min，而后用1mol/L無(wú)菌PBS溶液洗滌至PH為7.0，再濃縮處理步驟2)所得的病毒澄清液。

實(shí)施例6

一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，包括以下步驟：

1)取PCV2病毒培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞，得到細(xì)胞裂解液；

2)取步驟1)所得的細(xì)胞裂解液澄清處理，得到病毒澄清液；

3)取步驟2)所得的病毒澄清液濃縮12倍，得到病毒濃縮液；

4)取步驟3)所得的病毒濃縮液利用Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)純化，純化過(guò)程中，先通過(guò)蠕動(dòng)泵以1.56πr²ml/min的流速利用1.1mol/L PBS溶液進(jìn)行柱平衡至紫外蛋白檢測(cè)儀OD₂₈₀基線平穩(wěn)，而后取步驟3)所得的病毒濃縮液上樣，上樣結(jié)束后利用1.1mol/L PBS溶液洗脫，收集紫外蛋白檢測(cè)儀OD₂₈₀的第一洗脫峰；

其中r是層析柱半徑，單位是厘米。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿(mǎn)足以下條件：

步驟4)純化之前先用無(wú)菌的0.5mol/L的NaOH溶液對(duì)Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)進(jìn)行循環(huán)沖洗30min，再用無(wú)菌1mol/L PBS對(duì)其進(jìn)行循環(huán)沖洗，至PH為7.2。

步驟1)具體包括以下操作：取PCV2病毒培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，固液分離取沉淀，利用PBS溶液洗滌3次，棄去上清，加入細(xì)胞裂解液裂解，固液分離取沉淀，加入細(xì)胞裂解液重懸浮，而后超聲波處理。

步驟1)所述的固液分離均是在4℃條件下以9500r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。

步驟1)中所述加入細(xì)胞裂解液裂解是：加入4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，用槍頭吹吸混勻后，冰浴20min。

步驟1)所述超聲處理是以振幅為25％的超聲波每次處理10s，每?jī)纱翁幚碇g的時(shí)間間隔30s，超聲處理的總時(shí)間為30min。

步驟2)所述澄清處理是利用孔徑為0.8μm的濾板實(shí)現(xiàn)的。

步驟2)中，先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡濾板5min，而后用1mol/L無(wú)菌PBS溶液洗滌至PH為7.0，再澄清處理步驟1)所得的細(xì)胞裂解液。

步驟3)中對(duì)病毒澄清液的濃縮是利用孔徑為100KD的中空纖維濾膜實(shí)現(xiàn)的。

步驟3)中先利用0.5mol/L NaOH溶液浸泡中空纖維濾膜30min，而后用1mol/L無(wú)菌PBS溶液洗滌至PH為7.0，再濃縮處理步驟2)所得的病毒澄清液。

實(shí)施例7

一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，包括以下步驟：

1)取PCV2病毒培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞，得到細(xì)胞裂解液；

2)取步驟1)所得的細(xì)胞裂解液澄清處理，得到病毒澄清液；

3)取步驟2)所得的病毒澄清液濃縮10倍，得到病毒濃縮液；

4)取步驟3)所得的病毒濃縮液利用Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)純化，純化過(guò)程中，先通過(guò)蠕動(dòng)泵以1.56πr²ml/min的流速利用1mol/L PBS溶液進(jìn)行柱平衡至紫外蛋白檢測(cè)儀OD₂₈₀基線平穩(wěn)，而后取步驟3)所得的病毒濃縮液上樣，上樣結(jié)束后利用1mol/L PBS溶液洗脫，收集紫外蛋白檢測(cè)儀OD₂₈₀的第一洗脫峰；

其中r是層析柱半徑，單位是厘米。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，滿(mǎn)足以下條件：

步驟4)純化之前先用無(wú)菌的0.5mol/L的NaOH溶液對(duì)Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)進(jìn)行循環(huán)沖洗25min，再用無(wú)菌1mol/L PBS對(duì)其進(jìn)行循環(huán)沖洗，至PH為7。

步驟1)具體包括以下操作：取PCV2病毒培養(yǎng)液，反復(fù)凍融3次，固液分離取沉淀，利用PBS溶液洗滌3次，棄去上清，加入細(xì)胞裂解液裂解，固液分離取沉淀，加入細(xì)胞裂解液重懸浮，而后超聲波處理。

步驟2)所述澄清處理是利用孔徑為0.6μm的濾板實(shí)現(xiàn)的。

步驟3)中對(duì)病毒澄清液的濃縮是利用孔徑為100KD的中空纖維濾膜實(shí)現(xiàn)的。

實(shí)施例8

一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法，包括以下步驟：

1)取PCV2病毒培養(yǎng)液，裂解細(xì)胞，得到細(xì)胞裂解液；

2)取步驟1)所得的細(xì)胞裂解液澄清處理，得到病毒澄清液；

3)取步驟2)所得的病毒澄清液濃縮10倍，得到病毒濃縮液；

4)取步驟3)所得的病毒濃縮液利用Sepharose 4FF分子篩層析純化系統(tǒng)純化，純化過(guò)程中，先通過(guò)蠕動(dòng)泵以1.56πr²ml/min的流速利用1mol/L PBS溶液進(jìn)行柱平衡至紫外蛋白檢測(cè)儀OD₂₈₀基線平穩(wěn)，而后取步驟3)所得的病毒濃縮液上樣，上樣結(jié)束后利用1mol/L PBS溶液洗脫，收集紫外蛋白檢測(cè)儀OD₂₈₀的第一洗脫峰；

其中r是層析柱半徑，單位是厘米。

以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司

<120> 一種豬圓環(huán)病毒2型病毒樣顆粒的純化方法

<160> 2

<210> 1

<211> 708

<212> DNA

<213> 天然序列（豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白天然表達(dá)基因）

<400> 1

ATGACGTATC CAAGGAGGCG TTACCGGAGA AGAAGACACC 40

GCCCCCGCAG CCATCTTGGC CAGATCCTCC GCCGCCGCCC 80

CTGGCTCGTC CACCCCCGCC ACCGTTACCG CTGGAGAAGG 120

AAAAATGGCA TCTTCAACAC CCGCCTCTCC CGCACCTTCG 160

GATATACTAT CAAGCGAACC ACAGTCAAAA CGCCCTCCTG 200

GGCGGTGGAC ATGATGAGAT TCAATATTAA TGACTTTCTT 240

CCCCCAGGAG GGGGCTCAAA CCCCCGCTCT GTGCCCTTTG 280

AATACTACAG AATAAGAAAG GTTAAGGTTG AATTCTGGCC 320

CTGCTCCCCG ATCACCCAGG GTGACAGGGG AGTGGGCTCC 360

AGTGCTGTTA TTCTAGATGA TAACTTTGTA ACAAAGGCCA 400

CAGCCCTCAC CTATGACCCC TATGTAAACT ACTCCTCCCG 440

CCATACCATA ACCCAGCCCT TCTCCTACCA CTCCCGCTAC 480

TTTACCCCCA AACCTGTCCT AGATTCCACT ATTGATTACT 520

TCCAACCAAA CAACAAAAGA AATCAGCTGT GGCTGAGACT 560

ACAAACTGCT GGAAATGTGG ACCACGTAGG CCTCGGCATT 600

GCGTTCGAAA ACAGTATATA CGACCAGGAA TACAATATCC 640

GTGTAACAAT GTATGTACAA TTCAGAGAAT TTAATTTAAA 680

GACCCCCCAC TTAACCCTTA ATGAATAA 708

<210> 2

<211> 708

<212> DNA

<213> 人工序列（修飾后的豬圓環(huán)病毒2型CAP蛋白表達(dá)基因）

<400> 2

ATGACATACC CAAGAAGAAG ATACAGACGC AGAAGACACA 40

GACCCCGTTC GCACCTCGGA CAAATCCTGA GAAGAAGACC 80

GTGGCTCGTG CACCCAAGGC ATAGATACCG CTGGCGCCGT 120

AAGAACGGCA TCTTCAACAC GAGATTGTCT CGCACGTTCG 160

GATACACCAT TAAGCGTACC ACTGTGAAAA CCCCGTCATG 200

GGCTGTCGAC ATGATGAGGT TCAACATCAA CGATTTCCTG 240

CCTCCCGGTG GCGGTTCCAA CCCAAGAAGC GTCCCGTTCG 280

AGTACTACCG TATCAGGAAG GTGAAAGTCG AATTCTGGCC 320

TTGCTCCCCC ATTACTCAGG GTGACCGTGG TGTCGGCTCC 360

AGCGCCGTTA TCCTGGACGA TAACTTCGTT ACCAAGGCTA 400

CTGCCCTCAC ATACGACCCT TACGTGAACT ACTCTTCAAG 440

ACACACAATT ACGCAGCCCT TCAGTTACCA TTCGCGCTAC 480

TTCACTCCAA AGCCGGTCCT CGACAGTACA ATCGATTACT 520

TCCAACCTAA CAACAAACGT AACCAGCTGT GGCTCAGGTT 560

GCAAACTGCA GGCAACGTTG ACCACGTGGG ACTGGGTATC 600

GCGTTCGAGA ACAGCATTTA CGATCAAGAA TACAACATCC 640

GCGTTACAAT GTACGTCCAG TTCAGAGAGT TCAACCTCAA 680

AACCCCCCAC CTCACCCTCA ACGAGTAA 708