本發明涉及一種檢測方法，具體是一種志賀氏菌含量檢測方法。

背景技術：

志賀氏菌屬（Shigella）細菌通稱痢疾桿菌，在引發我國感染性腹瀉病的各原菌所占比例中居首位，是一類具有高度感染性和危害嚴重的革蘭氏陰性腸道致病菌。每年全球有1.6億人因此菌感染患病，約有110萬人死亡，絕大多數為5歲以下兒童。由于生活污水中含有許多病原微生物，例如來自腸道的細菌、病毒、原生動物、寄生蟲等，這些微生物絕大部分都將隨污水處理進入剩余污泥，在污泥的農業土地利用過程中，通過污染地表水、地下水、形成氣溶膠等多種途徑而擴散到環境中。這些隨污泥進入環境中的病原微生物對人體健康和環境安全造成了巨大的潛在威脅，因此，準確快速地檢測污泥中的志賀氏菌，對防止志賀氏菌傳播擴散具有十分重要的意義。志賀氏菌的檢測通常采用食品衛生微生物學檢驗國家標準（GB4789.5–2003），即利用鑒別培養基結合生理生化鑒定。但這種方法應用于污泥樣品檢測時，一方面由于污泥組成復雜、含有大量微生物而對檢測的靈敏度產生干擾，另一方面存在檢測周期長、漏檢率高、程序復雜、所需試劑繁多等缺點。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種志賀氏菌含量檢測方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種志賀氏菌含量檢測方法，包括如下步驟：（1）取含志賀氏菌的待檢樣品，提取基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩5-10min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個稀釋梯度，設5-7個稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個稀釋度設3-5個重復樣，于37℃培養18-24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志賀氏菌增菌肉湯中，37℃培養18-24h；（3）DNA提?。阂迫〔襟E（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩沖液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反復凍融3次，然后10000g離心3min取上清液，完成DNA提??；提取后的DNA短時間內4℃保存，長時間-20℃保存；（4）建立志賀氏菌的實時熒光單引物等溫擴增25μL反應體系：RNA/DNA組合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用滅菌DEPC水補足體系；所述SYBERGreenⅡ為300倍稀釋；將DNA模板、組合引物、Blocker及反應緩沖液的混合液經99℃，90s處理后降溫至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在實時熒光定量PCR儀上58℃反應40min，反應過程中實時監測熒光信號；（5）檢測分析：分析檢測數據。

作為本發明進一步的方案：所述引物選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成為RNA序列，3’端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修飾，中間隨機加上五個XNA修飾。

作為本發明進一步的方案：所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。

作為本發明再進一步的方案：步驟（1）所述提取DNA方法采用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結合商業化試劑盒法。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明方法能克服傳統的微生物培養檢測方法存在的檢測周期長、步驟繁瑣、費時費力等缺點，使檢測時間大大縮短到2-3天，操作步驟和勞動強度也大為縮減，達到省時省力、快速靈敏的要求。

具體實施方式

下面對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。

本發明實施例中，一種志賀氏菌含量檢測方法，包括如下步驟：（1）取含志賀氏菌的待檢樣品，提取基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩5-10min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個稀釋梯度，設5-7個稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個稀釋度設3-5個重復樣，于37℃培養18-24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志賀氏菌增菌肉湯中，37℃培養18-24h；（3）DNA提?。阂迫〔襟E（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩沖液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反復凍融3次，然后10000g離心3min取上清液，完成DNA提??；提取后的DNA短時間內4℃保存，長時間-20℃保存；（4）建立志賀氏菌的實時熒光單引物等溫擴增25μL反應體系：RNA/DNA組合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用滅菌DEPC水補足體系；所述SYBERGreenⅡ為300倍稀釋；將DNA模板、組合引物、Blocker及反應緩沖液的混合液經99℃，90s處理后降溫至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在實時熒光定量PCR儀上58℃反應40min，反應過程中實時監測熒光信號；（5）檢測分析：分析檢測數據。所述引物選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成為RNA序列，3’端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修飾，中間隨機加上五個XNA修飾。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。步驟（1）所述提取DNA方法采用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結合商業化試劑盒法。

實施例1：

本發明志賀氏菌含量檢測方法，包括如下步驟：（1）取含志賀氏菌的待檢樣品，提取基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩5min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個稀釋梯度，設5-7個稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個稀釋度設3個重復樣，于37℃培養18-24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志賀氏菌增菌肉湯中，37℃培養18h；（3）DNA提取：移取步驟（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩沖液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反復凍融3次，然后10000g離心3min取上清液，完成DNA提?。惶崛『蟮腄NA短時間內4℃保存，長時間-20℃保存；（4）建立志賀氏菌的實時熒光單引物等溫擴增25μL反應體系：RNA/DNA組合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用滅菌DEPC水補足體系；所述SYBERGreenⅡ為300倍稀釋；將DNA模板、組合引物、Blocker及反應緩沖液的混合液經99℃，90s處理后降溫至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在實時熒光定量PCR儀上58℃反應40min，反應過程中實時監測熒光信號；（5）檢測分析：分析檢測數據。所述引物選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成為RNA序列，3’端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修飾，中間隨機加上五個XNA修飾。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。步驟（1）所述提取DNA方法采用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結合商業化試劑盒法。

實施例2：

本發明志賀氏菌含量檢測方法，包括如下步驟：（1）取含志賀氏菌的待檢樣品，提取基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩10min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個稀釋梯度，設7個稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個稀釋度設5個重復樣，于37℃培養24h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志賀氏菌增菌肉湯中，37℃培養24h；（3）DNA提?。阂迫〔襟E（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩沖液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反復凍融3次，然后10000g離心3min取上清液，完成DNA提取；提取后的DNA短時間內4℃保存，長時間-20℃保存；（4）建立志賀氏菌的實時熒光單引物等溫擴增25μL反應體系：RNA/DNA組合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用滅菌DEPC水補足體系；所述SYBERGreenⅡ為300倍稀釋；將DNA模板、組合引物、Blocker及反應緩沖液的混合液經99℃，90s處理后降溫至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在實時熒光定量PCR儀上58℃反應40min，反應過程中實時監測熒光信號；（5）檢測分析：分析檢測數據。所述引物選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成為RNA序列，3’端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修飾，中間隨機加上五個XNA修飾。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。步驟（1）所述提取DNA方法采用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結合商業化試劑盒法。

實施例3：

本發明志賀氏菌含量檢測方法，包括如下步驟：（1）取含志賀氏菌的待檢樣品，提取基因組DNA：稱取3g待檢樣品到盛有27mLGN增菌液的50mL的離心管中，渦旋震蕩8min，混合均勻得混合物；取0.5mLGN增菌液稀釋混勻的混合物加入到經過滅菌的4.5mLGN增菌液中得到各個稀釋梯度，設6個稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個稀釋度設3-5個重復樣，于37℃培養20h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養，稱之為菌液；（2）選擇性增菌培養：移取步驟（1）所得各管中菌液0.5mL加入到志賀氏菌增菌肉湯中，37℃培養20h；（3）DNA提取：移取步驟（2）所得各管中菌液2mL加入到10mL離心管中，10000g離心3min，棄去上清液；再加入1mL無菌PBS緩沖液，輕輕吹打均勻，10000g離心3min，棄去上清液；加入10μL超純水，液氮冷凍和沸水浴反復凍融3次，然后10000g離心3min取上清液，完成DNA提取；提取后的DNA短時間內4℃保存，長時間-20℃保存；（4）建立志賀氏菌的實時熒光單引物等溫擴增25μL反應體系：RNA/DNA組合引物5.6μmol/L、Blocker0.36μmol/L、10×BstBuffer2.5μL、BstDNApolymerase20U、10×RNaseHBuffer2.5μL、RNaseH5U、dNTPs0.2mmol/L、MgCl23.5mmol/L、RNaseInhibitor16U、DNA模板1μL、SYBERGreenⅡ0.3μL，其余用滅菌DEPC水補足體系；所述SYBERGreenⅡ為300倍稀釋；將DNA模板、組合引物、Blocker及反應緩沖液的混合液經99℃，90s處理后降溫至60℃，迅速加入RNaseH和BstDNA聚合酶，在實時熒光定量PCR儀上58℃反應40min，反應過程中實時監測熒光信號；（5）檢測分析：分析檢測數據。所述引物選用GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成為RNA序列，3’端12nt合成為DNA序列；Blocker選用TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修飾，中間隨機加上五個XNA修飾。所述IXNA包括A、C、G、T、U或mC六種堿基中的一種。步驟（1）所述提取DNA方法采用普通熱裂解法、蛋白酶K法、飽和酚法或水洗法結合商業化試劑盒法。

對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。