本發明涉及農產品檢測領域，具體地說是涉及一種可以同時富集腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7和單增李斯特菌的共增菌培養基SSEL。

背景技術：

沙門氏菌(Salmonella)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli)和單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是常見的食源性致病菌，它們在食用農產品中存在一定的檢出率，是污染這類食品的主要病原菌，并引發過多次大規模的食物中毒事件。開發食源性致病菌的快速檢測方法，對于及時有效控制食源性疫情的傳播，預防類似事件的發生具有重要意義。

檢測食源性致病菌，首先要選用合適的增菌液對樣品進行16-24h的增菌培養，該過程不僅可以選擇性地富集待檢致病菌抑制背景微生物的生長，還可以使受損的細胞復蘇，進而使樣品中的病原菌濃度達到檢測限，從而提高檢出率，避免漏檢和錯檢。因此，增菌培養是微生物檢測中必不可少的一步，現有的各種微生物快速檢測新技術，例如各種聚合酶鏈式反應(PCR)、基因芯片、酶聯免疫吸附(ELISA)等方法因自身檢測能力的限制(檢測限10²～10⁴)及背景微生物的干擾都不能繞過增菌這一富集過程。并且，針對不同的待檢致病菌，樣品所用的增菌液和選擇性培養基也不同，這種只針對某一特定菌種富集的增菌液很大程度上限制了高通量檢測技術(例如多重PCR和基因芯片檢測技術)的應用，導致了高通量檢測方法難以用于實際樣品的檢測。因此，開發能選擇性富集多種目標致病菌的共增菌培養基，對實現快速高效的共檢技術起到了關鍵作用。

目前國內外關于共增菌培養基的研究包括可用于肉制品的SEL(腸炎沙門氏菌、大腸桿菌O157:H7及單增李斯特菌的共增菌液)和SSL(腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌的共增菌液)；可用于水產品的SVV(沙門氏菌、霍亂弧菌及副溶血弧菌的共增菌液)和SSSV(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌的共增菌液)等。由于每種致病菌都有各自的生長習性，往往用于富集某種細菌的成分會成為其它細菌的生長抑制劑。因此，在開發共增菌培養基時，每增加一種致病菌都要重新考慮營養成分及抑制劑，這是開發共增菌培養基的一個限定條件。目前，還未見到針對食用農產品中常見的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7及單增李斯特菌進行共增菌培養(本專利中標注為SSEL)的報道。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種共增菌培養基SSEL，其由基礎培養基、抑制劑和水組成，各組分的配比和組成如下：

(1)基礎培養基：胰蛋白胨大豆肉湯20～40份，酵母浸膏4～8份；

(2)抑制劑：吖啶黃0.010～0.014份，萘啶酮酸0.0020～0.0030份，去氧膽酸鈉8～12份，氯化鋰13～17份；

(3)水，900～1100份；

上面所說的份數均為重量份數。

優選的一種共增菌培養基SSEL，其由基礎培養基、抑制劑和

水組成，各組分的配比和組成如下：

(1)基礎培養基：胰蛋白胨大豆肉湯30份，酵母浸膏6份；

(2)抑制劑：吖啶黃0.012份，萘啶酮酸0.0025份，去氧膽酸鈉10份，氯化鋰15份；

(3)水，1000份。

本發明的共增菌培養基SSEL是通過如下方法制備的：

分別稱取胰蛋白胨大豆肉湯、酵母浸膏、去氧膽酸鈉、氯化鋰，加水，攪拌均勻；

121℃高壓滅菌，冷卻至室溫；

在上述混合液中，無菌添加吖啶黃和萘啶酮酸，混勻，即制成所需的共增菌培養基(SSEL)，該培養基可立即使用或2～8℃保存。

制備好的共增菌培養基，可將檢測樣品按照1：100的重量比例接入SSEL培養基中，36℃過夜培養16～24h(視樣品污染程度或菌液混濁程度)，即可用于后續進一步檢測。

本發明以腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸O157：H7和單增李斯特菌4種菌為目標菌，研制出可以同時富集這4種菌的選擇性培養基，填補了目前共增菌選擇性培養基在此方面的空白，構建了樣品處理與后續多重PCR等高通量檢測方法之間的橋梁。

與特異性的選擇性增菌液相比，本發明的共增菌液可同時富集腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸O157：H7和單增李斯特菌四種菌，有望于高通量檢測技術聯用，達到同時檢測多種致病菌的目的；與廣譜性增菌液相比，本發明的選擇性增菌液在基礎培養基的基礎上添加了抑菌劑，更好地抑制了非目的菌的生長，避免了雜菌的干擾；同時，該培養基對冷損傷的菌株有一定的修復能力，可以避免亞致死狀態下目標菌的漏檢。

本發明的優點是：

1、可以進行多種致病菌的共培養。

2、理論上不受檢測靈敏度限制。

3、節省待檢樣本數量，并省時省力。

4、檢測樣本廣泛。

附圖說明

圖1為SSEL與商業化增菌液分別對4種目標菌的增菌效果比較。

其中4種商業化增菌液分別為：沙門氏菌RV(1-A)、金黃色葡萄球菌7.5％NaCl肉湯(1-B)、大腸桿菌O157:H7mEC(1-C)和單增李斯特菌FB(1-D)。

圖2為4種目標菌按不同比例接入SSEL后，SSEL對4種菌的富集效果。

其中腸炎沙門氏菌(SA)，金黃色葡萄球菌(LM)，大腸桿菌(O157)，單增李斯特菌(SE)的復合接菌比例分別為：1:1:1:1(2-A)、1:10:100:1000(2-B)、10:1:1000:100(2-C)、100:1000:1:10(2-D)和1000:100:10:1(2-E)。

圖3為SSEL對實際樣本中冷損傷目標菌的修復增菌能力。

包括生菜(市售)中的4種目標菌在4℃貯存2d后，SSEL對目標菌的增菌能力(3-A)和生豬肉(市售)中的4種目標菌在-20℃貯存10.5d(3-B)后，SSEL對目標菌的冷損傷修復能力。

圖4為添加極少量(～10CFU/ml)目標菌到增菌培養液SSEL后，多重PCR檢測4種目標菌的電泳圖。

其中：M：Marker；1：陰性對照；2：單增李斯特菌；3：金黃色葡萄球菌；4：沙門氏菌；5：大腸桿菌O157:H7；6:多重PCR產物

圖5為多重PCR檢測冷凍豬肉(市售)經增菌培養液SSEL培養后目標菌的電泳圖

其中：1：冷凍豬肉多重PCR；2：陽性對照；M：Marker；3：陰性對照

具體實施方式

以下結合附圖通過實施例對本發明做進一步說明。

試劑：胰蛋白胨大豆肉湯(OXOID)；酵母浸膏(OXOID)；去氧膽酸鈉(Sigma)；氯化鋰(Sigma)；吖啶黃(Sigma)；萘啶酮酸(Sigma)；豬肉、生菜(上海市奉賢區南橋鎮百聯超市)；沙門氏菌RV、金黃色葡萄球菌7.5％氯化鈉肉湯、大腸桿菌mEC+n、單增李斯特菌FB(均購于廣東環凱微生物科技有限公司)。

菌株：腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)；金黃色葡萄球菌(ATCC 25913)；大腸桿菌O157:H7；單增李斯特菌(F 2365)；溶菌酶(上海生工有限公司)；引物(上海生工有限公司)。

實施例一：共增菌培養液SSEL的單獨增菌效果驗證

SSEL培養基的制備：分別稱取胰蛋白胨大豆肉湯30份、酵母浸膏6份、去氧膽酸鈉10份、氯化鋰15份，加去離子水1000份，攪拌均勻，121℃高壓滅菌，冷卻至室溫。然后，無菌添加吖啶黃0.012份和萘啶酮酸0.0025份，攪拌均勻，制成SSEL培養基。

SSEL增菌培養：將10¹一10²CFU/mL的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157：H7、單增李斯特菌分別接種至100mL SSEL及各自選擇性增菌液中(沙門氏菌：RV、金黃色葡萄球菌：7.5％氯化鈉肉湯、大腸桿菌O157:H7：mEC+n、單增李斯特菌：FB)中，37℃振蕩培養24h，每4h取一次培養物，用各目標菌選擇性分離培養基計數(圖1)。從圖1可以看出：腸炎沙門氏菌和單增李斯特菌在SSEL中的生長情況與在RV和FB中的相當，由于抑制劑的作用，在SSEL中金黃色葡萄球和O157：H7進入穩定期的時間比在7.5％Nacl肉湯、mEC中長，但經過24h培養，最大菌濃度為10⁸CFU/mL及以上，可滿足快速富集菌體，提取菌體DNA的要求。

實施例二：SSEL復合增菌效果驗證

SSEL培養基的制備：參照實施例一。

SSEL增菌培養：將沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7、單增李斯特菌依次分別按1:1:1:1(10²CFU/mL)、1:10:100:1000(10¹一10⁴CFU/mL)、10:1:1000:100、100:1000:1:10、1000:100:10:1 5種比例混合接種至SSEL中，37℃200rpm振蕩培養24h，每4h取一次培養物，用各目標菌選擇性分離培養基計數(圖2)。從圖2可以看出當四種目標菌接菌量相同時，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、O157：H7及單增李斯特菌在SSEL中生長狀況良好，生長速度、滯后期、穩定期較為相近。當革蘭氏陽性菌接種量低時(SA:LM:O157:SE＝1:10:100:1000、SA:LM:O157:SE＝10:1:1000:100)，陽性菌生長即菌生長速度與接菌量成正相關。金黃色葡萄球菌競爭性最弱，最大菌濃度最小為10⁵CFU/mL，仍能滿足現代生物檢測技術的檢測要求。當革蘭氏陰性菌接種量低時(SA:LM:O157:SE＝100:1000:1:10、SA:LM:O157:SE＝1000:100:10:1)，革蘭氏陰性菌適應性良好經過16h培養，沙門氏菌、O157：H7最大菌濃度在10⁷CFU/mL以上。

實施例三：SSEL對冷傷目標菌的修復能力驗證

SSEL培養基的制備：參照實施例一。

待檢樣品的處理：取市售生豬肉、生菜各10g，經酒精浸泡消毒風干后，分別接種腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)，金黃色葡萄球菌(ATCC 25913)，大腸感覺O157:H7，單增李斯特菌(F 2365)，終濃度均為10CFU/g左右，風干至菌液完全吸收。生菜樣品于4℃冰箱中保藏2天。豬肉樣品于-20℃冰箱中保藏10.5天。

SSEL增菌培養：將上述人工污染的豬肉、生菜樣品10g置于90ml SSEL中，36℃靜置培養24h。每4h取一次培養物，用各目標菌選擇性分離培養基計數(圖3)。從圖3可以看出：經過SSEL培養，可有效修復4℃冷藏了2d的生菜和-20℃冷凍了10.5d的豬肉中的目標菌，使腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、O157：H7及單增李斯特菌的菌體濃度能達到10⁶CFU/mL。

實施例四：SSEL結合多重PCR快速檢測4種食源性致病菌

SSEL培養基的制備：參照實施例一。

SSEL增菌培養：分別取腸炎沙門氏菌，金黃色葡萄球菌，大腸O157:H7，單增李斯特菌過夜培養的新鮮菌液于100ml SSEL中，菌液的終濃度約為10CFU/ml，36℃180rpm培養24h。

檢測模板的準備：取1ml 24h培養的增菌液，12000rpm離心30s，棄上清，加溶菌酶(10mg/ml)100μl，37℃孵育1h；每管加356μl TE，混勻；加入53μl SDS(10％)，68℃水浴15min；加入87μl NaCl(1％)和69μl CTAB(1％)，68℃水浴15min；加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)混勻，12000rpm離心15min，取上清于新的離心管內；加入氯仿：異戊醇(24:1)混勻，12000rpm離心5min，取上清于新的離心管內；加入2倍體積的冰無水乙醇，-20℃放置2h，12000rpm，離心10min；棄上清，加70％乙醇洗滌(12000rpm離心5min)；棄上清，風干，加50μl RNaseA(20μg/ml)無菌水溶解，于分光光度計測定濃度后，置于-20℃保存。

多重PCR檢測：選擇沙門氏菌invA基因、金黃色葡萄球菌ileS基因、大腸桿菌O157:H7rfbE基因和單增李斯特菌hly基因，利用Primer V5.0和Oligo V6.22軟件進行引物的評價和篩選，4種目標菌的上下游引物序列分別為：TTCTCTTGGCGCCCACAATGCGAG與TCCATCAGCAAGGTAGCAGTC(沙門氏菌)；CATACAGCACCAGGTCACGGGGAA與GTTCTCCAGTCGTGTGGATAGC(金黃色葡萄球菌)；AACGGTTGCTCTTCATTTAG與GAGACCATCCAATAAGTGTG(大腸桿菌O157:H7)；GGTTTAGCTTGGGAATGGTG與GATAAAGCGTAGTGCCCCAG(單增李斯特菌)。PCR擴增體系為50μl，包含2×Taq PCR MasterMix 25μL、上下游引物各1μL、模板4μL，加dd H₂O補足至50μL。反應條件如下：94℃30min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，擴增35循環；72℃延伸10min。PCR產物用2.0％瓊脂糖進行電泳(圖4)，結果顯示SSEL可聯合多重PCR用于多種菌的快速高效檢測。

實施例五：SSEL結合多重PCR快速檢測冷凍豬肉(市售)中的4種食源性致病菌

SSEL培養基的制備：參照實施例一。

待檢樣品的處理：取市售生豬肉10g，豬肉經酒精浸泡消毒風干后，分別接種腸炎沙門氏菌(ATCC 13076)，金黃色葡萄球菌(ATCC 25913)，大腸O157:H7，單增李斯特菌(F 2365)，終濃度均為10CFU/g左右，風干至菌液完全吸收，置均質袋中于-20℃保存7天。

SSEL增菌培養：將人工污染的豬肉(市售)樣品10g置于90ml SSEL中，36℃靜置培養24h。

檢測模板的準備：取1ml 24h培養的增菌液，12000rpm離心30s，加入等體積TE緩沖液懸浮清洗菌體，1 2000rpm離心30s后棄上清，再加入450ml TE緩沖液，40μl 20μg/μl蛋白酶K、50μl 20μg/μl溶菌酶(上海生工)，37℃孵育30min，水煮30min后12000rpm離心1min，取上清液作為模板。

多重PCR檢測：參照實施例四。經人工污染生豬肉(市售)檢測證實(圖5)，SSEL可聯合多重PCR實現4種食源性致病菌在冷凍豬肉樣品中的共檢測。

以上所述僅為本發明的優選實施例，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人員來說，本發明可以有更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、改進等，均應包括在本發明的保護范圍之內。