本發明涉及生物技術領域，具體地說涉及一種應用吸附柱層析法來制備收率高的硫酸魚精蛋白的方法。
背景技術：
硫酸魚精蛋白（Ulinastatin）：1868年，Miescher從魚精子頭部細胞核內發現一種含氮的堿性物質命名為魚精蛋白（protamine）。其三分之二由精氨酸組成，帶大量正電荷，生物學作用是同帶負電的核酸磷酸鹽基團結合。1936年，Hagedorn等人應用魚精蛋白加胰島素皮下注射延長后者的吸收。選擇魚精蛋白是因為它的堿性PH值能夠使胰島素處于離子化狀態，從而延緩吸收。1937年首先提出魚精蛋白能中和強酸性的肝素，以后作為肝素拮抗劑應用于體外循環(CPB)結束后和外科肝素化病人。近年來，隨著CPB心內直視手術和冠狀動脈一主動脈搭橋術(CABG)的廣泛開展，魚精蛋白的使用日益增多，國內外專家對魚精蛋白的藥理作用和臨床應用也做了大量研究工作。在體外循環手術中, 魚精蛋白是一種無法替代的肝素中和劑。
魚精蛋白，是一類存在于各類雄性動物成熟精巢組織中的多聚陽離子肽，主要存在魚類(如鮭魚、虹鱒魚、鯡魚等)成熟精子細胞核中，以核精蛋白的形式存在，且與DNA結合緊密。魚精蛋白是一種小而簡單的球形堿性蛋白，能溶于水或稀酸中，但可被稀氨水沉淀。魚精蛋白加熱不易凝固且較為穩定。魚精蛋白在魚類精巢中的含量極不穩定，隨性腺的成熟度而變化很大。
魚精蛋白的結構也因魚種不同而有差異，但是它們存在許多相似的特征，如N．端均為精氨酸或者丙氨酸，各種魚精蛋白分子肽鏈中都含有4個較長的和2個較短的精氨酸簇，并且分別被特征性的殘基Ser或Thr，Pro．Ile，Gly．Gly或Val-Val分隔開。
根據堿性氨基酸組成種類和數量的不同，可以將魚精蛋白分為單魚精蛋白 ( monoprotamine)、雙魚 精 蛋 白 ( diprotamine ) 和 三 魚 精 蛋 白( triprotamine) 3 種。其中，單魚精蛋白僅含一種組分精氨酸，如鮭、鯡和虹鱒精蛋白等; 雙魚精蛋白含有精氨酸、組氨酸或賴氨酸，如鯉精蛋白; 三魚精蛋白含有 3 種堿性氨基酸，如鰱、鱘精蛋白。然而魚精蛋白并不是單一組分，它們是通常由數種成分組成的混合物，如鯡魚精蛋白經離子交換層析后分離出 3 種成分，且成分之間彼此非常相似，而紅鱒魚精蛋白則由 6 種差別極小的成分組成。不同魚種魚精蛋白在氨基酸組成比例上有很大的差別，但是它們存在很多相似的特征。Yoshiko 研究了 12 種魚類的魚精蛋白結構，發現這 12 種魚精蛋白的 N-末端均為精氨酸或丙氨酸，且均含有 4 個較長的和 2個較短的精氨酸簇，分別被 Thr 或 Ser、Gly-Gly、Pro-Ile 或 Val-Val 特征性殘基分隔開。
技術實現要素：
本發明提供了一種吸附柱層析純化硫酸魚精蛋白的方法，是為了攻克耐酸性混合模式吸附等傳統方法提取硫酸魚精蛋白收率過低的缺點，采用吸附柱層析來純化硫酸魚精蛋白，從而提高硫酸魚精蛋白收率。
為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案予以實現：
一種吸附柱層析純化硫酸魚精蛋白的方法，其特征在于：選用樹脂吸附、特異洗脫液解吸來純化硫酸魚精蛋白，可以將總收率提高到80%以上。
在發明技術方案中，還具有以下技術特征：所述吸附柱層析包括如下步驟：
1）硫酸魚精蛋白粗加工
稱取1T pH小于6.5的澄清魚白，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質吸附完全后用氨水洗脫，再經過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得硫酸魚精蛋白粗品。
2）吸附柱層析工序（以0.25L柱體為例）
2.1）稱取硫酸魚精蛋白粗品1kg，用洗脫液 A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；
2.2）陰離子交換柱用洗脫液 B平衡，將上述離心液流經平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120~130ml/min左右；
2.3）用洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120~130ml/min，得洗脫液；
2.4）將洗脫液經超濾膜，加入磷酸鹽緩沖液反復超濾,超濾至其體積的二十分之一，得超濾液。
3）沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
4）凍干
將沉淀物裝入盤進凍干機，凍干即得硫酸魚精蛋白。
與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是：
選用吸附柱層析純化硫酸魚精蛋白,可以更有效的去除其中的多種雜蛋白，并且使其理化性質和生物活性保持穩定，從而使產品的各項指標均符合中國藥典標準。更重要的是，通過工藝的不斷改進和完善，使得硫酸魚精蛋白總收率達到80%以上，帶來巨大的經濟效益和社會效益。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，而不以任何方式限制。
實施例1
1）硫酸魚精蛋白粗加工
稱取1T pH小于6.5的魚白，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質, 并用精密pH試紙測定，調節魚白pH到6.0；吸附完全后用氨水洗脫1h，再經過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于置用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得硫酸魚精蛋白粗品。
2）吸附柱層析工序（以0.25L柱體為例）
2.1）稱取硫酸魚精蛋白粗品1kg，用8.5L的洗脫液 A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；
2.2）陰離子交換柱用2.5L的洗脫液 B平衡，將上述離心液流經平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120ml/min左右；
2.3）用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120ml/min，得洗脫液；
2.4）將洗脫液經超濾膜，加入磷酸鹽緩沖液反復超濾,超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
3）沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
4）凍干
將沉淀物裝入盤進凍干機，凍干即得硫酸魚精蛋白。
實施例2
1）硫酸魚精蛋白粗加工
稱取1T pH小于6.5的魚白，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質, 并用精密pH試紙測定，調節魚白pH到6.0；吸附完全后用氨水洗脫1h，再經過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得硫酸魚精蛋白粗品。
2）吸附柱層析工序（以0.25L柱體為例）
2.1）稱取硫酸魚精蛋白粗品1kg，用8.5L的洗脫液 A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；
2.2）陰離子交換柱用3.0L的洗脫液 B平衡，將上述離心液流經平衡好的陰離子交換柱，流速控制在130ml/min左右；
2.3）用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在130ml/min，得洗脫液；
2.4）將洗脫液經超濾膜，加入磷酸鹽緩沖液反復超濾,超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。
3）沉淀
超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。
4）凍干
將沉淀物裝入盤放進進凍干機，凍干即得硫酸魚精蛋白。
以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發明技術方案的保護范圍。