本發明涉及生物技術領域，具體地說涉及一種應用親和層析法制備收率高、效價穩定的尿激酶的方法。

背景技術：

尿激酶是從健康男尿中分離或從人腎組織培養中獲得的一種酶蛋白。直接作用于內源性纖維蛋白溶解系統，能催化裂解纖溶酶原或纖溶酶。亦能降解血循環中的纖維蛋白原，凝血因子V和凝血因子V3等，從而發揮溶栓作用。對新形成的血栓起效快、效果好，還能提高血管ADP酶活性，抑制ADP誘導的血小板凝聚，預防血栓形成。該品主要用于血栓栓塞性疾病的溶栓治療。包括急性廣泛性肺栓塞、胸痛6—12 小時內的冠狀動脈栓塞和心肌梗死、癥狀短于3—6小時的急性期腦血管栓塞、視網膜動脈栓塞和其他外周動脈栓塞癥狀嚴重的骼-股靜脈血栓形成者。也用于人工心瓣手術后預防血栓形成，保持血管插管和胸腔及心包腔引流管的通暢等。溶栓的療效均需后繼的肝素抗凝加以維持。

但現有技術對其的收率不能達到很高，效價達不到30000 iu/mg，純度不高，對其在臨床的應用有很大的制約。

本發明人自2012年開始對UK的生產工藝進行試驗研究，采用現代蛋白質高端生化分離技術進行生產，使UK的總收率提高到80%以上，總效價不低于40000iu/mg，生產工藝穩定，質量可控。

技術實現要素：

本發明提供了一種親和層析純化尿激酶的方法，是為了攻克高嶺土吸附、耐酸性混合模式吸附等傳統方法提取尿激酶收率過低、效價不高不穩定的缺點，采用親和層析來純化尿激酶，從而提高了尿激酶的收率，保證了效價的穩定。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案予以實現：

一種親和層析純化尿激酶的方法，其特征在于：選用特異樹脂的親和層析來純化尿激酶，可以使總收率提高到80%以上，總效價不低于40000iu/mg。

該技術方案中，還具有以下技術特征：所述親和層析法包括如下步驟：

1 尿激酶粗加工

稱取1T pH在5.5-6.5的澄清男性尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質吸附完全后用氨水洗脫，再經過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得尿激酶粗品。

2 吸附柱層析（以0.25L柱體為例）

2.1稱取尿激酶粗品1kg，用洗脫液 A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；

2.2陰離子交換柱用洗脫液 B平衡，將上述離心液流經平衡好的陰離子交換柱，流速控制在110~140mL/min左右；

2.3用洗脫液B溶液洗脫，流速控制在110~140mL/min，得洗脫液；

2.4將洗脫液經超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。

3 親和層析（以0.25L柱體為例）

3.1用洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經平衡過的樹脂柱，流速控制在110~140mL/min；

3.2上樣結束后，用洗脫液C洗脫，流速110~140mL/min左右，收集洗脫液；

3.3柱中的親和樹脂經洗脫液C 洗脫后，用洗脫液 D洗滌去除吸附在上面的雜質，流速控制在110~140mL/min，密封待用；

3.4洗脫液經超濾膜超濾至一定體積，超濾液中加入一定量磷酸氫二鈉溶液，繼續超濾至同一體積，然后再加入等量磷酸氫二鈉溶液，再經超濾膜超濾至相同體積。

4 沉淀

超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。

5 凍干

將沉淀物裝入盤進凍干機，凍干即得尿激酶。

經核算，所得尿激酶總收率高達80%以上，按中國藥典所示方法測定，總效價高達40000iu/mg以上。

與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是：

選用親和層析純化尿激酶,可以更有效的去除尿激酶中的多種雜蛋白，并且使其理化性質和生物活性保持穩定，從而使產品的各項指標均符合中國藥典標準。更重要的是，通過工藝的不斷改進和完善，使得尿激酶總收率達到80%以上，總效價不低于40000iu/mg，創造了巨大的經濟效益和社會效益。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明作進一步說明，而不以任何方式限制。

實施例1

1 尿激酶粗加工

稱取1T pH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質, 并用精密pH試紙測定，調節尿液pH到6.0；吸附完全后用氨水洗脫1h，再經過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得尿激酶粗品。

2 吸附柱層析（以0.25L柱體為例）

2.1稱取尿激酶粗品1kg，用8.5L的洗脫液 A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；

2.2 陰離子交換柱用2.5L的洗脫液 A平衡，將上述離心液流經平衡好的陰離子交換柱，流速控制在120mL/min左右；

2.3 用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120mL/min，得洗脫液；

2.4 將洗脫液經超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。

3 親和層析（以0.25L柱體為例）

3.1 用3.0L的洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經平衡過的樹脂柱，流速控制在120mL/min；

3.2 上樣結束后，用10L的洗脫液C洗脫，流速120mL/min左右，收集洗脫液；

3.3 柱中的親和樹脂經洗脫液C 洗脫后，用5.0L的洗脫液 D洗滌去除吸附在上面的雜質，流速控制在120mL/min，密封待用；

3.4 洗脫液經超濾膜超濾至170mL，超濾液中加入磷酸氫二鈉溶液830mL，繼續超濾至170mL，然后再加入830mL磷酸氫二鈉溶液，再經超濾膜超濾至170mL。

4 沉淀

超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。

5 凍干

將沉淀物裝入盤進凍干機，凍干即得尿激酶。

經核算，所得尿激酶總收率為84%，按中國藥典所示方法測定，總效價高達48260iu/mg。

實施例2

1 尿激酶粗加工

稱取1T pH5.5-6.5的澄清男性尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質, 并用精密pH試紙測定，調節尿液pH到6.0；吸附完全后用氨水洗脫1h，再經過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得尿激酶粗品。

2 吸附柱層析（以0.25L柱體為例）

2.1 稱取尿激酶粗品1kg，用8.5L的洗脫液 A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液；

2.2 陰離子交換柱用3.0L的洗脫液 A平衡，將上述離心液流經平衡好的樹脂柱，流速控制在130mL/min左右；

2.3 用33L的洗脫液B溶液洗脫，流速控制在130mL/min，得洗脫液；

2.4 將洗脫液經超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。

3 親和層析（以0.25L柱體為例）

3.1 用3.0L的洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經平衡過的樹脂柱，流速控制在130mL/min；

3.2 上樣結束后，用10L的洗脫液C洗脫，流速130mL/min左右，收集洗脫液；

3.3 柱中的親和樹脂經洗脫液C 洗脫后，用7.5L的洗脫液 D洗滌去除吸附在上面的雜質，流速控制在130mL/min，密封待用；

3.4 洗脫液經超濾膜超濾至170mL，超濾液中加入磷酸氫二鈉溶液830mL，繼續超濾至170mL，然后再加入830mL磷酸氫二鈉溶液，再經超濾膜超濾至170mL。

4 沉淀

超濾液中按1:6的比例加入不低95%的乙醇沉淀12小時，離心，固體再用無水乙醇脫水兩次，離心，棄去上清液，留取沉淀物。

5 凍干

將沉淀物裝入盤進凍干機，凍干即得尿激酶。

經核算，所得尿激酶總收率為82%，按中國藥典所示方法測定，總效價高達46300iu/mg。

以上所述，僅是本發明的較佳實施例而已，并非是對本發明作其它形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示的技術內容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發明技術方案內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發明技術方案的保護范圍。