技術領域：

本發明屬于微生物學、生物防治、天然產物化學和藥物學領域，具體涉及三株能捕食和抑制植物病原細菌的粘細菌，以及在制備捕食和抑制植物病原細菌的藥物中的應用。

背景技術：
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植物病害危害農業生產，造成經濟損失，其防治研究具有重要意義。生物防治技術具有不污染環境、對人和其他生物安全性好、防治作用持久、無殘留、對病害的殺傷特異性強、易于同其他防治措施協調配合、節約能源等優點，因而具有廣闊的發展前途。當今世界，人們對環境保護日益重視，對“無公害產品”需求不斷提高，符合農業可持續發展要求的生物防治技術逐漸成為研究熱點和重要方向。

迄今為止，研究者已篩選到大量具有抑制植物病原菌效果的拮抗菌株，包括芽孢桿菌、鏈霉菌、假單胞桿菌、類芽孢桿菌、木霉菌等。這些菌株的主要生防機制是在生長代謝過程中產生多種拮抗病原菌的抗生素類物質、毒素、細菌素、蛋白質類抗菌物質等，達到抑制或殺滅病原菌的效果。由于次級代謝產物的產生受環境因素影響較大，這類拮抗菌株在田間施用時往往面臨防效不穩定、持久性差等問題。

在蟲害或動物病害的生物防治中，利用天敵和捕食關系是主要的生防機制和研究方向，已報道了大量成功案例。微生物中也存在一些捕食者(micropredator)，如lysobacter、bdellovibrio、bacteriovorax、daptobacter、bacteroidetes和myxococcales(粘細菌目)等。

近年來，微生物捕食者及其捕食作用引起了越來越多的關注。學界認為，上述微生物捕食者都是有潛力的生防菌。但是，目前對微生物捕食者在生物防治方面的應用潛力研究并不多。

粘細菌(myxobacteria)可滑行運動，具有復雜多細胞形態發生過程、獨特的細胞間信號傳遞系統、顯著的社會性行為特征。近來，人們逐漸認識到，相比單純的微生物捕食者如bdellovibrio或bacteriovorax，粘細菌在生物防治方面具有更大優勢，因為粘細菌具有多重生防機制。

1.粘細菌是微生物中的捕食者。大多數粘細菌能通過獨特的狼群式群體行為(wolf-pack)和滑行運動來主動捕食其他活的微生物，包括細菌、真菌、酵母、藻類等，用來滿足自身的營養需求。粘細菌的捕食范圍相當廣泛，其對被捕食菌的偏愛性一般體現在很大的分類單位如門和綱的層次，無視同一種細菌的生理分化，具有重要的生物防治意義，有可能解決某些病原菌菌系差異大等防治難題。

2.粘細菌是原核生物中僅次于放線菌的第二大抗生素產生菌，能產生豐富多樣、結構新穎的次級代謝產物，在藥物開發、生物農藥和生態治理等方面具有廣泛的應用潛力。研究認為，能夠產生抗生素等次級代謝產物的微生物都是大有希望的生物防治因子，如芽孢桿菌、鏈霉菌、假單胞桿菌等。最近發現，粘細菌分泌的天然活性產物往往作為捕食工具或武器參與了其捕食過程。

3.粘細菌抗逆性強。粘細菌具有營養細胞和粘孢子(myxospore)兩種形態，在環境條件惡劣時，可以形成抗逆性很強的粘孢子，抵抗營養缺乏、酸堿、干燥、寒冷、炎熱和輻射等外部環境，這使得粘細菌可以在很多極端環境中長期生存。

4.粘細菌偏愛土壤、朽木、樹皮、食草哺乳動物的糞便以及腐爛的地衣等基質，在這些環境中具備良好的穩定性和競爭力。粘細菌是土壤中廣泛分布的土著菌，多樣性和豐度都很高。大量研究表明，是否具有優良的競爭力和定殖力，是生防菌能否長期穩定地發揮生防效果的關鍵。因此，粘細菌強大的定殖能力和抗逆性對生物防治具有巨大優勢。

5.粘細菌能夠控制土壤中其他菌群的數量，維持土壤微生態平衡。研究表明，粘細菌存在于各種生境中，影響著周圍其他細菌的菌落特征。作為微生物捕食者，粘細菌像動物食物鏈中的捕食者一樣，能隨著被捕食者的數量變化而動態變化。土壤微生物群落結構是動態平衡的。如果這種平衡被打破，病原菌數量激增，土傳病害就會發生。研究表明，改善土壤微生態平衡、改良微生物群落結構、提高微生物多樣性等措施對很多植物病害有防治作用。

6.粘細菌是土壤有機物代謝的重要參與者，在地球生物圈的物質循環中扮演著重要的角色。粘細菌能夠分泌豐富的胞外裂解酶類，降解土壤中的生物量和大分子有機物等，可以增加植物可吸收的有效養分，促進作物生長，減少農作物病蟲害發生，有利于發展生態有機農業。很多研究已經證明，施用堆肥或有機肥等改良土壤肥力的措施對植物病害具有良好的防治效果，是植物病害防治的研究方向之一。

然而，雖然具有重要生防潛力，但目前粘細菌在生物防治方面的研究和應用不多。在國內，尚無將粘細菌用于生物防治的報道。在國外，從上世紀70年代開始，陸續有人開展粘細菌防治植物病原微生物的研究。

1972年，hocking等發現，在平板實驗中，3株粘細菌都能不同程度地裂解分別屬于pythiumintermedium,rhizoctoniasolani,fusariumoxysporum和f.solani的6株植物病原真菌；盆栽實驗時，將這些粘細菌接種于栽培土中可以有效地減輕上述病原真菌引起的立枯病和病死率，還發現這些粘細菌在栽培土中定殖效應良好。1984年，geyer等將ustilagomaydis的擔孢子鋪在水瓊脂平板上，然后從玉米田土壤中誘導分離到兩種能產生捕食空斑的物種，一種是阿米巴原蟲，另一種即為粘細菌，這兩種物種同時也能夠在栽培土中控制u.maydis的數量。1984年，homma將rhizoctoniasolani的色素菌絲和cochliobolusmiyabeanus的分生孢子加入到土壤中，4周后發現這兩株真菌的繁殖體被裂解；在掃描電鏡下，病原真菌繁殖體上存在大量深淺不一的穿孔和蝕刻；從cochliobolusmiyabeanus的菌絲和分生孢子中分離到一株粘細菌polyangiumspp.，并證實該粘細菌能引起上述捕食和裂解現象。2001年，taylor等發現，相鄰接種時，粘細菌nannocystisexedens可以抑制aspergillusflavus和a.parasiticus等三株曲霉屬真菌；重疊接種時，粘細菌n.exedens則可以捕食和裂解這些真菌的孢子、發芽孢子、菌絲、菌核等。2002年，bull等發現所研究的6株粘細菌對8株植物病原真菌cylindrocarponspp.、fusariumoxysporumf.sp.apii、phytophthoracapsici、pythiumultimum、rhizoctoniaspp.、sclerotiniaminor、verticilliumalboatrum和v.dahliae均具有裂解和捕食效果。2006年，bull等又報道了采用粘細菌防治sclerotiniaminor引起的生菜菌核病。2011年，kim等發現一株粘細菌(myxococcus)能利用自身的捕食作用和其活性產物的拮抗作用雙重機制來防治三種致病菌botrytiscinerea,colletotrichumacutatum和pyriculariagrisea；盆栽試驗中，該粘細菌對辣椒炭疽病的防治效果顯著優于殺真菌藥物二噻農。2015年，dahm等從森林土壤中分離到30株粘細菌并測試了它們對森林主要病害真菌的防治效果，發現這些粘細菌裂解和抑制4種常見森林病害真菌rhizoctoniasolani、fusariumoxysporum、f.culmorum和cylindrocarpondestructans；盆栽實驗表明，其中一些粘細菌能保護苗木免于r.solani侵害，還證明這些粘細菌在盆栽土壤中具有良好的定殖能力。

目前，國內外對于粘細菌的生物防治作用研究不多，上述報道基本囊括了所有公開發表的論文。可以看出，某些粘細菌對多種植物病原真菌具有捕食和抑制作用，對這些病原真菌引起的植物病害也表現出防治作用。另外，作為抗逆性強的土壤土著菌，粘細菌用于土壤中表現出良好的定植能力。目前粘細菌防治植物病害的研究主要集中在植物病原真菌方面。這是因為真菌是最常見的植物病原微生物，真菌性病害約占植物病害的70-80％。事實上，粘細菌對細菌的捕食和拮抗效果更佳。因此，粘細菌防治植物細菌性病害的潛力值得期待，相關研究亟需加強。

技術實現要素：
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本發明提供了三株粘細菌myxococcussp.e-3-1，polyangiumsp.8#-3，cystobactersp.xj9-1在制備捕食和抑制植物病原細菌藥物中的應用。

本發明的粘細菌myxococcussp.e-3-1，其于2016年11月25日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(中國廣州市先烈中路一百號省微生物所實驗樓五樓)，其保藏號為：gdmccno.60120。

本發明的粘細菌polyangiumsp.8#-3，其于2016年11月25日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(中國廣州市先烈中路一百號省微生物所實驗樓五樓)，其保藏號為：gdmccno.60122。

本發明的粘細菌cystobactersp.xj9-1，其于2016年11月25日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(中國廣州市先烈中路一百號省微生物所實驗樓五樓)，其保藏號為：gdmccno.60121。

本發明通過實驗發現粘細菌myxococcussp.e-3-1，polyangiumsp.8#-3，cystobactersp.xj9-1能夠捕食多種植物病原細菌，還能夠產生抑制桃色歐文氏菌的活性天然產物。

因此，本發明提供了粘細菌myxococcussp.e-3-1，polyangiumsp.8#-3，cystobactersp.xj9-1在抑制桃色歐文氏菌及該菌導致的防治植物軟腐病方面的應用潛力。(將這三種粘細菌及其天然產物開發做抑制桃色歐文氏菌及該病原菌導致的植物軟腐病的生物農藥)。

本發明還提供了粘細菌myxococcussp.e-3-1，polyangiumsp.8#-3，cystobactersp.xj9-1在制備抑制桃色歐文氏菌的藥物中的應用。

本發明的粘細菌myxococcussp.e-3-1，polyangiumsp.8#-3，cystobactersp.xj9-1，它們一方面能捕食和裂解多種植物病原細菌，另一方面能產生抑制桃色歐文氏菌的活性天然產物，具有重要的應用價值。本發明的粘細菌myxococcussp.e-3-1，polyangiumsp.8#-3，cystobactersp.xj9-1可以在生物防治和藥物開發等方面的應用。

本發明的粘細菌myxococcussp.e-3-1其于2016年11月25日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(中國廣州市先烈中路一百號省微生物所實驗樓五樓)，其保藏號為：gdmccno.60120。

本發明的粘細菌polyangiumsp.8#-3其于2016年11月25日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(中國廣州市先烈中路一百號省微生物所實驗樓五樓)，其保藏號為：gdmccno.60122。

本發明的粘細菌cystobactersp.xj9-1其于2016年11月25日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(中國廣州市先烈中路一百號省微生物所實驗樓五樓)，其保藏號為：gdmccno.60121。

附圖說明

圖1是myxococcussp.e-3-1對植物病原細菌的捕食效果；

圖2是polyangiumsp.8#-3對植物病原細菌的捕食效果；

圖3是cystobactersp.xj9-1對植物病原細菌的捕食效果。

具體實施方式：

以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。

實施例1：

本發明的粘細菌myxococcussp.e-3-1、polyangiumsp.8#-3來源于新疆阿克蘇鹽堿地土壤。

本發明的粘細菌cystobactersp.xj9-1來源于越南潭道國家公園內原始森林土樣。

實施例2：

分別接種粘細菌myxococcussp.e-3-1，polyangiumsp.8#-3，cystobactersp.xj9-1到cye培養液(10mmmops，10g/l酪蛋白胨，5g/l酵母提取物，8mmmgso4，溶劑為水，ph7.6)，150rpm、30℃培養3d，而后用mmc緩沖液(10mmmops，4mmmgso4，2mmcacl2，溶劑為水，ph7.6)沖洗稀釋至1×10¹¹cell/ml，得到粘細菌菌液。

分別接種各植物病原細菌(rhizobiumradiobactergim1.274，pseudomonassyringaegim1.330，acidovoraxavenaesubspavenaejcm20985，rhodococcusfasciansnbrc12155，burkholderiacepaciagim1.450，curtobacteriumflaccumfaciensgim1.343，erwiniapersicinagim1.331，arthrobacterilicisjcm12267，erwiniachrysanthemigimt1.178，pantoeastewartiisubsp.stewartiilmg2715，ralstoniasolanacearumgim1.70，rhizobacterdaucidsm11587，sphingomonassuberifaciensjcm8521，xanthomonascampestrisjcm20466，xylellafastidiosasubsp.fastidiosalmg17159，streptomycesscabieijcm7914，bacillusmegateriumgim1.270，clavibactermichiganensisjcm1370)到na培養基中，150rpm、30℃培養到對數期，而后用mmc緩沖液沖洗稀釋至1×10⁹cell/ml，得到植物病原細菌菌液。本試驗所用植物病原細菌見表1。

將20μl植物病原細菌菌液滴到cfl固體培養基(10mmmops，ph7.6，1mmkh2po4，8mmmgso4，0.2g/l(nh4)2so4,0.2g/l檸檬酸鈉，0.2g/l丙酮酸鈉，0.1g/l酪胨，15g/l瓊脂，溶劑為水)上，待干燥后，在其邊緣處滴加1μl粘細菌墨汁混合液(粘細菌菌液與墨汁按體積比2：1混勻)，使兩個菌落邊緣相距約3mm。將平板置于30℃培養，3、5、7、9d后觀察捕食現象。結果如圖1、2、3所示，從圖1-3可以看出，myxococcussp.e-3-1能夠捕食rhizobiumradiobactergim1.274，pseudomonassyringaegim1.330，acidovoraxavenaesubspavenaejcm20985，rhodococcusfasciansnbrc12155，burkholderiacepaciagim1.450，curtobacteriumflaccumfaciensgim1.343，erwiniapersicinagim1.331，arthrobacterilicisjcm12267，erwiniachrysanthemigimt1.178，pantoeastewartiisubsp.stewartiilmg2715，ralstoniasolanacearumgim1.70，rhizobacterdaucidsm11587，sphingomonassuberifaciensjcm8521，xanthomonascampestrisjcm20466，xylellafastidiosasubsp.fastidiosalmg17159，streptomycesscabieijcm7914，bacillusmegateriumgim1.270，clavibactermichiganensisjcm1370；polyangiumsp.8#-3能夠捕食rhizobiumradiobactergim1.274，pseudomonassyringaegim1.330，acidovoraxavenaesubspavenaejcm20985，rhodococcusfasciansnbrc12155，curtobacteriumflaccumfaciensgim1.343，arthrobacterilicisjcm12267，erwiniachrysanthemigimt1.178，pantoeastewartiisubsp.stewartiilmg2715，ralstoniasolanacearumgim1.70，rhizobacterdaucidsm11587，sphingomonassuberifaciensjcm8521，xanthomonascampestrisjcm20466，xylellafastidiosasubsp.fastidiosalmg17159，streptomycesscabieijcm7914，bacillusmegateriumgim1.270，clavibactermichiganensisjcm1370；cystobactersp.xj9-1能夠捕食rhizobiumradiobactergim1.274，pseudomonassyringaegim1.330，acidovoraxavenaesubspavenaejcm20985，rhodococcusfasciansnbrc12155，curtobacteriumflaccumfaciensgim1.343，erwiniapersicinagim1.331，arthrobacterilicisjcm12267，erwiniachrysanthemigimt1.178，pantoeastewartiisubsp.stewartiilmg2715，ralstoniasolanacearumgim1.70，rhizobacterdaucidsm11587，sphingomonassuberifaciensjcm8521，xanthomonascampestrisjcm20466，xylellafastidiosasubsp.fastidiosalmg17159，streptomycesscabieijcm7914，bacillusmegateriumgim1.270，clavibactermichiganensisjcm1370；。

表1植物病原細菌及誘發的病害

實施例2：粘細菌的代謝產物對植物病原細菌(桃色歐文氏菌)的抑制作用研究

在vy/2培養基(5g安琪活性酵母，加水煮沸10min，待冷卻后加入1gmgso4,1gcacl2，調ph至7.4，定容至1l，高溫濕熱滅菌，使用前加入0.5mg維生素b12)中分別接種三株粘細菌myxococcussp.gime-3-1，polyangiumsp.8#-3和cystobactersp.xj9-1，150rpm，30℃培養7d，4000rpm離心，分別收集菌體和發酵液上清。發酵液用等體積的乙酸乙酯萃取12h，萃取液旋轉蒸發后，用甲醇溶解萃取物，得到發酵液萃取物。菌體用丙酮浸泡后超聲破碎，然后用乙酸乙酯萃取12h，萃取液旋轉蒸發后，用甲醇溶解萃取物，得到菌體破碎液萃取物。發酵液萃取物和菌體破碎液萃取物用甲醇分別溶解成50mg/ml和100mg/ml濃度。接種植物病原細菌到na液體培養基150rpm，30℃培養到對數期。將對數期的植物病原細菌(桃色歐文氏菌)溶液按體積比1:100比例與50℃左右的na瓊脂培養基(液體狀態)混合，搖勻后每個平皿加20ml。在平板上粘附已滴加5μl不同濃度的發酵液萃取物溶液或菌體破碎液萃取物溶液的6mm直徑濾紙片。37℃培養24～36h后測定抑菌圈直徑。三株粘細菌粗提物對桃色歐文氏菌的抑制效果見表1。

表1.三株粘細菌粗提物對桃色歐文氏菌的抑菌圈直徑